KO e AC sono supportati da una borsa e una borsa di studio della American Heart Association. SIB e RB sono sostenuti da sovvenzioni NIH.

<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1435/SOHA_overview.pdf">Clicca qui per visualizzare una panoramica dei semi automatizzati di analisi battito cardiaco (SoHa) procedura.</a> Semi-automatici di analisi battito cardiaco ottico 1. Pre-elaborazione - Questa operazione fornisce informazioni sulla diametri cuore diastolica e sistolica. Bordi cuore sono identificati e contrassegnati massimo durante la diastole e sistole. Registrazioni ottiche possono essere avanzate a velocità lenta e anche un solo fotogramma alla volta permettendo un&#39;identificazione precisa del frame in cui massima contrazione e rilassamento del cuore si verificano. Un paio di marchi che identificano i bordi diastolica e un paio identificare i bordi sistolica sono fatti. Marchi può essere fatta anche in duplice copia a diverse posizioni orizzontali lungo il cuore. I diametri cuore ottenuto in questa fase vengono anche utilizzati per calcolare una misura aggiuntiva che fornisce una stima della contrattilità del cuore. Questa misura è l&#39;accorciamento frazionale per cento (% FS) e rappresenta la misura in cui i bordi cuore muovono l&#39;uno verso l&#39;altro durante una contrazione. La formula utilizzata per calcolare% FS è: (((Diastolica diametro - diametro sistolica) / diastolica di diametro) x 100) Nota - I punti individuati in questa serie sono utilizzati solo per il diametro e le misure di accorciamento frazionale e non sono utilizzati per il rilevamento del movimento. Esempio: (. Cammarato, et al 2008) in Drosophila, mutazioni puntiformi nel dominio trasduttore catena pesante della miosina, una regione conosciuta per modulare l&#39;attività enzimatica del motore, risultato di cuori che si dilatano o limitato a seconda che sopprimono o migliorare l&#39;attività ATPasica della miosina è . Questi tipi di misurazioni non possono essere realizzati in vola intatto come di solito non è possibile identificare i bordi cuore tutta la lunghezza del tubo cuore attraverso la cuticola e il grasso, (confronta tipo selvatico, D45 e Mhc5 M-modalità in &quot;M-mode Figura &quot;di seguito) che normalmente circondano il cuore. Le misurazioni effettuate quando visualizzare il cuore in mosche intatto con altri metodi comunemente impiegati di solito sono limitati alla parte più anteriore del cuore, la regione camera conica. Non è inoltre possibile ottenere questo tipo di misurazione dinamica nel tessuto fisso. 2. Movement Detection- Questo passo è fatto automaticamente dal programma e utilizza due diversi algoritmi per analizzare il movimento in ogni film. In breve, il primo algoritmo, la &quot;media Tenebre Frame&quot; algoritmo utilizza un frame approccio telaio. Questo algoritmo media l&#39;intensità buio di un frame intero film, normalizza il valore di un intervallo compreso tra 0 e 1, e le trame della media normalizzata per ogni fotogramma del film nel corso del tempo. Il secondo approccio, il &quot;pixel per pixel&quot; algoritmo, analizza i cambiamenti nel buio di tutti i singoli pixel da un fotogramma all&#39;altro. Pixel che presentano variazioni di intensità di sopra di una soglia prefissata vengono sommati per ogni fotogramma e tracciati per ogni fotogramma del film nel corso del tempo. 3. Intervalli di controllo- L&#39;uscita dal movimento di due algoritmi di rilevamento è visualizzata in questo modulo con i &quot;media Darkness&quot; di output visualizzato in una finestra al di sopra del &quot;Pixel per pixel&quot; finestra di uscita. Per essere sicuri che gli intervalli di rilevazione d&#39;accordo con il movimento nel film reale che viene visualizzato un bordo-traccia o M-mode fatto da cornici in fase di analisi direttamente sotto le finestre di uscita dell&#39;algoritmo. L&#39;M-mode è composto da digitalmente tagliando fette larghe un pixel attraverso il cuore da ogni fotogramma del film e allineando in orizzontale per fornire un&#39;istantanea dei movimenti filo del cuore nel corso del tempo. Nella &quot;pixel per pixel&quot; finestra gli intervalli individuati diastolica sono indicate da una linea orizzontale verde con il numero di fotogrammi che contribuiscono a tale intervallo direttamente sopra. Intervalli di pressione sistolica sono identificati come l&#39;intervallo tra due successive diastole. L&#39;inizio di una sistole è indicato nel M-mode da una linea verticale blu e alla fine è indicato da una linea verticale rossa. Con questo display è relativamente facile vedere se l&#39;uscita algoritmo è d&#39;accordo con i movimenti cuore vero e proprio. Anche se il rilevamento del movimento viene eseguito automaticamente l&#39;uscita deve essere controllato per la precisione. Ci sono diverse ragioni per questo: uno è che ci sia spesso un sottostante, onde lente fluttuazione dei livelli di luce non legati al movimento del cuore. Questo di solito può essere eliminata mediante l&#39;uso di una costruito nel filtro passa-alto. Una seconda ragione ha a che fare con la sensibilità del &quot;Pixel per pixel&quot; approccio. L&#39;output di questo algoritmo è in genere due tracce movimento, uno per il movimento di contrazione e l&#39;altra per il movimento relax. Nei vecchi mosche e in alcuni mutanti l&#39;intervallo di tempo tra questi due movimenti<html> diventa relativamente lunga e il programma cerca di interpretare i due movimenti separati come due battiti. Questo può essere corretto chiedendo al programma di confrontare l&#39;output del Pixel da algoritmo di