Cromatografia a scambio ionico

Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton - Università della Virginia

La cromatografia a scambio ionico è un tipo di cromatografia che separa gli analiti in base alla carica. Viene utilizzata una colonna che viene riempita con una fase stazionaria carica su un supporto solido, chiamata resina a scambio ionico. La cromatografia a forte scambio cationico separa preferenzialmente i cationi utilizzando una resina caricata negativamente, mentre la cromatografia a scambio anionico forte seleziona preferenzialmente gli anioni utilizzando una resina caricata positivamente. Questo tipo di cromatografia è popolare per la preparazione del campione, ad esempio nella pulizia di proteine o campioni di acido nucleico.

La cromatografia a scambio ionico è un processo in due fasi. Nel primo passaggio, l'esempio viene caricato nella colonna in un buffer di caricamento. Il legame del campione caricato alla resina della colonna si basa sulle interazioni ioniche della resina per attirare il campione della carica opposta. Pertanto, i campioni carichi di polarità opposta alla resina sono fortemente legati. Altre molecole che non sono cariche o sono di carica opposta non sono legate e vengono lavate attraverso la colonna. Il secondo passo è quello di eluire l'analita che è legato alla resina. Questo si ottiene con un gradiente salino, in cui la quantità di sale nel buffer viene lentamente aumentata. Le frazioni vengono raccolte alla fine della colonna quando si verifica l'eluizione e il campione purificato di interesse può essere recuperato in una di queste frazioni. Un'altra tecnica, come la spettroscopia, potrebbe essere necessaria per identificare quale frazione contiene il campione. La cromatografia a scambio ionico è particolarmente utile negli studi sulle proteine, per isolare proteine di interesse che hanno una carica o una dimensione specifica, in quanto le dimensioni possono determinare il numero di interazioni con la resina.

La cromatografia a scambio ionico è una tecnica di separazione più generale rispetto alla cromatografia di affinità, che viene spesso utilizzata anche nella preparazione di campioni proteici, in cui un anticorpo è attaccato a una colonna per legare un analita specifico. Per ogni analita deve essere acquistata una nuova colonna di affinità, mentre lo stesso tipo di colonna a scambio ionico, spesso con condizioni di eluizione diverse, può essere utilizzato per ripulire molte proteine della stessa carica. La cromatografia a scambio ionico può anche essere utilizzata in combinazione con altri tipi di cromatografia che si separano in base ad altre proprietà. Ad esempio, la cromatografia ad esclusione dimensionale si separa in base alle dimensioni e potrebbe essere utilizzata prima della cromatografia a scambio ionico per scegliere composti di una determinata dimensione.

La cromatografia a scambio ionico è governata dai principi delle interazioni chimiche ioniche che portano all'adsorbimento reversibile dell'analita sulla fase stazionaria. La forza del legame tra il campione e il supporto solido è governata dal numero e dai tipi di gruppi funzionali sul campione e sulla resina. Il tampone di carico ha generalmente una bassa conduttività al fine di promuovere le interazioni tra il campione e la resina. Le resine a scambio cationico forte presentano tipicamente gruppi funzionali di acido solfonico mentre le resine a scambio cationico debole hanno acidi carbossilici. Le forti resine a scambio anionico contengono ammine quaternarie mentre le resine a scambio anionico deboli presentano ammine secondarie o terziarie. I termini forte e debole si riferiscono alle proprietà acido/base del materiale della colonna e non a quanto bene lega un analita. Le resine deboli vengono caricate su un intervallo di pH più piccolo rispetto alle resine forti, ma legano comunque gli analeti in modo molto efficace e potrebbero essere una buona scelta se vengono caricate nell'intervallo di pH necessario. Prima dell'uso, le colonne a scambio ionico vengono bilanciate a un pH utilizzando un tampone di equilibrio.

Per eluire il campione di interesse, viene utilizzato un gradiente salino. I campioni che sono meno strettamente legati alla resina eluiranno per primi, poiché il sale disturberà più facilmente il loro legame ionico alla colonna. I campioni che sono più strettamente legati si eluiranno in seguito, quando vengono utilizzate quantità più elevate di sale. Tipicamente, viene utilizzato un gradiente lineare di sale, in cui la concentrazione di sale aumenta nel tempo in modo lineare. Tuttavia, i gradienti di passo possono essere utilizzati anche dove la concentrazione di sale viene intensificata nel tempo.

Una considerazione importante per gli esperimenti a scambio ionico è il pH dei tamponi. Il pH deve essere mantenuto in modo che l'analita di interesse sia caricato e si leghi alla resina. Per le proteine, la carica si basa sul punto isoelettrico della proteina, dove la proteina è caricata in modo neutro e misurata come pI. Il pH rispetto alla proteina pI fornisce informazioni sulla carica proteica prevista. Nella cromatografia a scambio cationico, l'innalzamento del pH farà sì che l'analita sia meno carico positivamente e meno probabilità di interagire con la resina caricata negativamente. Allo stesso modo, nella cromatografia a scambio anionico, l'abbassamento del pH farà sì che l'analita sia meno caricato negativamente e meno probabilità di interagire con la resina caricata positivamente. Pertanto, le regolazioni del pH possono essere utilizzate anche per eluire selettivamente gli analiti dalla colonna. L'uso di regolazioni del pH al posto dei sali potrebbe essere vantaggioso per separare due diversi tipi di proteine con diversi valori di pI.

