Ringraziamo Susan Farmer e il personale della struttura di ricerca zebrafish UAB per la cura zebrafish. Finanziamenti erogati dai fondi di start-up del Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia.

NOTA: Questo protocollo è stato approvato dalla University of Alabama a Birmingham Institutional Animal Care ed uso comitato. 1. Allevamento Zebrafish e collezioni Egg <ol><li> Tre giorni prima di iniziare esposizioni chimiche, montare vasche di allevamento con divisori per maschi e femmine separati. Riempire ogni metà serbatoio con acqua sistema di acquacoltura. Utilizzando una rete, trasferire Tg (5xERE: GFP) i pesci c262/c262 a vasche di allevamento, mettendo 2 maschi e 3 femmine in ciascun serbatoio separato da un divisorio. Mettere un coperchio su ogni serbatoio e l&#39;etichetta con la data e le tensioni da attraversare. </li><li> La mattina seguente, rimuovere tutte le barriere e inclinazione deflettori per creare una zona poco profonda ad una estremità della vasca di allevamento. Lasciare zebrafish per accoppiarsi, la raccolta di embrioni a intervalli di 10 min per assicurare precisione messa in scena dello sviluppo. Uova Clean di risciacquo attraverso un colino da tè con E3B medio e embrioni filo delicatamente in piastre di Petri. Ritorno pesci adulti di permanenteserbatoi. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, ordinare, contare, e rimuovere gli embrioni non fecondate, anomali o danneggiati. Luogo embrioni in piastre di Petri in E3B medio e casa a 28,5 ° C con 14:10 di luce: ciclo scuro. Densità embrione può influenzare lo sviluppo. Mettere non più di 100 embrioni in un piatto mm 100 x 35 e non più di 50 embrioni in un piatto mm 60 x 15. </li><li> Entro il 24 hpf, sostituire il supporto con E3B contenente 200 mM 1-fenil 2-tiourea (PTU). PTU previene la formazione di pigmenti e mantiene embrioni di zebrafish e larve trasparenti per una migliore chiarezza di immagine. ATTENZIONE: concentrato PTU magazzino è pericoloso; indossare i guanti quando si effettua soluzione E3B + PTU. </li><li> Al 1 ° giorno dopo la fecondazione (dpf), rimuovere manualmente il corion da ogni embrione utilizzando una pinza sottile. Il corion non sembra influenzare la penetrazione degli estrogeni, tuttavia rimozione migliora la nitidezza delle immagini. Non vi è alcuna necessità di rimuovere chorions dal supporto. NOTA: In alternativa alla dechorionation manuale, lotti di embrioni possono essere Chémically dechorionated usando 1 mg / ml pronasi trattamento, come descritto in precedenza 11. </li></ol> 2. Trattamento chimico di embrioni <ol><li> Il giorno prima del trattamento, preparare soluzioni madre di ogni prodotto chimico in concentrazione di 1.000 volte in DMSO (o solvente appropriato). Ad esempio, per esporre embrioni per 10 pM bisfenolo A (BPA), preparare una soluzione madre BPA 10 mM in 100% DMSO. Questo assicura concentrazione DMSO uniforme in ogni trattamento e permette una 1:1000 diluizione non tossico di DMSO per servire come un controllo del veicolo. Le soluzioni Negozio di archivi a -20 ° C. Per questo protocollo, embrioni saranno esposti a 1 mM e 10 mM BPA, 18,5 nM e 1,85 pM genisteina, 367 nM di estradiolo (controllo positivo) e il veicolo (0,1% DMSO, controllo negativo). ATTENZIONE: Sostanze chimiche come il BPA e estradiolo sono pericolosi e possono avere effetti deleteri sul feto umano. Maneggiare interferenti endocrini con cura e usare sempre un equipaggiamento di protezione personale.