pixel con quella dell&#39;algoritmo media Tenebre Frame, cliccando sul &quot;buio Usa&quot; scatola. Esempio (vedi video): In 5 a 7 settimane vecchio vola intervalli sistolica sono in genere molto più a lungo nelle mosche giovani. Questi lunghi intervalli sono inizialmente rilevate come due contrazioni separate da un breve diastole. Questo può essere corretto selezionando l&#39;opzione &quot;Utilizza tenebre&quot; casella di controllo. In questo caso il programma metterà a confronto l&#39;intervallo diastolico identificato dal Pixel con algoritmo Pixel con l&#39;uscita media Tenebre Frame. Se la produzione media tenebre Frame ha un valore positivo, allora ogni intervallo diastolico identificati nel Pixel con algoritmo Pixel saranno ignorati e gli intervalli saranno specificati correttamente. L&#39;intero film possono essere acquisiti in 10 secondi segmenti e accettati (clicca su &quot;OK Dati&quot;) o respinte (fare clic su &quot;Elimina dati personali&quot;). L&#39;Hi e sensibilità passare Lo filtro può essere regolata manualmente per definire con maggiore precisione gli intervalli di contrazione quando utilizzano l&#39;algoritmo Tenebre. 4. Statistiche di uscita- Una volta che l&#39;uscita di un film dato è stato accettato il programma utilizzerà queste informazioni per calcolare automaticamente una serie di parametri. Questi includono intervallo diastolica e sistolica, periodo cardiaco e la frequenza cardiaca, la direzione e la velocità delle FS onda contrazione, diametri cuore, e%. Inoltre, il programma ha diversi metodi per quantificare arrhythmicity riflettendo la contrazione non uniforme e cicli di rilassamento (vedi Fink et al, 2009). Prodotti statistici è previsto per ogni film individualmente e per l&#39;intero set di dati nella forma di un valore separati da virgola (. Csv) che può essere aperto in programmi di foglio di calcolo come Microsoft Excel. Tabella 1 - <img src="/files/ftp_upload/1435/1435table1.jpg" alt="table1" /> Un esempio di output generato dal programma semi-automatico ottico Analisi Cuore. 5. Aggiornamento Istogrammi- Questa parte del programma visualizza tutti i dati su intervalli di cuore per un set di dati in formato istogramma. Dal momento che le frequenze cardiache sono variabili abbiamo normalizzare i dati in uscita istogramma. Tuttavia, poiché la distribuzione degli intervalli non è simmetrica intorno a una media che utilizziamo il valore medio dell&#39;intervallo per il nostro normalizzazione. Esempio (vedi video): mosche mutanti che sono per il canale di potassio KCNQ mostrare intervalli diastolica e sistolica estremamente irregolare. Tipicamente gli intervalli sistolica sono molto più lunghi e più irregolare rispetto ai pari età vola tipo selvatico. Questo si può chiaramente vedere dalla visualizzazione dei dati in formato istogramma (vedi anche Ocorr et al. 2007). 6. M-mode- Questo modulo genera M-modalità che possono essere fatte da qualsiasi posizione lungo il cuore nel frame del film. La lunghezza del M-mode possono anche essere specificata. M-modi sono utili per mostrare qualitativamente ciò che il cuore sta facendo in un film. Esempio (vedi video): film di un cuore 3 giorni zebrafish vecchio larvale che mostra il ventricolo anteriore, che è usato per generare un M-mode. La fetta verticale di pixel che verranno trattati elettronicamente asportata da ogni fotogramma del film è indicato da una linea rossa. M-mode Figura: Esempi di M-modalità di Drosophila e zebrafish. Una delle mutazioni miosina discusso nella fase della Pre-elabora i risultati in un motore molecolare con cinetica enzimatica più veloce con conseguente restrizione cuore e, occasionalmente, un blocco di conduzione. Entrambi i parametri possono essere visualizzati qualitativa, utilizzando M-modalità. <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig1.jpg" alt="M-modi di esempi" /> M-modi di fatto nella stessa parte del cuore, sia tipo selvatico e mosche mutanti mostrano chiaramente il fenotipo limitato nel Mhc 5 mutante e il diametro dilatati e cicli di contrazione aritmica della D45 mutante (che esprime la miosina con cinetica enzimatica depresso) (modificato da Cammarato et. al, 2008). M-mode fatto da un cuore Zebrafish larvale che mostra il ventricolo anteriore (film stesso cuore, come illustrato nella dimostrazione, Fink et al 2009). 7. Red Dot Movie- Questo modulo genera automaticamente una rallentato (1:4), 20 seconda versione di un film analizzati esponendo tutti i pixel che sono identificati come cambia in rosso. Questa funzione viene utilizzata principalmente a scopo illustrativo. Movie 1 - Un &quot;movie punto rosso&quot; che mostra i pixel che vengono identificati come i cambiamenti di intensità buio dagli algoritmi di programma in rosso. La velocità è rallentata dal film originale di un fattore 4. w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi &quot;&gt; Clicca qui per scaricare il filmato 1. 8. Applicazioni-aggiuntivo Abbiamo iniziato ad applicare questo sistema di analisi per i film ad alta velocità di altri modelli con piccoli cuori che sono spesso difficili da analizzare con metodologia tradizionale. Noi abbiamo applicato con successo questa analisi sia per i cuori zebrafish larvale e cuori embrionali di topo (Fink et al, 2009). Movie 2 - il cuore del film Topo più figura con intervalli di controllo con uscita dati. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1435/Mouse%20heart%20clip%201.avi">Clicca qui per scaricare Movie 2.</a> <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig2.jpg" alt="Intervalli di controllo Cuore mouse" />