1. Preparazione del campione e della colonna

1. In questa dimostrazione, una miscela di 2 proteine sarà separata su una colonna a scambio cationico: emoglobina e citocromo C. Aggiungere 0,2 mL di tampone di equilibrio (pH 8,1) al campione proteico e vortice per mescolare accuratamente. Centrifugare per 2 minuti per rimuovere qualsiasi schiuma.
2. Posizionare la colonna di scambio cationico in una provetta per 5 minuti per consentire alla resina di depositarsi. Bloccare la provetta con la colonna su un supporto ad anello per assicurarsi che sia in posizione verticale.
3. Aprire il cappuccio superiore della colonna e quindi il cappuccio inferiore. Lasciare che il tampone nella colonna goccioli sotto gravità nella provetta.
4. Lavare la colonna due volte con un volume di colonna (in questo caso il volume della colonna è di 0,3 ml) di tampone di equilibrio. Lasciare che il primo volume di colonna (0,3 mL) del tampone di equilibratura goccioli nel flaconcino di scarico prima di aggiungere il secondo volume di colonna. Questo passaggio consente alla colonna di equilibrarsi con il buffer di bilanciamento. Aggiungere lentamente il tampone di equilibrio in questo passaggio per non disturbare la resina.

2. Esecuzione di un campione proteico attraverso una colonna a scambio cationico

1. Inserire la colonna in un tubo centrifugo da 2 ml con l'etichetta "Unbound 1". Caricare con attenzione 0,1 ml del campione proteico sulla parte superiore della colonna.
2. Una volta che il campione è stato caricato sulla parte superiore della colonna, lavarlo con 0,3 ml di tampone di equilibrio aggiungendo il tampone nella parte superiore della colonna e lasciandolo gocciolare fino in fondo. Ripetere questo passaggio 4 volte (per un totale di 5 lavaggi) e raccogliere ogni lavaggio in un tubo centrifugo separato da 2 ml. Etichettare i tubi come "Unbound 1-5".
3. Per gli ultimi 2 lavaggi, centrifugare per 10 s a 1.000 x g per assicurarsi che tutte le specie non legate si staccano dalla colonna. Qualsiasi campione che si lega alla colonna non deve essere in questi lavaggi, ma il campione che non si lega si laverà senza essere trattenuto. La centrifugazione fornisce più forza per lavare i materiali non legati dalla colonna.
4. Inserire la colonna in un nuovo tubo di raccolta centrifuga da 2 ml etichettato "Bound 1". Mettere 0,3 mL di tampone di eluizione (sale alto, pH 5,5) sulla parte superiore della colonna. Centrifugare l'eluente risultante per 10 s a 1.000 x g.
5. Ripetere la fase di eluizione altre 2 volte posizionando la colonna in un nuovo tubo della centrifuga, aggiungendo 0,3 ml e centrifugando per 10 s. Etichetta questi "Bound 2 e 3".
6. Registrare eventuali cambiamenti di colore o osservazioni sulle frazioni. L'emoglobina è una proteina colorata che sembra bruno-rossastra mentre il citocromo C è di colore rossastro.

3. Risultati: Scambio cationico di emoglobina e citocromo C

1. Il citocromo C ha un pI di 10,5 e l'emoglobina un pI di 6,8. Pertanto, quando viene utilizzato un tampone di equilibrio pH 8,1, l'emoglobina non si lega alla colonna perché è caricata negativamente. Il citocromo C è caricato positivamente a questo pH e si lega alla colonna perché il pH < pI.
2. L'emoglobina è osservata nelle frazioni non legate perché non è legata alla colonna.
3. Il citocromo C è osservato in frazioni legate, perché era legato alla colonna di scambio cationico.

Figura 1. Immagine della frazione non legata (emoglobina) e della frazione legata (citocromo C).

La cromatografia a scambio ionico è ampiamente utilizzata in biochimica per isolare e purificare campioni di proteine. Le proteine hanno molti amminoacidi con gruppi funzionali che sono carichi. Le proteine vengono separate in base alla carica netta, che dipende dal pH. Alcune proteine sono caricate più positivamente mentre altre sono più caricate negativamente. Inoltre, i tag peptidici possono essere aggiunti geneticamente a una proteina per darle un punto isoelettrico che non è nella gamma delle proteine normali, rendendo possibile separarsi completamente. La cromatografia a scambio ionico è utile per separare complessi proteici multimerici, in quanto diverse configurazioni avrebbero diverse quantità di carica e diverse interazioni.

Un'altra importante applicazione della cromatografia a scambio ionico è l'analisi dell'acqua. La cromatografia a scambio anionico può essere utilizzata per misurare la concentrazione di anioni, inclusi solfati, nitrati, nitriti, fluoruro e cloruro. La cromatografia a scambio cationico viene utilizzata per misurare la concentrazione di cationi come sodio, potassio, calcio e magnesio. Un tipo di cromatografia a scambio ionico viene utilizzato anche nella purificazione dell'acqua, poiché la maggior parte degli addolcitori d'acqua filtra gli ioni magnesio e calcio in acqua dura legandoli a una resina, che rilascia sodio legato. I metalli pesanti, come il rame o il piombo, possono anche essere rimossi dall'acqua utilizzando la cromatografia a scambio ionico.

La cromatografia a scambio ionico è utile anche nella purificazione dei metalli. Può essere usato per purificare gli attinidi, come il plutonio, e rimuoverlo dalle barre di combustibile del reattore nucleare esaurito. Può anche essere usato per eliminare l'uranio e rimuoverlo dall'acqua o da altri campioni ambientali.