LeafJ wurde von JNM geschrieben, während er ein Sabbatical war Dr. Katherine Pollard Labor am Gladstone Institute. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (Grant-Nummer IOS-0923752) unterstützt.

Ein. Pflanzenmaterialien Beachten Sie, dass diese Pflanze das Wachstum Protokoll zum Nachweis Vermeidung von Schatten zählen Antwort gerichtet ist. Sie können Pflanzen unter Ihrem Lieblings Zustand wachsen. <ol><li> Sprinkle Arabidopsis thaliana Samen auf Wasser eingeweicht Filterpapiere in 9 cm Petrischalen und möglich (Stratifizierung) sie bei 4 ° C für vier Tage in der Dunkelheit. </li><li> Übertragen Sie diese Petrischalen auf simulierte Sonnenbedingungen: FR-Verhältnis auf 1,86: 80-100 uE photosynthetisch aktive Strahlung (PAR) und weit-rote Ergänzung zu den R bringen. Verwenden Langtagsbedingungen (16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit) und konstanter Temperatur von 22 ° C. Inkubieren in diesem Zustand für drei Tage, damit die Samen zu keimen. </li><li> Übertragen gekeimten Samen in den Boden und die Pflanzen unter der Sonne Zustand. Für Großversuche, empfehlen wir Herstellung kleiner Tags zur Kennzeichnung jedes Pflanzen mit Seriendruck-Manager in Microsoft Word 2004 (oder höher) für die Herstellung von Etiketten. </li><li> Elf Tage nach transfer den Boden, bewegen die Hälfte der Pflanzen, die Schatten Zustand: wie Sonne, aber mit zusätzlichem weit rotes Licht, um den R / FR-Verhältnis auf 0,52 zu bringen. </li><li> Nach weiteren 12 Tage, sind die Pflanzen bereit für Blatt Bildgebung. In diesem Stadium die älteren Blätter sind voll ausgereift während jüngere Blätter noch erweitern, so dass Sie eine Momentaufnahme der Entwicklung zu erfassen. Vielleicht möchten Sie eine andere Entwicklungszeit je nach Ihren Bedürfnissen zu wählen. </li></ol> 2. Capturing Dissected Blatt Images <ol><li> Bereiten Sie Transparentfolien mit pflanzlichen Genotyp und Wachstumsbedingungen mit fünf rechteckigen Rahmen gekennzeichnet. Ein Frame entspricht Blätter von einer Pflanze. Microsoft Excel kann verwendet werden, um eine konsistente Gitter mit Etiketten gedruckt werden. </li><li> Dissect Blätter 26 Tage alten Pflanzen. </li><li> Scan lässt bei 600 dpi auf einem Flachbett-Scanner. Beachten Sie, dass von einem Werk verlässt sollten vertikal in einem schwarzen Fenster platziert werden in einem Sandwich von transparenten Folien. Berühren Blätterzu einem schwarzen Fensterrahmen und überlappenden Blättern, die Fehler in folgenden Verfahren geben wird. </li></ol> 3. Blatt Image Analysis by LeafJ <ol><li> Herunterladen ImageJ Ziehen Sie den LeafJ.jar Datei in den Plugin-Ordner von ImageJ. </li><li> Öffnen Sie eine Bilddatei in ImageJ 1.45s oder später 14. </li><li> Split das Bild in drei Farbkanäle (rot, grün und blau) von &quot;Bild&gt; Farbe&gt; Split Channels&quot; und gelten Schwelle zum Bild im blauen Kanal. </li><li> Wählen Sie alle Blätter von einer Pflanze durch ein Rechteck-Werkzeug (Abb. 1A). </li><li> Wählen Sie &quot;LeafJ&quot; aus dem Plugin-Menü. </li><li> Wählen Anmerkungsinformationen für diese Anlage aus dem Dialogfeld, das erscheint. Sie könnenbearbeiten Sie die Standardwerte, die hier erscheinen, indem Sie auf &quot;Bearbeiten Sie diese Optionen&quot;. </li><li> Nach dem Ausführen LeafJ Plugin und bevor Sie auf &quot;OK&quot;-Taste, bearbeiten zurückverfolgt Zeilen aus der Region of Interest (ROI)-Fenster (falls erforderlich; Abbildung 1B). Ein Touchscreen-Tablet (z. B. ein iPad) ist nützlich für dieses Verfahren. iPads können an einen Computer wie einen externen Monitor mit Air Display Software angeschlossen werden. </li><li> Exportieren von Messergebnissen und damit verbundenen Informationen (Dateinamen, Blütezeit, zerschnitten von, gemessen, etc) in Microsoft Excel oder gleichwertige Software. </li></ol> 4. Blattzelle Image Analysis in ImageJ <ol><li> Fix seziert lässt, wie in Bezug 15 nach dem Scannen (Schritt 2) beschrieben. FAA festen Blätter können in 4 ° C für mindestens 6 Monate aufbewahrt werden. </li><li> Deaktivieren Sie die Blätter, indem FAA Fixativ Chloralhydratlösung und inkubieren Blätter für 1 bis 2 Stunden vor der mikroskopischen Beobachtung 15. </li><li> Berg verlässt auf mimikroskop gleitet mit Trichomen nach oben. Mit 40-facher Vergrößerung auf einem zusammengesetzten Mikroskop, Bild Mesophyll Schicht der Mitte jedes Blatt auf beiden Seiten der Hauptader, die Vermeidung Zellen in der Nähe Trichomen oder Venen. </li><li> Trace Blattzelle umreißt von ImageJ ROI-Manager-Tool mit Hilfe des Touchscreen-Tablet und einem Stift (wie in Schritt 3 beschrieben). Zelle Bildanalyse nutzt die integrierten Funktionen der ImageJ aber nicht erforderlich LeafJ. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Unser &quot;LeafJ&quot; plugin ermöglicht die Messung von Blattstiel Länge halbautomatisch, Erhöhung des Durchsatzes fast 6 Mal über manuelle Messung. Blattstiel Länge ist ein wichtiger Index für SAS und ist auch ein Wahrzeichen von anderen Phänomenen wie Überflutung Widerstand und hyponastic Wachstum 17. Deshalb dieses Plugin kann nützlich sein, um eine breite Palette von pflanzlichen Forscher. Unser Plugin ist in einem gut etablierten java-basierte freie Software ImageJ umgesetzt. Dies ermöglicht eine einfache Cross-Plattform-Installation. Einfache Änderung des Programms ist auch ein Vorteil der LeafJ plugin, weil ImageJ hat bereits eine große Bibliothek von Plugins, die von Java und ImageJ Makrosprachen (geschrieben wurden <a href="http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial:start" target="_blank">http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : start</a> ). Derzeit haben wir nur Arabidopsis Blättern getestet, aber unser Algorithmus der Blattstiel / Blattspreite Grenze Detektion könnte t gelteno andere dikotyle Blätter nach einigen Änderungen des Plugins. Während des Tests LeafJ plugin, fanden wir die meisten der 14 Fehler kam von menschlichen Fehlern, wie verlegen kopiert Ergebnisse auf Datenblättern und / oder falsche Etikettierung von pflanzlichen Genotypen. In seltenen Fällen kann die Blattstiel / Blattspreite Grenze wurde falsch aufgerufen erfordern manuelle Korrektur und die Schaffung zusätzlicher Risiko copy and paste Fehler. Wir könnten solche Fehler nach einem Blick auf Daten (a) durch Schwellwertbildung Werte (zB Blattstiele länger als Blattlänge) erkennen und (b) von der Suche vervielfältigt Probe Bedingung (zB &quot;Sonne&quot; oder &quot;Schatten&quot;), Genotyp, oder die Position der Blätter. Unsere Touchscreen-Tablet-Methode erleichtert Genauigkeit und Geschwindigkeit der Messung. Beschränkung unserer Methode ist, dass die Kommunikation zwischen dem Hauptcomputer und Touchscreen Tablette setzt auf die Geschwindigkeit des drahtlosen lokalen Netzwerks (LAN).

