Fluorescenza a raggi X (XRF)

Fonte: Laboratorio della Dott.ssa Lydia Finney — Argonne National Laboratory

La fluorescenza a raggi X è una radiazione indotta ed emessa che può essere utilizzata per generare informazioni spettroscopiche. La microscopia a fluorescenza a raggi X è una tecnica di imaging non distruttiva che utilizza l'emissione di fluorescenza indotta dei metalli per identificare e quantificare la loro distribuzione spaziale.

In primo luogo, devono essere preparati campioni sottili, piatti e asciutti (a meno che non sia disponibile uno speciale stadio criogenico per il microscopio). Successivamente, un fascio di raggi X monocromatico focalizzato viene scansionato raster attraverso il campione. Il fascio di raggi X supera l'energia di legame di alcuni degli elettroni del guscio interno agli atomi metallici, e quando gli elettroni del guscio esterno cadono in quei posti vacanti, una seconda radiografia viene emessa dal campione. In ogni punto di questa scansione raster, uno spettro di emissione di fluorescenza a raggi X viene raccolto dal rivelatore.

In questo spettro, viene registrata la lunghezza d'onda e l'intensità di tutti i raggi X emessi dal campione. In base all'energia caratteristica (dovuta alla spaziatura degli orbitali nell'atomo) della fluorescenza emessa e all'intensità relativa caratteristica dei picchi K_α e K_β (ad esempio, che sono entrambi noti), lo spettro di emissione può essere utilizzato per determinare sia l'identità dei metalli presenti che la quantità.

Questo video spiegherà il processo di preparazione di un campione sottile e secco di cellule aderenti adatte per l'imaging a fluorescenza. Il processo di scansione dei campioni verrà spiegato brevemente e verrà descritta un'immagine di esempio.

1. Preparazione delle finestre in nitruro di silicio

1. Usa una pinzetta inversa per raccogliere una finestra (le finestre in nitruro di silicio si frantumano se cadono).
2. Posiziona la finestra su una diapositiva di vetro, lato piatto verso l'alto.
3. Aderisci a piccoli pezzi di scotch ai lati della finestra e usali per far aderire le finestre sul fondo del piatto di cultura.
4. Sterilizzare le finestre nei piatti di coltura con radiazioni UV. Ciò può essere ottenuto con l'impostazione di reticolazione automatica su un armadio di reticolazione UV, seguita da un'ulteriore irradiazione UV sotto la lampada UV nella cappa a flusso laminare per circa 1 ora.

2. Placcatura delle celle sulle finestre sterilizzate in nitruro di silicio

1. Tenere il piatto con esso inclinato di circa 45 °.
2. Aggiungere il supporto mediante pipettaggio verso il lato del piatto e alleviare lentamente l'angolo di inclinazione per rivestire la finestra con il supporto.
3. Aggiungi le cellule al piatto di coltura, allo stesso modo, e incuba.
4. Osservare le cellule di tanto in tanto usando un microscopio ottico per determinare quando sono pronte per l'uso.

3. Fissazione e asciugatura delle cellule

1. In una cappa a flusso laminare, rimuovere il supporto mediante aspirazione delicata mentre si inclina il piatto come descritto sopra.
2. Aggiungere PBS, pipettare verso il lato del piatto tenendolo ad angolo. Alleviare lentamente l'angolo di inclinazione per rivestire la finestra con PBS.
3. Rimuovere il PBS con un'aspirazione delicata.
4. Pipettando verso il lato del piatto e tenendolo ad angolo, aggiungere il 4% di PFA / PBS, pH 7 per coprire le cellule. Conservare in questa soluzione per 20 minuti a temperatura ambiente.
5. Rimuovere la miscela PFA/PBS e smaltire come materiale pericoloso.
6. Aggiungere PBS, pipettaggio come descritto sopra.
7. Ripetere due volte i passaggi 3.5 e 3.6.
8. Rimuovere il PBS mediante aspirazione delicata.
9. Aggiungere 20 mM PIPES, 200 mM saccarosio, pH 7.
10. Rimuovere i TUBI/saccarosio mediante delicata aspirazione.
11. Ripetere due volte i passaggi 2.8 e 2.9.
12. Tamponare rapidamente i bordi e la rientranza posteriore della finestra con un Kimwipe, quindi impostare la finestra su una superficie pulita, come un tappetino griglia di gomma, per asciugare.