</li><li> Il giorno del trattamento, disgelo preparato archivi soluzioni chimiche. Diluire 1:1.000 pipettando 1 ml E3B + PTU in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e l&#39;aggiunta di 1 ml di soluzione madre chimica. Vortex vigorosamente. Diluire DMSO 1:1000 in E3B + PTU come un controllo del veicolo. Utilizzare 1 mL E3B + PTU in una provetta da 1,5 ml come un controllo non trattato. </li><li> Usando una grande pipetta di plastica foro, trasferimento di embrioni da piastre di Petri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, 3 embrioni per pozzetto, 3 pozzi per ogni condizione. Per evitare l&#39;evaporazione durante il trattamento prolungato, omettere embrioni da righe e colonne esterne della piastra (righe A ed E, colonne 1 e 12). Pozzi esterni possono essere riempiti con 300 ml di E3B + PTU. Etichettare il coperchio piatto in modo appropriato. </li><li> Rimuovere i supporti da ogni pozzetto con una multa a punta pipetta di trasferimento di plastica. Lavorare velocemente per evitare di seccare gli embrioni. </li><li> Aggiungere 200 ml di soluzione di trattamento in corrispondenti bene. Mettere il coperchio underneath la piastra come guida per garantire aggiunta di trattamenti nei pozzetti appropriati. Vortex ogni provetta prima di pipettare di distribuire il prodotto chimico in soluzione. Visivamente confermare ogni embrione è nella soluzione di trattamento. Se gli embrioni sono sul lato del pozzo, utilizzare una pipetta pulita per lavarli nel pozzetto con la soluzione di trattamento. </li><li> Porre la piastra in incubatore a 28,5 ° C. Gli embrioni saranno analizzate per fluorescenza a 72 HPF. </li></ol> 3. Automated Imaging di embrioni in piastre con 96 pozzetti <ol><li> Anestetizzare embrioni aggiungendo 10 ml di 4 mg / ml tricaine a ciascun pozzetto. NOTA: Anestetizzare gli embrioni prima di imaging. A 24-96 hpf, zebrafish esporre movimento spontaneo e una risposta ad uno stimolo alla fonte di luce che cambia durante l&#39;acquisizione delle immagini. Anestetizzante embrioni riduce il movimento durante l&#39;imaging. </li><li> Posizionare la piastra a 96 pozzetti in fase motorizzato e calibrare lo stadio. Utilizzando Zeiss Zen Blu software 2011 per la microscopia automaticamentesu e controllo, selezionare l&#39;opzione porta-campioni e selezionare multiwell 96. Selezionare Calibra. Seguire le istruzioni graduali per calibrare il palco. NOTA: Non deselezionare il pulsante di piastrelle dopo questo passaggio. Se il pulsante piastrelle è deselezionata, le impostazioni di calibrazione possono essere persi e la piastra a 96 pozzetti dovranno essere ricalibrato. </li><li> Utilizzando un obiettivo 10x e il campo chiaro (BF) impostazione, identificare un embrione controllo positivo e configurare le impostazioni di esposizione appropriato per BF e canali GFP, facendo in modo che il segnale di fluorescenza non è saturare la fotocamera. Concentrarsi su un unico embrione e programmare il microscopio per acquisire 3 totali Z-sezioni, una immagine 50 pm sopra e una 50 micron sotto il piano focale corrente. NOTA: Poiché i vari tessuti occupano diversi piani focali, questo farà sì che per ogni immagine zebrafish vengono catturate con il cuore e il fegato a fuoco. </li><li> Impostare i parametri del software per acquisire un&#39;immagine in maiolica con GFP e BF channels. Nella scheda di acquisizione, selezionare la configurazione avanzata. Selezionare le regioni piastrelle, poi le piastrelle. Scegli l&#39;opzione cerchio bene. NOTA: Piastrelle viene utilizzato per creare un&#39;immagine composita di ogni bene. Un campo di vista singolo cattura solo una piccola parte di ogni pozzetto. La funzione di segmentazione in grado di catturare automaticamente aerei adiacenti da ciascun pozzetto campi di vista, creando un&#39;immagine composita di tutto il bene. È quindi possibile catturare automaticamente 96 immagini composite per piastra, dove ogni immagine composita contiene diverse decine di immagini singole di un singolo pozzetto. </li><li> Selezionare vettore e fattore di riempimento del 90%. Selezione di un fattore di riempimento del 90% di catturare immagini multiple dei pozzetti scelti in modo che il 90% della superficie di ciascun pozzetto sarà visibile nell&#39;immagine composita. NOTA: Quando si seleziona fattore di riempimento, un diagramma verrà visualizzato rappresentante l&#39;area da acquisire. Selezionare una percentuale che includerà la zona del pozzoche è appropriato per l&#39;esperimento. </li><li> In Opzioni, selezionare la quantità di sovrapposizione desiderato. NOTA: Quando cucire insieme le piastrelle per una singola immagine rappresentativa, una