LeafJ è stato scritto da JNM mentre era in anno sabbatico nel laboratorio del Dr. Katherine Pollard presso gli Istituti Gladstone. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation (numero di licenza IOS-0923752).

1. Materiali vegetali Si noti che questo protocollo la crescita delle piante è destinato per rilevare evitare risposta ombra. È possibile coltivare le piante sotto la condizione preferita. <ol><li> Cospargere semi di Arabidopsis thaliana in materia di acqua filtri di carta imbevuti di 9 centimetri piastre di Petri e conservare (stratificare) li a 4 ° C per quattro giorni al buio. </li><li> Trasferire queste piastre di Petri per condizioni di sole simulato: 80-100 μE radiazione fotosinteticamente attiva (PAR) e molto rosso supplemento di portare la R: rapporto FR a 1,86. Condizioni di utilizzo giorno lungo (16 ore di luce / 8 ore buio) e la temperatura costante di 22 ° C. Incubare in questa condizione per tre giorni per permettere ai semi di germinare. </li><li> Trasferimento seme germogliato nel terreno e mantenere le piante in condizioni di Dom Per esperimenti su larga scala, si consiglia di preparare i tag piccoli per l&#39;etichettatura di ogni impianti utilizzando dati Gestore stampa unione in Microsoft Word 2004 (o successivo) per la produzione di etichette. </li><li> Undici giorni dopo il transfer al suolo, spostare la metà degli impianti a condizione tonalità: come sole, ma con supplemento di far-luce rossa per portare la R / FR rapporto a 0,52. </li><li> Dopo altre dodici giorni, le piante sono pronte per l&#39;imaging foglia. In questa fase le foglie più vecchie ancora del tutto sviluppato, mentre giovani foglie sono in fase di espansione, in modo da catturare un&#39;istantanea di sviluppo. Si consiglia di scegliere un orario diverso di sviluppo a seconda delle esigenze. </li></ol> 2. Catturare le immagini Leaf sezionato <ol><li> Preparare lucidi etichettati con genotipo vegetale e condizioni di crescita con cinque cornici rettangolari. Un frame corrisponde alle foglie di una pianta. Microsoft Excel può essere utilizzato per stampare una griglia coerente con etichette. </li><li> Staccare le foglie di 26 giorni vecchi impianti. </li><li> Scansione lascia a 600 dpi su un scanner piano. Notare che parte da un impianto deve essere posizionato verticalmente all&#39;interno di una finestra nera in un sandwich di fogli trasparenti. Evitare di toccare le foglieal telaio di una finestra nera e foglie sovrapposte, che darà errori nelle procedure seguenti. </li></ol> 3. Foglia Image Analysis per LeafJ <ol><li> Scarica ImageJ Trascinare il file LeafJ.jar nella cartella plugins di ImageJ. </li><li> Aprire un file di immagine in ImageJ 1.45s o versioni successive 14. </li><li> Dividere l&#39;immagine in tre canali di colore (rosso, verde e blu) da &quot;Immagine a colori&gt; Canali&gt; Split&quot; e applicare la soglia per l&#39;immagine nel canale blu. </li><li> Selezionare tutte le foglie da una pianta con uno strumento rettangolo (Figura 1A). </li><li> Selezionare &quot;LeafJ&quot; dal menu plugin. </li><li> Selezionare informazioni di annotazione per questa pianta dalla finestra di dialogo che appare. È possibilemodificare i valori di default che appaiono qui cliccando su &quot;modificare queste opzioni&quot;. </li><li> Dopo l&#39;esecuzione di plug LeafJ e prima di fare clic su &quot;OK&quot;, modificare le linee tracciate dalla regione di interesse (ROI) window manager (se necessario Figura 1B). Un touch-screen tablet (come un iPad) è utile per questa procedura. iPads può essere collegato ad un computer come un monitor esterno utilizzando il software di visualizzazione Air. </li><li> Esportare i risultati di misura e le informazioni associate (i nomi dei file, tempo di fioritura, che si disgregano per, misurati dai, ecc) per Microsoft Excel o software equivalente. </li></ol> 4. Foglia Image Analysis cella in ImageJ <ol><li> Fissare sezionato lascia come descritto nel riferimento 15 dopo la scansione (fase 2). Foglie FAA fissi possono essere conservati a 4 ° C per almeno 6 mesi. </li><li> Eliminare le foglie modificando fissativo FAA per cloralio idrato soluzione e foglie incubare per 1 ~ 2 ore prima osservazione al microscopio 15. </li><li> Monte foglie mimicroscopio scorre con tricomi rivolto verso l&#39;alto. Utilizzando ingrandimento 40x su un microscopio composto, strato mesofillo immagine del del centro di ogni foglia su entrambi i lati della vena principale, evitando cellule vicine tricomi o venature. </li><li> Cella foglia Trace delinea da strumento di ImageJ gestore ROI con l&#39;aiuto del touch-screen tablet e uno stilo (come descritto al punto 3). Analisi delle immagini cellulare utilizza le funzioni integrate di ImageJ, ma non richiede LeafJ. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il nostro plugin &quot;LeafJ&quot; consente la misurazione della lunghezza picciolo semi-automaticamente, aumentando il throughput quasi 6 volte misurazione manuale. Lunghezza Picciolo è un indice importante della SAS ed è anche un punto di riferimento di altri fenomeni, come la resistenza sommersione e la crescita hyponastic 17. Pertanto questo plugin può essere utile per una vasta gamma di ricercatori vegetali. Il nostro plugin è implementato in una ben consolidata java basato su software libero, ImageJ. Ciò consente un facile cross-piattaforma di installazione. Facilità di modifica del programma è anche un vantaggio del plugin LeafJ ImageJ perché ha già una vasta libreria di plugin che sono stati scritti da Java e ImageJ linguaggi macro ( <a href="http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial:start" target="_blank">http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : avviare</a> ). Al momento abbiamo solo provato foglie di Arabidopsis, ma il nostro algoritmo di picciolo / foglie di rilevamento lama confine potrebbero applicare tdicotiledoni o altro lascia dopo qualche modifica del plugin. Durante i test plug LeafJ, abbiamo trovato la maggior parte dei 14 errori provenienti da errori umani, come misplacing risultati copiati su schede tecniche e / o errore di etichettatura dei genotipi vegetali. In rari casi il picciolo / foglia confine lama è stato chiamato in modo non corretto, che richiede la correzione manuale e la creazione di ulteriori rischi di errori di copia e incolla. Siamo in grado di rilevare tali errori dopo aver guardato i dati (a) in base ai valori thresholding piccioli (ad esempio più di lunghezza anta) e (b), trovando condizioni del campione duplicato (ad esempio, &quot;sole&quot; o &quot;ombra&quot;), genotipo, o la posizione di foglie. Nostro metodo touch-screen tablet facilitato accuratezza e velocità di misurazione. Limitazione del nostro metodo è che la comunicazione tra il computer principale e la tavoletta touch screen si basa sulla velocità della rete locale senza fili (LAN).