4. Imaging a fluorescenza a raggi X delle cellule

1. Una volta che il campione è asciutto, verificare la presenza di cellule sulle finestre utilizzando un microscopio ottico.
2. Utilizzare lo smalto per fissare le finestre a un supporto in alluminio fornito dalla beamline.
3. Inserire il supporto in alluminio in un supporto cinematico, quindi posizionarlo in posizione nel punto focale dell'ottica nel microscopio a raggi X e con un angolo di circa 45 ° rispetto al fascio di raggi X incidente, montato sugli stadi di nanoposizionamento del campione.
4. Uscire dall'area dello strumento del microscopio a raggi X (di solito una gabbia fatta di pareti di piombo) e aprire l'otturatore. Eseguire i passaggi rimanenti da remoto.
5. Utilizzando una piastra di zona o specchi Kirkpatrick-Baez, focalizzare il fascio di raggi X monocromatico (di solito 10 keV di energia) fino a una dimensione dello spot sub-micron.
6. Utilizzando gli stadi del campione di nanoposizionamento e visualizzando la posizione del fascio di raggi X sul campione con una telecamera scintillatore a valle pre-calibrata, determinare la larghezza e l'altezza appropriate della scansione raster per acquisire i dati del campione.
7. Con il rivelatore di deriva del silicio dispersivo a 90 ° dal fascio incidente e a circa 3 mm o meno dal campione, raccogliere uno spettro di prova con un tempo di permanenza di 1-2 secondi.
8. Visualizzando lo spettro di prova, scegliere un tempo di permanenza appropriato per la scansione, per fornire un segnale-rumore sufficiente per gli elementi di interesse.
9. Scegliere una risoluzione appropriata per la scansione, che non sia significativamente più piccola della dimensione dello spot del fascio sul campione, né più grande delle caratteristiche di interesse nel campione.
10. Programmare la scansione nel software di scansione e raccogliere l'immagine.

La mappa di fluorescenza a raggi X di una cellula aderente è mostrata nella Figura 1. Ogni pannello mostra la distribuzione di un particolare elemento (ad esempio, rame, ferro, zinco, ecc.) sulla cella. Il pannello etichettato "s_a" mostra l'assorbimento dei raggi X.

Figura 1. Mappa di fluorescenza a raggi X di una cellula aderente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'imaging a fluorescenza a raggi X può essere uno strumento utile in molti campi tra cui geoscienze, scienze forensi, scienza dei materiali, biologia e persino nello studio del nostro patrimonio culturale. Nella scienza dei materiali, può aiutare a trovare difetti in chip e catalizzatori realizzati con metalli. Nel lavoro sul patrimonio culturale, è stato utilizzato per identificare metalli velenosi nei capelli di famosi morti (ad esempio, Beethoven) e per identificare la fonte di vernici utilizzate nell'arte. In biologia, è usato per studiare i metalli naturali che eseguono importanti biochimiche. Nelle geoscienze, è spesso usato per studiare gli eventi raccontati nel record rock. Due caratteristiche particolari che rendono l'imaging a fluorescenza a raggi X utile in così tanti campi sono 1) il suo non distruttivo, così tanti oggetti rari o di alto valore possono essere ripresi, e 2) mentre la preparazione del campione qui descritta per le cellule è complessa - perché le cellule devono essere essiccate - per molti materiali come rocce, arte o altri oggetti, c'è pochissima preparazione del campione richiesta, a parte il fatto che dovrebbe essere piatto e privo di polvere. Sebbene sia necessario un sincrotrone a cui è meglio accedere attraverso la collaborazione con gli scienziati di queste strutture, la tecnica può essere molto accessibile.