Microscopia elettronica a scansione (SEM)

Fonte: Laboratorio del Dr. Andrew J. Steckl — Università di Cincinnati

Un microscopio elettronico a scansione, o SEM, è un potente microscopio che utilizza gli elettroni per formare un'immagine. Consente l'imaging di campioni conduttivi a ingrandimenti che non possono essere raggiunti utilizzando microscopi tradizionali. I moderni microscopi otrici possono raggiungere un ingrandimento di ~ 1.000X, mentre il tipico SEM può raggiungere ingrandimenti di oltre 30.000X. Poiché il SEM non utilizza la luce per creare immagini, le immagini risultanti che forma sono in bianco e nero.

I campioni conduttivi vengono caricati sullo stadio campione del SEM. Una volta che la camera del campione raggiunge il vuoto, l'utente procederà ad allineare la pistola elettronica nel sistema alla posizione corretta. La pistola elettronica spara un fascio di elettroni ad alta energia, che viaggiano attraverso una combinazione di lenti e aperture e alla fine colpiscono il campione. Mentre la pistola elettronica continua a sparare elettroni in una posizione precisa sul campione, gli elettroni secondari rimbalzeranno dal campione. Questi elettroni secondari sono identificati dal rivelatore. Il segnale trovato dagli elettroni secondari viene amplificato e inviato al monitor, creando un'immagine 3D. Questo video dimostrerà la preparazione, il funzionamento e le capacità di imaging dei campioni SEM.

Gli elettroni sono generati dal riscaldamento dalla pistola elettronica, che agisce come un catodo. Questi elettroni sono spinti verso l'anodo, nella stessa direzione del campione, a causa di un forte campo elettrico. Dopo che il fascio di elettroni è condensato, entra nella lente dell'obiettivo, che viene calibrata dall'utente in una posizione fissa sul campione. (Figura 1)

Una volta che gli elettroni colpiscono il campione conduttivo, possono accadere due cose. In primo luogo, gli elettroni primari che colpiscono il campione attraverseranno il campione fino a una profondità che dipende dal livello di energia di quegli elettroni. Quindi, gli elettroni secondari e retrodifati colpiranno il campione e si rifletteranno verso l'esterno da esso. Questi elettroni riflessi vengono quindi misurati dal rivelatore di elettroni secondari (SE) o retrodifati (BS). Dopo l'elaborazione del segnale, sullo schermo si forma un'immagine del campione. ¹

In modalità SE, gli elettroni secondari sono attratti da bias positivi sulla parte anteriore del rivelatore a causa della loro bassa energia. L'intensità del segnale varia a seconda dell'angolo del campione. Pertanto, la modalità SE fornisce immagini altamente topografiche. D'altra parte, in modalità BS, la direzione degli elettroni è quasi direttamente opposta alla direzione dell'e-beam e l'intensità di rilevamento è proporzionale al numero atomico del campione. Pertanto, è meno topografico, ma utile per le immagini compositime. La modalità BS è anche meno influenzata dall'effetto di carica sul campione, che è vantaggioso per i campioni non conduttivi. ¹

Figura 1. Schema del SEM.

1. Preparazione del campione

1. Posizionare il campione sullo stub del campione. Se necessario, il nastro di carbonio può essere utilizzato per incollare adesivamente il campione al mozzicone.
2. Posizionare il campione in un sistema di sputtering dorato. Utilizzando un mini-gold sputter, sputter gold per 30 s a ~ 70 mTorr di pressione. Potrebbe essere necessario uno spessore dello strato d'oro diverso a seconda della geometria del campione. Una superficie più ruvida o porosa richiede un tempo di sputtering più lungo.
3. Rimuovere lo stub dal sistema di sputtering dorato.