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td></td></tr><tr><td> lontano luce rossa del LED </td><td> Orbitec </td><td> su misura </td><td></td></tr><tr><td> trasparenza </td><td> IKON </td><td> HSCA / 5 </td><td></td></tr><tr><td> scanner </td><td> Epson </td><td> Epson Perfection V700 Photo </td><td></td></tr><tr><td> Immagine J </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr><tr><td> LeafJ </td><td> costume </td><td></td><td> <a href="http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab" target="_blank">http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab</a> </td></tr><tr><td> Aria di visualizzazione </td><td> Avatron Software Inc. </td><td></td><td>blank &quot;&gt; http://avatron.com/ </td></tr><tr><td> iPad2 </td><td> Apple Inc. </td><td></td><td> <a href="http://www.apple.com/" target="_blank">http://www.apple.com/</a> </td></tr></tbody></table>

leafj: an imagej plugin for semi-automated leaf shape measurement

Fenotipizzazione High throughput (phenomics) è un potente strumento per collegare i geni alle loro funzioni (leggi l&#39;articolo 1 e recenti esempi 2-4). Foglie sono l&#39;organo fotosintetica primaria, e la loro dimensione e la forma variano evolutivamente e ambientalmente nell&#39;impianto. Per queste ragioni gli studi sulla morfologia delle foglie richiedono la misurazione di parametri multipli da numerose foglie, che è meglio fare da strumenti phenomics semi-automatici 5,6. Ombra Canopy è un importante spunto ambientale che colpisce l&#39;architettura vegetale e storia di vita, la suite di risposte è la denominazione collettiva di evitare la sindrome di tonalità (SAS) 7. Tra le risposte SAS, ombra indotta allungamento foglia picciolo e le variazioni di area di lama sono particolarmente utili come indici 8. Ad oggi, i programmi a foglia (ad esempio SHAPE 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) in grado di misurare e classificare i contorni foglia forma delle foglie, Ma non può emettere lunghezza picciolo. La mancanza di sistemi su larga scala di misura di piccioli fogliari ha inibito approcci phenomics a SAS di ricerca. In questo articolo, si descrive un plugin di nuova concezione ImageJ, chiamato LeafJ, che possono rapidamente misurare la lunghezza picciolo ei parametri lama foglia della pianta modello Arabidopsis thaliana. Per la foglia occasionale che la correzione manuale richiesta del picciolo / foglie confine lama abbiamo usato un touch-screen tablet. Inoltre, cellule forma di foglia e il numero di cellule foglia sono importanti determinanti della dimensione del foglio 13. Separata da LeafJ si presentano anche un protocollo per l&#39;utilizzo di un touch-screen tablet per misurare la forma delle cellule, l&#39;area e dimensione. Il nostro sistema di foglia tratto di misurazione non si limita alla prevenzione ombra di ricerca e accelererà fenotipizzazione foglia di mutanti e piante di screening di fenotipizzazione foglia.