sovrapposizione di 5-10% consente una cucitura uniforme tra le immagini. Tuttavia, se l&#39;immagine cuciture è inutile, con una sovrapposizione 0% ridurrà il tempo di imaging. Uso 90% fattore di riempimento e 5% di sovrapposizione, un&#39;immagine composita di un singolo pozzetto consiste di 59 immagini singole. </li><li> Inizia imaging. Il microscopio acquisirà automaticamente le immagini. </li><li> Ispezionare manualmente immagini composite di ogni pozzetto per fluorescenza tessuto-specifico (Figura 1). </li><li> NOTA: E &#39;meglio iniziare con il controllo positivo per confermare che l&#39;esposizione chimica ha lavorato prima di osservare i pozzi trattamento sperimentale. </li></ol> 4. Manuale Acquisizione Immagine di embrioni in piastra a 96 pozzetti NOTA: Per confermare i risultati, utilizzare un obiettivo 20x lunga distanza di lavoro a corrente alternataquaderno immagini più dettagliate manualmente (Figura 2). <ol><li> Utilizzando un obiettivo 20x e il campo chiaro (BF) impostazione, identificare un embrione controllo positivo e configurare le impostazioni di esposizione per i canali BF e GFP in modo appropriato, facendo in modo che il segnale di fluorescenza non è saturare la fotocamera. </li><li> Identificare le singole embrioni e catturare immagini manualmente. NOTA: Una volta che le impostazioni di esposizione sono state selezionate per l&#39;embrione controllo positivo, non modificare le impostazioni. Questo consente un confronto dell&#39;intensità di fluorescenza come ogni immagine viene catturata in condizioni uniformi. </li></ol>

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	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive un metodo semplice per automaticamente immagine di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish. Il protocollo è stato sviluppato utilizzando un Zeiss Axio Observer. Z1 con Zen software Blu 2011, ma la tecnica può essere adattata utilizzando qualsiasi microscopio invertito con un palco motorizzato e software di controllo del microscopio in grado di eseguire piastrelle per creare immagini composite. Dotare un microscopio invertito con una fase motorizzato può fornire una pratica alternativa meno costosa per l&#39;acquisto di attrezzature specializzate per lo screening ad alto contenuto. Fasi motorizzate variano da alcune migliaia a decine di migliaia di dollari, a seconda della marca e del modello del microscopio e della qualità del palco. Ci sono diversi passaggi critici all&#39;interno del protocollo. Alcune sostanze chimiche sono sensibili alla luce, quindi può essere utile per incubare gli embrioni nel buio durante il trattamento. Embrioni di zebrafish sono sensibili alla disidratazione. Pertanto, per chimicocal esposizioni dura più di un giorno è fondamentale per riempire i pozzetti lungo i bordi della piastra a 96 pozzetti con mezzi per limitare l&#39;evaporazione (protocollo punto 2.3). E &#39;anche importante assicurare che la fase è attentamente calibrata (protocollo passo 3.2). Un errore comune è quello di mettere il piatto sul palco senza garantire completamente la piastra. In questo caso, la posizione della piastra sulla scena può cambiare quando la fase muove, che potrebbe causare alcuni pozzetti essere ripreso parzialmente o per niente. Quando l&#39;imaging diversi piatti in successione, non è assolutamente necessario ricalibrare la fase per ciascuna piastra, purché le piastre sono dello stesso produttore e sono tutti posizionati nella fase in orientamenti identici. Quando si impostano i parametri di segmentazione automatizzate immagine (protocollo step 3.5), assicurarsi che la maggioranza di ogni pozzetto sarà ripreso. A 3 dpf e anziani, larve di zebrafish tendono a posizionarsi in prossimità dei bordi del WELl, quindi un fattore di riempimento del 90% è raccomandato per assicurare che i bordi di ciascun pozzetto saranno visualizzate. Tuttavia, maggiore è il fattore di riempimento più lungo è il tempo di acquisizione dell&#39;immagine. È possibile eseguire un algoritmo di cucitura sulle immagini composite