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td></td></tr><tr><td> weit Rotlicht LED </td><td> Orbitec </td><td> Maßarbeit </td><td></td></tr><tr><td> Transparenz </td><td> IKON </td><td> HSCA / 5 </td><td></td></tr><tr><td> Scanner </td><td> Epson </td><td> Epson Perfection V700 PHOTO </td><td></td></tr><tr><td> Image J </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr><tr><td> LeafJ </td><td> Brauch </td><td></td><td> <a href="http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab" target="_blank">http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab</a> </td></tr><tr><td> Air Display </td><td> Avatron Software Inc. </td><td></td><td>blank &quot;&gt; http://avatron.com/ </td></tr><tr><td> iPad2 </td><td> Apple Inc. </td><td></td><td> <a href="http://www.apple.com/" target="_blank">http://www.apple.com/</a> </td></tr></tbody></table>

leafj: an imagej plugin for semi-automated leaf shape measurement

Hoher Durchsatz Phänotypisierung (phenomics) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Verknüpfung von Genen, ihre Funktionen (siehe Beitrag 1 und jüngsten Beispiele 2-4). Blätter sind die primären photosynthetischen Organ, und ihre Größe und Form variieren entwicklungspolitisch und ökologisch innerhalb einer Anlage. Aus diesen Gründen Studien über Blattmorphologie erfordern Messung mehrerer Parameter aus zahlreichen Blättern, die am besten durch halbautomatische phenomics Werkzeuge 5,6 durchgeführt wird. Canopy Schatten ist ein wichtiger Umweltfaktor Cue das Pflanzenwachstum Architektur und das Leben der Geschichte betrifft, die Suite der Antworten wird zusammenfassend als Vermeidung von Schatten zählen Syndrom (SAS) 7. Unter SAS Reaktionen sind Schatten induzierten Blatt Blattstiel Dehnung und Veränderungen im Blade-Bereich besonders nützlich als Indizes 8. Bis heute kann Blattform Programme (zB SHAPE 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) zu messen Blatt Konturen und kategorisieren Blattformen, Kann jedoch nicht auszugeben Blattstiel Länge. Mangel an großen Messsysteme Blattstielen gehemmt hat phenomics Ansätze zur SAS Forschung. In diesem Papier beschreiben wir eine neu entwickelte ImageJ Plugin namens LeafJ, die schnell messen können Blattstiel Länge und Blattspreite Parameter der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Für das gelegentliche Blatt, das erforderliche manuelle Korrektur der Blattstiel / Blattspreite Grenze wir eine Touchscreen-Tablet verwendet. Ferner sind Blattzelle Form und Blatt Zellzahlen wichtige Determinanten der Blattgröße 13. Getrennt von LeafJ präsentieren wir auch ein Protokoll für die Verwendung eines Touchscreen-Tablet für Messzelle Form, Fläche und Größe. Unser Blatt trait Messsystem ist nicht auf Schatten-Vermeidungs-Forschung beschränkt und wird leaf Phänotypisierung von vielen Mutanten und Siebanlagen für Blatt Phänotypisierung beschleunigen.