<ol>
	<li>Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).</li><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -. S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging.">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li><li>Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+detection+and+quantification+of+heartbeat+parameters+in+Drosophila,+zebrafish+and+embryonic+mouse+hearts.">A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts.</a> Biotechniques. 46, 101-113 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Il modello Drosophila ha dimostrato di essere un potente strumento genetico che è stato usato per affrontare una serie di quesiti scientifici che spaziano dallo sviluppo embrionale all&#39;apprendimento e alla memoria. Di recente questo organismo modello versatile è stato utilizzato per studiare la genetica della funzione cardiaca. Un certo numero di tentativi di quantificare fisiologia cardiaca in adulti Drosophila si sono basati sulle osservazioni fatte nei moscerini intatta attraverso la cuticola addominale. La maggior parte di questi approcci dipendono osservazione visiva o registrazioni delle variazioni di intensità luminosa trasmessa attraverso l&#39;addome a quantificare un unico parametro, la frequenza cardiaca. Anche se questo è un parametro utile è limitata a ciò che ci dice sulla funzione cardiaca. Il nostro semiautomatica ottico Metodo di analisi Heartbeat è un approccio robusto per ricavare informazioni precise su una serie di ulteriori parametri importanti da film ad alta velocità di battere i cuori e di farlo per ogni battito del cuore in un record.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MatLab software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Math Works, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required environment for the analysis software.</td>
</tr>
<tr>
<td>EM-CCD digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>9100 or 9300</td>
<td>Other high speed digital cameras will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>HC image data capture software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Other image capture software that produces movies in avi format will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Light Microscope with 10x objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