1. Immagini Leaf Mostra stime del picciolo e Blade Boundary foglia, e la loro finestra di misura Una delle caratteristiche più utili di LeafJ è il rilevamento automatico della foglia lama / picciolo confine (Figura 1). L&#39;algoritmo LeafJ funziona come segue: la funzionalità incorporata ImageJ ParticleAnalyzer viene utilizzata per individuare e determinare l&#39;orientamento delle foglie all&#39;interno della selezione dell&#39;utente. Per ciascuna anta la larghezza della foglia è determinato lungo intero asse della foglia. Allora la variazione di larghezza in ciascuna posizione lungo l&#39;asse viene determinato utilizzando una finestra di esecuzione (la larghezza media per le sette posizioni prossimali alla posizione focale viene sottratta dalla larghezza media per le sette posizioni distali alla posizione focale). Il picciolo / lama limite è definito come la prima posizione oltre la base foglia in cui la variazione di larghezza è maggiore del 90% di tutte le differenze calcolate larghezza. LeafJ fa controlli supplementari per aumentare reliabibilità di questa chiamata; specificamente LeafJ richiede anche che 1) la larghezza supera il 5% più stretto delle posizioni in lunghezza (questo impedisce chiamate aberranti alla base picciolo), 2) la regione prossimale alla posizione focale non ha un grande cambiamento in larghezza, e 3) la larghezza del foglio 20% distale alla posizione focale è almeno 150% più largo nella posizione focale (vero se la posizione focale è il confine perché 20% prossimale al limite possa essere lama e quindi molto più ampio). Una volta LeafJ ha definito il picciolo / lama confine, built-in classi di ImageJ e metodi vengono utilizzati per determinare la zona della pala, il perimetro e circolarità. Metodi incorporati ImageJ sono utilizzati anche per adattarsi un&#39;ellisse alla lama e calcolare gli assi maggiore e minore dell&#39;ellisse che (quindi utilizzato come lama lunghezza e larghezza). Lunghezza picciolo è determinato da una linea che traccia lungo il centro dell&#39;area picciolo. 2. Rilevamento di Shade-indotta allungamento Picciolo &lt;/ P&gt; Per chiedere se le misure LeafJ sono stati utili per evitare dosaggio ombra, abbiamo utilizzato un modello misto effetti con il trattamento e numero di foglie come effetti fissi e replicare come un effetto casuale. Abbiamo trovato che la lunghezza picciolo, zona lama, lunghezza della lama, larghezza della lama, e il picciolo lunghezza / lama rapporto di lunghezza sono stati significativamente influenzati dal trattamento ombra, mentre circolarità lama e la lunghezza / larghezza lama rapporto lama non erano (p &lt;0,05). I nostri dati hanno mostrato che il plugin LeafJ è utile per gli studi sulle risposte foglia evitare ombra (Figura 2). 3. Precisione e velocità del Plugin LeafJ Per determinare le prestazioni del plugin LeafJ in grandi serie di dati abbiamo confrontato tempo di funzionamento e la precisione tra il manuale e le misurazioni plugin. Per le misurazioni manuali abbiamo definito il picciolo / lama di confine come il luogo dove la larghezza della foglia sembra aumentare rapidamente. Ci sono voluti un ricercatore esperto una media di 1<html> 9 min 3 sec per misurare un lucido con cinque stabilimenti (circa 50 foglie) di misurazione manuale, mentre con LeafJ ci sono voluti solo 3 min 20 sec. Media nei 5 lucidi, misurando con il plugin è di 5,7 volte più veloce di misurazione manuale. La misurazione manuale è stato fatto da un ricercatore con esperienza nella produzione di misurazioni manuali molti, un principiante potrebbe essere notevolmente più lento di misurazione manuale, con un conseguente vantaggio ancora maggiore di LeafJ. Abbiamo valutato l&#39;accuratezza confrontando i dati dai due metodi, i dati sono stati altamente correlati per tutti i parametri foglia (Figura 3). Dei 3532 punti di dati ci sono stati 172 (4,9%), che ha mostrato forti differenze tra i metodi (rappresentati per essere valori anomali sui grafici di correlazione). Abbiamo analizzato la causa di questi valori anomali. Valori anomali di 172, 29 sono stati a causa di errori durante la misurazione plug LeafJ e 143 sono dovuti a errori di misura manuale. Questa analisi ha anche mostrato errore precisione della misurazione plugin. jove_step &quot;&gt; 4. Dimensione cella di misura e numero di cellulare Indipendentemente LeafJ abbiamo anche sviluppato un flusso di lavoro