Ein. Blatt Images Zeige Schätzungen der Blattstiel und Blattspreite Boundary, und ihre Messfenster Eines der nützlichsten Funktionen von LeafJ ist automatische Erkennung von Blattspreite / Blattstiel Grenze (Abbildung 1). Die LeafJ Algorithmus arbeitet wie folgt: die integrierte ImageJ ParticleAnalyzer Funktionalität wird verwendet, um herauszufinden und bestimmen die Orientierung der Blätter Innenseite der Benutzerauswahl. Für jedes Blatt die Breite des Blattes ist entlang des gesamten Blattes Achse bestimmt. Dann wird die Änderung in der Breite an jeder Stelle entlang der Achse wird mit einem laufenden Fenster (die mittlere Breite für die sieben Positionen proximal zu der Fokusposition von der mittleren Breite für die sieben Positionen distal der Brennpunktposition subtrahiert). Der Blattstiel / Klinge Grenze wird als erste Position jenseits der Blattbasis wenn die Änderung in der Breite größer ist als 90% aller berechneten Breite Unterschiede definiert. LeafJ macht zusätzliche Überprüfungen Zuver erhöhenkeit dieser Aufforderung; spezifisch LeafJ erfordert auch, dass 1) die Breite des schmalsten 5% von Positionen in der Länge (dies verhindert aberrante Rufen an der Blattstiel Base) überschreitet, 2) die Region proximal zu der Fokusposition keinen wesentliche Änderung in der Breite und 3) die Breite des Blattes 20% distal der Fokuslage wenigstens 150% breiter als an der Fokusposition (wahr, wenn die Brennpunkt-Position ist die Grenze, da 20% proximal zu der Grenze Klinge sein sollte und deshalb viel breiter). Sobald LeafJ hat den Blattstiel / Klinge Grenze definiert, built-in ImageJ Klassen und Methoden werden verwendet, um Blade Fläche, Umfang und Rundheit zu bestimmen. Integrierter ImageJ Methoden werden auch verwendet, um eine Ellipse zu der Klinge zu passen und um die Haupt-und Nebenachse der genannten Ellipse (anschließend als Klinge Länge und Breite verwendet) zu berechnen. Blattstiel Länge durch eine Linie, die entlang der Mitte des Stieles Bereich Spuren bestimmt. 2. Erkennung von Shade-induzierte Blattstiel Dehnung &lt;/ P&gt; Zu fragen, ob LeafJ Messungen nützlich bei der Untersuchung Vermeidung von Schatten zählen waren, verwendeten wir eine gemischte Effects-Modell mit der Behandlung und Blattzahl als fixe Effekte und replizieren als zufälligen Effekt. Wir fanden, dass Blattstiel Länge, Blattfläche, Klingenlänge Klingenbreite und die Blattstiel Länge / Klingenlänge Verhältnis signifikant durch Schatten Behandlung nicht beeinflusst, während Blade Rundheit und die Klingenlänge / Klinge Breite-Verhältnis nicht (p &lt;0,05). Unsere Daten zeigten, dass LeafJ Plugin nützlich für Studien auf Blatt Vermeidung von Schatten zählen Reaktionen (Abbildung 2). 3. Genauigkeit und Geschwindigkeit der LeafJ Plugin Um die Leistung des LeafJ plugin in größeren Daten zu bestimmen setzt verglichen wir Betriebszeit und Genauigkeit zwischen Handbuch und Plugin-Messungen. Für manuelle Messungen definierten wir die Blattstiel / Klinge Grenze als Ort der Flügelbreite schien rasch zu erhöhen. Es dauerte ein erfahrener Forscher einen Durchschnitt von 1<html> 9 min 3 sec zu einer Transparenz mit fünf Werken (ca. 50 Blätter) durch manuelle Messung zu messen, während mit LeafJ es nur 3 min dauerte 20 Sekunden. Gemittelt über 5 Folien, Messen mit dem Plugin betrug 5,7 mal schneller als die manuelle Messung. Die manuelle Messung wurde von einem Forscher mit Erfahrung in der Herstellung viele manuelle Messungen durchgeführt; ein Anfänger wäre deutlich langsamer manuelle Messung, was zu einer noch größeren Vorteil LeafJ. Wir untersuchten Genauigkeit durch Vergleich der Daten aus den beiden Methoden, die Daten waren hoch für alle Blätter korreliert (Abbildung 3). Von den 3.532 Datenpunkte wurden 172 (4,9%), die starke Unterschiede zwischen den Methoden (belegt indem Ausreißer auf den Korrelationskurven) zeigte. Wir analysierten die Ursache dieser Ausreißer. Von 172 Ausreißer waren 29 aufgrund von Fehlern bei LeafJ plugin Messung und 143 waren aufgrund von Fehlern bei