2. Inserimento del campione e avvio SEM

1. Sfiatare la camera SEM, consentendo alla camera di raggiungere la pressione nominale.
2. Aprire il compartimento del campione SEM ed eseguare lo stadio del campione.
3. Inserire lo stub campione contenente il campione sullo stage. Stringere il mozzicone in posizione.
4. Se la distanza z non può essere controllata dal software, assicurarsi che lo stadio campione con stub campione abbia l'altezza corretta per ottenere l'immagine migliore.
5. Mettere lo stadio del campione nella camera del campione. Chiudere il compartimento del campione.
6. Accendere le pompe e consentire al sistema di raggiungere il vuoto. Il sistema avviserà l'utente quando questo è completato.
7. Aprire il software SEM. Selezionare la tensione di funzionamento desiderata da 1 a 30 kV. Una tensione di funzionamento più elevata offre un migliore contrasto dell'immagine, ma può produrre una risoluzione inferiore se le cariche si accumulano nel campione.

3. Acquisizione dell'immagine SEM

1. Inizia "Messa a fuoco automatica" nel software SEM facendo clic sull'icona della chiave. Questo acquisirà un'immagine focalizzata del campione da utilizzare come punto di partenza.
2. Assicurarsi che l'ingrandimento sia impostato sul livello minimo di zoom di 50X.
3. Seleziona la modalità "scansione veloce".
4. Regolare la messa a fuoco in modalità grossolana fino a quando non viene acquisita una messa a fuoco approssimativa.
5. Regolare manualmente lo stage utilizzando le manopole esterne in modo che la regione di interesse sia visibile sul display.
6. Aumentare il livello di ingrandimento fino a quando non viene osservata la caratteristica desiderata. Regolare la manopola di messa a fuoco grossolana per mettere a fuoco approssimativamente l'immagine a questo ingrandimento. Quindi, migliora la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco fine per ottenere un'immagine focalizzata al livello di ingrandimento desiderato. Questo passaggio verrà ripetuto ogni volta che il livello di ingrandimento viene aumentato.
7. Una volta raggiunto l'ingrandimento desiderato, regolare la manopola di messa a fuoco fine per migliorare la chiarezza.
8. Per ottimizzare la nitidezza dell'immagine, aumentare l'ingrandimento vicino al livello massimo e quindi mettere a fuoco l'immagine utilizzando la manopola di messa a fuoco fine. Se non è possibile ottenere un'immagine chiara, regolare la stigmatizzazione sia nella direzione x che in quella y. Continua a regolare la messa a fuoco e le stigmi fino a ottenere l'immagine più chiara a livello di ingrandimento esagerato.
9. Dopo aver raggiunto un'immagine di qualità del campione, tornare al livello di ingrandimento desiderato. L'immagine può essere scattata premendo il pulsante della foto in modalità "foto lenta" o "foto veloce". La modalità "foto lenta" offre una migliore qualità e un'alta risoluzione dell'immagine.

4. Effettuare misurazioni utilizzando il software SEM

1. Nell'elenco a discesa "Pannelli", seleziona "M. Strumenti".
2. Varie misure come lunghezza, area e angolo possono essere misurate direttamente nel software SEM. Per eseguire una di queste misurazioni, fare clic sull'icona desiderata nella finestra M. Strumenti.
3. Scorri fino al sito di misurazione sull'immagine SEM. Le misurazioni vengono effettuate cliccando sull'immagine per creare dei punti di riferimento che verranno analizzati dal software. I punti dati misurati possono essere inseriti direttamente sull'immagine se lo desiderano l'utente.
4. Le immagini vengono quindi salvate sul computer.

Il SEM, visto nella Figura 2a, è stato utilizzato per effettuare misurazioni e acquisire foto campione. Il campione era costituito da sale di cloruro di sodio (NaCl). È stato posizionato sullo stub come si vede nella Figura 2b, poi alcuni nanometri d'oro sono stati sputtered su di esso per renderlo conduttivo. Il campione conduttivo è stato quindi inserito nell'area del campione SEM come si vede nella Figura 2c.

