Fluorescencia de rayos x (XRF)

Fuente: Laboratorio del Dr. Lydia Finney, laboratorio nacional de Argonne

Fluorescencia de rayos x es una radiación inducida, emitida que puede utilizarse para generar la información espectroscópica. Microscopía de fluorescencia de rayos x es una técnica no destructiva que utiliza la emisión de fluorescencia inducida de metales para identificar y cuantificar su distribución espacial.

En primer lugar, deben prepararse las muestras que son fino, plano y seco (a menos que una etapa criogénica especial está disponible para el microscopio). A continuación, un concentrado haz de rayos x monocromático es raster escaneados a través de la muestra. El haz de rayos x supera la energía de enlace de algunos de los electrones de la cáscara interna a los átomos de metal, y cuando caen los electrones de la cáscara externa en las vacantes, la muestra emite una segunda radiografía. En cada punto de este raster-scan, un espectro de emisión de fluorescencia de rayos x son recogido por el detector.

En este espectro, se registra la longitud de onda y la intensidad de todos los rayos x emitidos por la muestra. Basado en la energía característica (debido a la separación de las órbitas en el átomo) de la fluorescencia emitida y la característica intensidad relativa de K_α y K_β picos (por ejemplo, que ambos conocen), el espectro de emisión puede utilizarse para determinar la identidad de los metales presentes y la cantidad.

Este video le explicará el proceso de preparación de una muestra delgada y seca de células adherentes adecuadas para imágenes de fluorescencia. Se explicará brevemente el proceso de análisis de las muestras, y se describe una imagen de ejemplo.

1. preparación de las ventanas de nitruro de silicio

1. Use pinzas atrás para recoger una ventana (windows se rompen si cayó del nitruro de silicio).
2. Coloque la ventana en un portaobjetos de vidrio, cara plana hacia arriba.
3. Se adhieren pequeños trozos de cinta adhesiva a los lados de la ventana y utilizar éstos para cumplir las ventanas en la parte inferior de la placa de cultivo.
4. Esterilizar las ventanas en los platos de la cultura con la radiación UV. Esto se puede lograr con el ajuste de auto-reticulación en un gabinete de reticulación UV, seguido por la irradiación UV más debajo de la lámpara de rayos UV en la campana de flujo laminar durante aproximadamente 1 hora.

2. las células en las ventanas de nitruro de silicio esterilizada de la galjanoplastia

1. Sostenga el plato se inclina en un ángulo 45°.
2. Añadir medios transfiriendo hacia el lado del plato y aliviar poco a poco el ángulo de inclinación para cubrir la ventana con los medios de comunicación.
3. Añadir las células a la placa de cultivo, de la misma manera e incubar.
4. Observar las células de vez en cuando con un microscopio de luz para determinar cuándo está listos para usar.

3. fijación y secado de las células

1. En campana de flujo laminar, eliminar los medios de comunicación por aspiración suave mientras se inclina el plato como se describió anteriormente.
2. Añadir PBS, pipeteo hacia el lado del plato mientras sostiene en ángulo. Aliviar poco a poco el ángulo de inclinación para cubrir la ventana con PBS.
3. Retirar el PBS con aspiración suave.
4. Pipeteado hacia el lado del plato y se mantiene en un ángulo, añaden 4% PFA/PBS, pH 7 para cubrir las células. Mantener en esta solución durante 20 minutos a temperatura ambiente.
5. Retire la mezcla PFA/PBS y desechar como material peligroso.
6. Añadir PBS, pipeteo como se describió anteriormente.
7. Repita los pasos del 3.5 y 3.6 dos veces.
8. Retirar el PBS por aspiración suave.
9. Añadir tubos de 20 mM, 200 mM sacarosa, pH 7.
10. Quite la tubos/sacarosa por aspiración suave.
11. Repita los pasos del 2.8 y 2.9 dos veces.
12. Rápidamente borra los bordes y detrás de la hendidura de la ventana con un Kimwipe, luego establecer la ventana en una superficie limpia, como una estera de rejilla de goma, para secar.

4. radiografía proyección de imagen de fluorescencia de las células

1. Una vez seca la muestra, verificar la presencia de células en las ventanas utilizando un microscopio de luz.
2. Use esmalte de uñas para asegurar las ventanas a un soporte de aluminio suministrado por la línea.
3. Inserte el soporte de aluminio en un montaje cinemático y colocarla en su posición en el punto focal de la óptica en el microscopio de rayos x y en un ángulo de aproximadamente 45° al haz incidente de rayos x, montado en las etapas de nanopositioning de muestra.
4. Salir de la zona del instrumento del microscopio de rayos x (generalmente un aparador hecho de paredes de plomo) y abra el obturador. Llevar a cabo los pasos restantes remotamente.
5. Usando una placa de la zona, o espejos de Kirkpatrick-Baez, enfocar el haz monocromático de rayos x (generalmente 10 keV de energía) hasta un tamaño de punto de sub-micron.
6. Utilizando las etapas de la muestra de nanopositioning y ver la posición del haz de rayos x en la muestra con una cámara Pre-calibrada scintillator aguas abajo, determinan el adecuado ancho y alto de la exploración de trama con el fin de capturar los datos de la muestra.
7. Con el detector de longitud de onda dispersiva silicio deriva a 90° para el haz incidente y unos 3 mm o menos de la muestra, recoge un espectro de prueba con un tiempo de permanencia de 1 – 2 seg.
8. Ver el espectro de prueba, elija un tiempo adecuado para la exploración, para proporcionar suficiente señal a ruido para los elementos de interés.
9. Elegir una resolución adecuada para la exploración, que no es significativamente más pequeño que el tamaño del punto de la viga sobre la muestra, ni más grande que las características de interés en la muestra.
10. Programar el análisis en el software de escaneado y recoger la imagen.

El mapa de fluorescencia de rayos x de una célula adherente se muestra en la figura 1. Cada panel muestra la distribución de un elemento determinado (por ejemplo, cobre, hierro, zinc, etcetera) en la célula. El panel con la etiqueta 's_a' muestra la absorción de rayos x.

Figura 1. Mapa de fluorescencia de rayos x de una célula adherente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Imágenes de fluorescencia de rayos x pueden ser una herramienta útil en muchos campos, incluyendo ciencia forense, ciencia de materiales, Geociencias, biología y aún en el estudio de nuestro patrimonio cultural. En ciencia de materiales, puede ayudar a encontrar defectos en chips y catalizadores con metales. En la obra de patrimonio cultural, se ha utilizado para identificar los metales tóxicos en los cabellos de las personas famosas (por ejemplo, Beethoven) y a identificar la fuente de pinturas utilizadas en el arte. En biología, se utiliza para el estudio de los metales naturales realizan bioquímica importante. En Geociencias, a menudo se utiliza para estudiar acontecimientos chronicled en el expediente de la roca. Dos características particulares que hacen imágenes de fluorescencia de rayos x útil en muchos campos son 1) su no-destructivo, por lo que muchos de los artículos que son raro, o de alto valor puede ser reflejada y 2) mientras que la preparación de la muestra se describe aquí de células es complejo, porque las células deben ser secados para muchos materiales tales como rocas, arte y otros artículos, hay muy poca preparación de la muestra requerida , que debe ser plana y libre de polvo. Aunque un sincrotrón se requiere que es mejor acceder a través de la colaboración con los científicos de estas instalaciones, la técnica puede ser muy accesible.