der manuellen Messung. Dieser Fehler Analyse zeigte auch, Genauigkeit plugin Messung. jove_step &quot;&gt; 4. Cell Size and Cell Anzahl Measurement Unabhängig von LeafJ entwickelten wir auch eine effiziente Arbeitsabläufe für Messzelle Anzahl und Größe. Theoretisch Zellzahl und Größe können verwendet werden, um mutierten Pflanzen in neun Kategorien zu klassifizieren, wenn sie mit Wildtyp verglichen werden, (1) kleineren Zellen mit einer verringerten Größe Zellzahlen, (2) kleineren Zellen mit normaler Zellzahlen, (3) kleineren Zellen mit erhöhter Zell Zahlen (4) normalen Zellgröße mit verminderter Zellzahlen, (5) normalen Zellgröße mit normaler Zellzahlen, (6) normalen Zellgröße mit verminderter Zellzahlen, (7) größere Zellgröße mit verminderter Zellzahlen, (8) größeren Zellgröße mit normaler Zellzahlen, (9) größere Zellgröße mit erhöhter Zellzahl 15,16. Wir maßen Blattzelle Parameter in 67 Genotypen von Arabidopsis thaliana mit unseren Tablet-basierte Zellgröße und Zellzahl Messverfahren. Wir maßen Zellgröße von 8.629 Zellen aus 877 Blätter von 224 Pflanzen. Multipliziert Zelldichte by Blattfläche (gemessen LeafJ) schätzten wir gesamten Blattfläche Zellzahl Daten 438 Blätter von 219 Pflanzen. Unsere Analyse brachte diese Genotypen in sechs der neun möglichen Kategorien (F ig. 4). Die größte Kategorie war (5): normale Zelle Größe und Anzahl; zweitgrößten war (8): größer Zellgröße mit normalen Zellzahl. Obwohl Nachbereitung erforderlich ist, bedeutet dies, dass unsere Tablet-basiertes Verfahren verwendet werden, um Mutanten auf Blattzelle Größe und Anzahl der Grundlage kategorisieren. <img alt="Abbildung 1" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein Beispiel Blattstiel / Blattspreite Grenze Erkennung und Benutzeroberfläche. Beachten Sie, dass LeafJ können Blattstiel / Blattspreite Grenze automatisch zu definieren (Abbildung 1B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50028/50028fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere FIGU anzeigen</a>wieder. <img alt="Abbildung 2" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig2.jpg" /> Abbildung 2. LeafJ Plugin konnte Vermeidung von Schatten zählen Reaktionen in verschiedenen Blatt-Parameter zu erkennen. Blatt 3 zu Blatt 6 aus sieben Wildtyp-Pflanzen (Arabidopsis thaliana Columbia Ökotyp) unter jeder Bedingung (Sonne und Schatten) wurden untersucht. Von links oben nach rechts unten, sind die y-Achsen-Einheiten mm, mm, mm, mm 2, Verhältnis von Blattstiel Länge Klingenlänge, und das Verhältnis der Klingenlänge zu Klingenbreite. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50028/50028fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig3.jpg" /> Abbildung 3. LeafJ Plugin ist sehr genau. Correlation von Daten aus manuellen Messung und LeafJ plugin Messung von 3.532 Datenpunkte. Jeder Punkt steht für ein Blatt. Grüne Punkte stehen für die 170 Ausreißer in dieser Grafik. Achsen der Blattfläche ist mm 2 alle anderen sind mm. Zahlen vor jedem Parameter repräsentieren Blattstellung (dh &quot;3&quot; ist das dritte Blatt). <img alt="Abbildung 4" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig4.jpg" /> Abbildung 4. Streudiagramm des Blattes Zellfläche und Blatt Zellzahl unter 67 Genotypen von Arabidopsis thaliana. Jeder Punkt repräsentiert die Phänotypen von jedem Genotyp im Schatten Zustand gewachsen. (1) kleinere Zellgröße mit verminderter Zellzahlen, (2) kleinere Zelle: Pflanzen wurden in neun Kategorien auf ihre Differenz aus dem Wildtyp (Col) als durch ein lineares Modell gemischten Effekten und Multiple-Tests korrigiert p-Werte bestimmt klassifiziert Größe mit Normal Zellzahl, (3) kleinere Zellgröße mit erhöhter Zellzahl, (4) normalen Zellgröße mit verminderter Zellzahl, (5) normalen Zellgröße mit normalen Zellzahl, (6) normalen Zellgröße mit verminderter Zellzahl, (7 ) größere Zellgröße mit verminderter Zellzahl, (8) größere Zellgröße mit normalen Zellzahl, (9) größere Zellgröße mit erhöhter Zellzahl. &quot;*&quot; Zeigt der Phänotyp der Wildtyp (Col).