efficiente per misurare il numero di cellulare e la dimensione. Numero di cellule teoricamente e dimensioni possono essere utilizzati per classificare piante mutanti in nove categorie rispetto al tipo selvatico; (1) con dimensioni più piccole cellule numero di cellule è diminuita, (2) piccole celle con numeri cellulari normali, (3) piccole cellule con cellulare aumentata numeri, (4) la dimensione delle cellule normali con il numero di cellule è diminuita, (5) formato delle cellule normali con numero di cellule normali, (6) la dimensione della cella normale con il numero di cellule è diminuita, (7) formato cella più grande con il numero di cellule è diminuita, (8) più grandi dimensione delle celle con numeri cellulari normali, (9) formato cella più grande numero di cellule con aumento 15,16. Abbiamo misurato i parametri di cella foglia in 67 genotipi di Arabidopsis thaliana utilizzando il nostro tablet basato su dimensione della cella e il numero di metodo delle celle di misura. Abbiamo misurato dimensione della cella di 8.629 celle da 877 foglie di piante 224. Moltiplicando densità a cellule By superficie fogliare (misurata con LeafJ), abbiamo stimato totale foglio dati della cella numero di 438 foglie di 219 piante. La nostra analisi messo questi genotipi in sei delle nove categorie possibili (F ig. 4). Il più grande categoria è stato (5): dimensioni delle cellule normali e il numero, in secondo luogo più grande è stato (8): la dimensione della cella più grande, con il numero delle cellule normali. Sebbene follow-up lavoro è necessario, questo suggerisce che la nostra tavoletta basata metodo può essere utilizzato per classificare mutanti basato su foglia dimensioni della cella e numero. <img alt="Figura 1" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig1.jpg" /> Figura 1. Un esempio di picciolo / foglia rilevamento lama confine e interfaccia utente. Si noti che LeafJ è in grado di definire picciolo / foglia confine lama automaticamente (Figura 1B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50028/50028fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire figurativo</a>ri. <img alt="Figura 2" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig2.jpg" /> Figura 2. Plug LeafJ in grado di rilevare le risposte evitare ombra nei parametri foglia vari. Foglia 3 a foglia 6 da sette piante di tipo selvatico (Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia) in ogni condizione (sole e ombra) sono stati esaminati. Da sinistra in alto a destra in basso, l&#39;asse y unità sono mm, mm, mm, mm 2, rapporto di lunghezza picciolo di lunghezza della lama, e il rapporto tra la lunghezza e la larghezza della lama della lama. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50028/50028fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig3.jpg" /> Figura 3. Plug LeafJ è estremamente preciso. Correlation dei dati derivanti dalla misurazione manuale e misurazione plug LeafJ da 3532 punti dati. Ogni punto rappresenta una foglia. Punti verdi indicano le 170 outlier in questo grafico. Assi di superficie fogliare è mm 2 tutti gli altri sono mm. Numeri di fronte a ciascun parametro rappresentano la posizione foglia (cioè &quot;3&quot; è la terza foglia). <img alt="Figura 4" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig4.jpg" /> Figura 4. Diagramma di dispersione di superficie fogliare cellula e cellula numero di foglie tra i 67 genotipi di Arabidopsis thaliana. Ogni punto rappresenta i fenotipi di ciascun genotipo coltivate in condizioni di ombra. Le piante sono state classificate in nove categorie in base alla loro differenza da wild type (Col) determinato da un lineare misto modello di effetti e molteplici test corretti valori di p: cell (1) dimensione della cella più piccola, con il numero di cellule è diminuito, (2) minore dimensioni con normaal numero di cellulare, (3) la dimensione della cella più piccola, con un aumento del numero di cellule, (4) la dimensione della cella normale con numero di cellulare è diminuito, (5) dimensioni delle cellule normali con il numero di cellule normali, (6) la dimensione della cella normale con numero di cellulare è diminuito, (7 ) Dimensione cella più grande con diminuzione del numero di cellule, (8) formato cella più grande con numero di cellule normali, (9) formato cella più grande numero di cellule con aumentata. &quot;*&quot; Indica il fenotipo di tipo selvatico (Col).