semi-automated optical heartbeat analysis of small hearts

Abbiamo sviluppato un metodo per analizzare le registrazioni ottico ad alta velocità da<em&gt; Drosophila</em&gt;, Zebrafish e cuori embrionali di topo (Fink, et. Al., 2009). Il nostro semi-automatico Analisi Heartbeat (Optical SoHa) utilizza un nuovo algoritmo di rilevamento di movimento che è in grado di rilevare movimenti di contrazione cardiaca associata a singoli eventi e relax. Il programma prevede una serie di letture fisiologicamente rilevanti tra pressione sistolica e diastolica intervalli, frequenza cardiaca, come pure le misure qualitative e quantitative di arrhythmicity battito cardiaco. Il programma calcola anche le misure di diametro cuore sia durante la diastole e sistole dal quale sono calcolati frazione di accorciamento e cambia zona frazionaria. L&#39;uscita è fornito sotto forma di file digitale compatibile con la maggior parte dei programmi di foglio elettronico. Le misure sono fatte per ogni battito cardiaco in un record aumentando la potenza statistica del risultato. Dimostriamo ciascuna delle fasi in cui è richiesto l&#39;input dell&#39;utente e mostra l&#39;applicazione della nostra metodologia per l&#39;analisi della funzione cardiaca in tutti e tre i modelli cuore geneticamente trattabili.

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Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Abbiamo sviluppato un semi-automatico ottica Metodo di analisi Heartbeat (SoHa) per analizzare le registrazioni ottico ad alta velocità da<em&gt; Drosophila</em&gt;, Zebrafish e cuori embrionali di topo. Dimostriamo l&#39;applicazione della nostra metodologia per l&#39;analisi della funzione cardiaca nel moscerino della frutta e cuori embrionali di topo.

Semiautomatici Analisi Heartbeat ottica di piccoli cuori

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

semi-automated-optical-heartbeat-analysis-of-small-hearts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  The Sanford Burnham Institute for Medical Research. Abbiamo sviluppato un semi-automatico ottica Metodo di analisi Heartbeat (SoHa) per analizzare le registrazioni ottico ad alta velocità da Drosophila, Zebrafish e cuori embrionali di topo. Dimostriamo l'applicazione della nostra metodologia per l'analisi della funzione cardiaca nel moscerino della frutta e cuori embrionali di topo.

Video: Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Manutenzione e pulizia adeguata del microscopio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Ricerca

Biologia

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

I componenti principali del microscopio ottico

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contrasto di fase e interferenza differenziale contrasto (DIC) Microscopia

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Generazione Substrato per endonucleasi di CRISPR / Cas Sistemi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: un plugin per ImageJ semi-automatico di misurazione Leaf Shape

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

Isolamento dei cardiomiociti da cuori fissi per l'immunocitochimica e l'analisi dello ploidy

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over the past two decades, we have developed a yeast membrane protein expression platform that has been used to study many important fungal membrane proteins. The expression host Saccharomyces cerevisiae AD&#916;&#916; is deleted in seven major endogenous ABC transporters and it contains the transcription factor Pdr1-3 with a gain-of-function mutation that enables the constitutive overexpression of heterologous membrane protein genes stably integrated as single copies at the genomic PDR5 locus. The creation of versatile plasmid vectors and the optimization of one-step cloning strategies enables the rapid and accurate cloning, mutagenesis, and expression of heterologous ABC transporters. Here, we describe the development and use of a novel protease-cleavable mGFPHis double tag (i.e., the monomeric yeast enhanced green fluorescent protein yEGFP3 fused to a six-histidine affinity purification tag) that was designed to avoid possible interference of the tag with the protein of interest and to increase the binding efficiency of the His tag to nickel-affinity resins. The fusion of mGFPHis to the membrane protein ORF (open reading frame) enables easy quantification of the protein by inspection of polyacrylamide gels and detection of degradation products retaining the mGFPHis tag. We demonstrate how this feature facilitates detergent screening for membrane protein solubilization. A protocol for the efficient, fast, and reliable isolation of the small-scale plasma membrane preparations of the C-terminally tagged Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overexpressed in S. cerevisiae AD&#916;&#916;, is presented. This small-scale plasma membrane isolation protocol generates high-quality plasma membranes within a single working day. The plasma membrane preparations can be used to determine the enzyme activities of Cdr1 and Cdr1 mutant variants.

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

This article presents a small-scale plasma membrane isolation protocol for the characterization of Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) protein Cdr1, overexpressed in Saccharomyces cerevisiae. A protease-cleavable C-terminal mGFPHis double tag with a 16-residue linker between Cdr1 and the tag was designed to facilitate the purification and detergent-screening of Cdr1.

Preparazione della membrana plasmatica su piccola scala per l'analisi di Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...