Le immagini SEM sono state ottenute a livelli di ingrandimento 50X, 200X, 500X, 1.000X e 5.000X, come si vede nella Figura 3. La Figura 3a mostra una vista a volo d'uccello del campione di sale con ingrandimento 50X. La Figura 3b ingrandisce quindi una singola particella salina con un ingrandimento di 200X. La Figura 3c mostra lo stesso livello di ingrandimento, ma include misurazioni di area e diametro effettuate all'interno del software SEM. La figura 3d quindi esegue lo zoom a 500X, mostrando l'area di interesse sulla particella salina. La Figura 3e mostra un ingrandimento di 1.000X, che consente di osservare l'angolo della particella salina che è stata danneggiata. La Figura 3f mostra un ingrandimento di 5.000X, consentendo all'utente di visualizzare la struttura della particella salina.

Figura 2. (a) Immagine di SEM. (b) Sale NaCl posto sul campione di stub con nastro di carbonio. c) Campione di stub posto nella fase di campionamento SEM dopo essere stato trattato con rivestimento in oro.

Figura 3. Immagini SEM del campione a vari livelli di ingrandimento: (a) 50X, (b) 200X, (c) 200X con misurazioni, (d) 500X, (e) 1.000X e (f) 5.000X.

Il SEM è uno strumento molto potente che è comune nella maggior parte degli istituti di ricerca a causa della sua capacità di immaginare qualsiasi oggetto che è conduttivo o è stato trattato con un rivestimento conduttivo. Il SEM è stato utilizzato per l'immagine di oggetti come dispositivi a semiconduttore,² membrane biologiche,³ e insetti,⁴ tra gli altri. Abbiamo anche utilizzato il SEM per analizzare nanofibre e materiali a base di carta, biomateriali, strutture micropatterned. Naturalmente, ci sono materiali, come i liquidi, che non possono essere inseriti in un SEM standard per l'imaging, ma lo sviluppo continuo di microscopi elettronici a scansione ambientale (ESEM) consente tale funzionalità. ESEM è simile a SEM in quanto utilizza una pistola elettronica e analizza l'interazione elettronica con il campione. La differenza principale è che l'ESEM è diviso in due camere separate. La camera superiore è costituita dalla pistola elettronica e va in uno stato di alto vuoto, mentre la camera inferiore contiene il campione ed entra in uno stato di alta pressione. Poiché l'area del campione non ha bisogno di entrare nel vuoto, è possibile utilizzare campioni umidi o biologici durante il processo di imaging. Un altro vantaggio dell'ESEM è che il campione non ha bisogno di essere rivestito con un materiale conduttivo. Tuttavia, ESEM presenta alcuni svantaggi di basso contrasto dell'immagine e piccola distanza di lavoro a causa dell'ambiente gassoso nella camera del campione. . La regola generale è che se si è in grado di rivestire un campione con uno strato conduttivo, allora può essere ripreso in un SEM, consentendo di analizzare quasi tutti gli oggetti solidi.

1. Goldstein, J., Newbury, D., Joy, D., Lyman, C., Echlin, P., Lifshin, E., Sawyer, L., Michael, J. Scanning Electron Microscopy and X-ray Microanalysis. 3^rd Ed. Springer, New York, NY. (2003).
2. Purandare, S., Gomez, E.F., Steckl, A.J. High brightness phosphorescent organic light emitting diodes on transparent and flexible cellulose films. Nanotechnology. 25, 094012 (2014).
3. Masuda, Y., Yamanaka, N., Ishikawa, A., Kataoka, M., Aral, T., Wakamatsu, K., Kuwahara, N., Nagahama, K., Ichikawa, K., Shimizu, A. Glomerular basement membrane injuries in IgA nephropathy evaluated by double immunostaining for a5(IV) and a2(IV) chains of type IV collagen and low-vacuum scanning electron microscopy. Clinical and Experimental Nephrology. 1-9. (2014).
4. Kang, J.H., Lee, Y.J., Oh, B.K., Lee, S.K. Hyun, B.R. Lee, B.W, Choi, Y.G., Nam, K.S., Lim, J.D. Microstructure of the water spider (Argyroneta aquatic) using the scanning electron microscope Journal of Asia-Pacific Biodiversity. 7 484-488 (2014).

Nessun conflitto di interessi dichiarato.