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LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

Dimostrazione di metodi chiave per le misurazioni ad alta foglia di throughput. Questi metodi possono essere utilizzati per accelerare la fenotipizzazione foglia nello studio di molte piante mutanti o comunque impianti di vagliatura da fenotipo foglia.

LeafJ: un plugin per ImageJ semi-automatico di misurazione Leaf Shape

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

leafj-an-imagej-plugin-for-semi-automated-leaf-shape-measurement

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

28.2K Views.  University of California Davis. Dimostrazione di metodi chiave per le misurazioni ad alta foglia di throughput. Questi metodi possono essere utilizzati per accelerare la fenotipizzazione foglia nello studio di molte piante mutanti o comunque impianti di vagliatura da fenotipo foglia.

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We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to achieve a high stomatal conductance (gs) to capture CO2 for photosynthesis, water is lost by transpiration1,2. Water evaporating from the airspaces is replaced from cell walls, in turn drawing water from the xylem of leaf veins, in turn drawing from xylem in the stems and roots. As water is pulled through the system, it experiences hydraulic resistance, creating tension throughout the system and a low leaf water potential (&Psi;leaf). The leaf itself is a critical bottleneck in the whole plant system, accounting for on average 30% of the plant hydraulic resistance3. Leaf hydraulic conductance (Kleaf = 1/ leaf hydraulic resistance) is the ratio of the water flow rate to the water potential gradient across the leaf, and summarizes the behavior of a complex system: water moves through the petiole and through several orders of veins, exits into the bundle sheath and passes through or around mesophyll cells before evaporating into the airspace and being transpired from the stomata. Kleaf is of strong interest as an important physiological trait to compare species, quantifying the effectiveness of the leaf structure and physiology for water transport, and a key variable to investigate for its relationship to variation in structure (e.g., in leaf venation architecture) and its impacts on photosynthetic gas exchange. Further, Kleaf responds strongly to the internal and external leaf environment3. Kleaf can increase dramatically with irradiance apparently due to changes in the expression and activation of aquaporins, the proteins involved in water transport through membranes4, and Kleaf declines strongly during drought, due to cavitation and/or collapse of xylem conduits, and/or loss of permeability in the extra-xylem tissues due to mesophyll and bundle sheath cell shrinkage or aquaporin deactivation5-10. Because Kleaf can constrain gs and photosynthetic rate across species in well watered conditions and during drought, and thus limit whole-plant performance they may possibly determine species distributions especially as droughts increase in frequency and severity11-14.
We present a simple method for simultaneous determination of Kleaf and gs on excised leaves. A transpiring leaf is connected by its petiole to tubing running to a water source on a balance. The loss of water from the balance is recorded to calculate the flow rate through the leaf. When steady state transpiration (E, mmol &bull; m-2 &bull; s-1) is reached, gs is determined by dividing by vapor pressure deficit, and Kleaf by dividing by the water potential driving force determined using a pressure chamber (Kleaf= E /- &Delta;&psi;leaf, MPa)15.
This method can be used to assess Kleaf responses to different irradiances and the vulnerability of Kleaf to dehydration14,16,17.

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

We describe a relatively rapid (30 min) and realistic method for simultaneously measurement of leaf hydraulic conductance (Kleaf) and stomatal conductance (gs) for transpiring excised leaves. The method can be modified to measure the light and dehydration responses of Kleaf and gs.

Misurazione della Leaf conduttanza idraulica e conduttanza stomatica e le loro risposte ad irraggiamento e disidratazione con il metodo del flusso evaporativo (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, morphological leaf traits have the potential to summarize plants strategies in terms of water use efficiency, growth pattern and nutrient use. The leaf economics spectrum (LES) is a recognized framework in functional plant ecology and reflects a gradient of increasing specific leaf area (SLA), leaf nitrogen, phosphorus and cation content, and decreasing leaf dry matter content (LDMC) and carbon nitrogen ratio (CN). The LES describes different strategies ranging from that of short-lived leaves with high photosynthetic capacity per leaf mass to long-lived leaves with low mass-based carbon assimilation rates. However, traits that are not included in the LES might provide additional information on the species&#39; physiology, such as those related to stomatal control. Protocols are presented for a wide range of leaf functional traits, including traits of the LES, but also traits that are independent of the LES. In particular, a new method is introduced that relates the plants&#8217; regulatory behavior in stomatal conductance to vapor pressure deficit. The resulting parameters of stomatal regulation can then be compared to the LES and other plant functional traits. The results show that functional leaf traits of the LES were also valid predictors for the parameters of stomatal regulation. For example, leaf carbon concentration was positively related to the vapor pressure deficit (vpd) at the point of inflection and the maximum of the conductance-vpd curve. However, traits that are not included in the LES added information in explaining parameters of stomatal control: the vpd at the point of inflection of the conductance-vpd curve was lower for species with higher stomatal density and higher stomatal index. Overall, stomata and vein traits were more powerful predictors for explaining stomatal regulation than traits used in the LES.

Unraveling how physiology and morphology are linked allows a deeper understanding of mechanistic functioning of plant leaves. We present both a procedure to derive parameters of stomatal regulation from stomatal conductance measurements and correlations with traditional functional leaf traits.