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LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

Demonstration der wichtigsten Methoden für hohen Durchsatz Blatt Messungen. Diese Methoden können verwendet werden, um Blatt Phänotypisierung zu beschleunigen, wenn das Studium vieler Pflanzen-Mutanten oder anderweitig Siebanlagen für Blatt Phänotyp werden.

LeafJ: Ein ImageJ Plugin für Semi-automatisierte Blattform Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

28.2K Aufrufe.  University of California Davis. Demonstration der wichtigsten Methoden für hohen Durchsatz Blatt Messungen. Diese Methoden können verwendet werden, um Blatt Phänotypisierung zu beschleunigen, wenn das Studium vieler Pflanzen-Mutanten oder anderweitig Siebanlagen für Blatt Phänotyp werden.

Serie: LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Forschung

Biologie

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to achieve a high stomatal conductance (gs) to capture CO2 for photosynthesis, water is lost by transpiration1,2. Water evaporating from the airspaces is replaced from cell walls, in turn drawing water from the xylem of leaf veins, in turn drawing from xylem in the stems and roots. As water is pulled through the system, it experiences hydraulic resistance, creating tension throughout the system and a low leaf water potential (&Psi;leaf). The leaf itself is a critical bottleneck in the whole plant system, accounting for on average 30% of the plant hydraulic resistance3. Leaf hydraulic conductance (Kleaf = 1/ leaf hydraulic resistance) is the ratio of the water flow rate to the water potential gradient across the leaf, and summarizes the behavior of a complex system: water moves through the petiole and through several orders of veins, exits into the bundle sheath and passes through or around mesophyll cells before evaporating into the airspace and being transpired from the stomata. Kleaf is of strong interest as an important physiological trait to compare species, quantifying the effectiveness of the leaf structure and physiology for water transport, and a key variable to investigate for its relationship to variation in structure (e.g., in leaf venation architecture) and its impacts on photosynthetic gas exchange. Further, Kleaf responds strongly to the internal and external leaf environment3. Kleaf can increase dramatically with irradiance apparently due to changes in the expression and activation of aquaporins, the proteins involved in water transport through membranes4, and Kleaf declines strongly during drought, due to cavitation and/or collapse of xylem conduits, and/or loss of permeability in the extra-xylem tissues due to mesophyll and bundle sheath cell shrinkage or aquaporin deactivation5-10. Because Kleaf can constrain gs and photosynthetic rate across species in well watered conditions and during drought, and thus limit whole-plant performance they may possibly determine species distributions especially as droughts increase in frequency and severity11-14.
We present a simple method for simultaneous determination of Kleaf and gs on excised leaves. A transpiring leaf is connected by its petiole to tubing running to a water source on a balance. The loss of water from the balance is recorded to calculate the flow rate through the leaf. When steady state transpiration (E, mmol &bull; m-2 &bull; s-1) is reached, gs is determined by dividing by vapor pressure deficit, and Kleaf by dividing by the water potential driving force determined using a pressure chamber (Kleaf= E /- &Delta;&psi;leaf, MPa)15.
This method can be used to assess Kleaf responses to different irradiances and the vulnerability of Kleaf to dehydration14,16,17.

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

We describe a relatively rapid (30 min) and realistic method for simultaneously measurement of leaf hydraulic conductance (Kleaf) and stomatal conductance (gs) for transpiring excised leaves. The method can be modified to measure the light and dehydration responses of Kleaf and gs.

Measurement of Leaf hydraulische Leitfähigkeit und stomatäre Leitfähigkeit und ihre Antworten auf Bestrahlungsstärke und Dehydration Mit dem Evaporative Flux-Methode (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secondary Structure Prediction Mit High-Throughput-SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, morphological leaf traits have the potential to summarize plants strategies in terms of water use efficiency, growth pattern and nutrient use. The leaf economics spectrum (LES) is a recognized framework in functional plant ecology and reflects a gradient of increasing specific leaf area (SLA), leaf nitrogen, phosphorus and cation content, and decreasing leaf dry matter content (LDMC) and carbon nitrogen ratio (CN). The LES describes different strategies ranging from that of short-lived leaves with high photosynthetic capacity per leaf mass to long-lived leaves with low mass-based carbon assimilation rates. However, traits that are not included in the LES might provide additional information on the species&#39; physiology, such as those related to stomatal control. Protocols are presented for a wide range of leaf functional traits, including traits of the LES, but also traits that are independent of the LES. In particular, a new method is introduced that relates the plants&#8217; regulatory behavior in stomatal conductance to vapor pressure deficit. The resulting parameters of stomatal regulation can then be compared to the LES and other plant functional traits. The results show that functional leaf traits of the LES were also valid predictors for the parameters of stomatal regulation. For example, leaf carbon concentration was positively related to the vapor pressure deficit (vpd) at the point of inflection and the maximum of the conductance-vpd curve. However, traits that are not included in the LES added information in explaining parameters of stomatal control: the vpd at the point of inflection of the conductance-vpd curve was lower for species with higher stomatal density and higher stomatal index. Overall, stomata and vein traits were more powerful predictors for explaining stomatal regulation than traits used in the LES.

Unraveling how physiology and morphology are linked allows a deeper understanding of mechanistic functioning of plant leaves. We present both a procedure to derive parameters of stomatal regulation from stomatal conductance measurements and correlations with traditional functional leaf traits.