per migliorare la risoluzione. Se un algoritmo di cucitura deve essere eseguito, quindi impostare parametri di segmentazione per includere un&#39;immagine sovrapposizione 5-10% (protocollo punto 3.6). Maggiore è la sovrapposizione, migliori sono le prestazioni dell&#39;algoritmo cucitura. In alcuni casi, una sovrapposizione del 10% può consentire cuciture per produrre un&#39;immagine informativo per analisi che non richiede ulteriore visualizzazione utilizzando un obiettivo ingrandimento maggiore. Tuttavia, maggiore è la sovrapposizione più lunga acquisizione immagine assume, come più immagini sarà catturato per pozzetto. Una sovrapposizione dello 0% può essere utilizzato per ridurre il tempo di acquisizione dell&#39;immagine e ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce fluorescente e photobleaching. In questo caso, catturare le immagini più dettagliate di selezionare i pozzetti con un objecti 20xve (Figura 2). Immagine tempo di acquisizione per questo protocollo dipenderà dai parametri dell&#39;esperimento. Acquisizione delle immagini utilizzando i parametri di questo protocollo (90% fattore di riempimento, 5% di sovrapposizione, tre z-sezioni per immagine catturata e un tempo di esposizione di 50 msec per il canale GFP e 1 msec per il canale campo chiaro) batte tre minuti e 50 secondi per pozzetto. Pertanto, è possibile schermare 60 pozzetti in tre ore e cinquanta minuti. E &#39;fattibile per lo screening di 180 pozzi al giorno, o 60 composti unici in triplice copia. Questo protocollo permette l&#39;imaging automatico per tessuti fluorescenza specifica ma presenta diverse limitazioni. Widefield fluorescenza manca la risoluzione del confocale utilizzato in molte tecniche di screening ad alto contenuto. Inoltre, fluorescenza quantificazione è difficile a causa della elevata variabilità nella orientamento di ogni zebrafish all&#39;interno di un pozzo. Questo potrebbe essere evitato l&#39;imaging zebrafish in uniformecondizioni di orientamento, per esempio utilizzando stampi o micropiastre con pozzi che costringono embrioni di zebrafish in orientamenti uniformi 5,10. Il tempo di acquisizione dell&#39;immagine limita il numero di pozzetti che possono essere proiettati al giorno a 180. Screening 180 pozzetti al giorno è un miglioramento significativo rispetto di imaging manuale. Tuttavia, i metodi tipici high throughput possono schermare una media di 10.000 pozzetti al giorno ma richiedono workstation complessi e costosi. Questo protocollo rappresenta una pratica, meno costosa di screening ad alto contenuto che può essere facilmente adattato da laboratori con un microscopio a fluorescenza invertito widefield. Il metodo di imaging qui descritto permette l&#39;analisi di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni che non sono stati accuratamente montato o orientato, che migliora drasticamente la velocità e la facilità di preparazione dei campioni. Immagini composite possono essere archiviate per riferimento. Questo protocollo è stato sviluppato per consentire ad alta produttività di screening of tessuto-specifici ligandi del recettore degli estrogeni di librerie chimiche e campioni di acqua ambientale. In alternativa, questo protocollo di imaging potrebbe essere utilizzato per schermare qualsiasi reporter fluorescente per l&#39;attività tessuto-specifica.

Zebrafish transgenici sono stati sviluppati che consentono la visualizzazione diretta di attività in vie di segnalazione, quali fattori di crescita dei fibroblasti 1, acido retinoico 2 e 3 estrogeni, in embrioni vivi. Tali strumenti consentono di screening per sostanze chimiche che perturbano vie di segnalazione (dosati come cambiamento di intensità di fluorescenza) o per le sostanze chimiche che modulano segnalazione in modo tessuto-specifico (cambiamento di localizzazione fluorescenza) 4. La cattura delle immagini automatica aumenta il throughput di schermi chimici drammaticamente 5,6. Schermi che la fluorescenza saggio automaticamente in zebrafish vivo spesso si basano su costosi, attrezzature specializzate. Cosiddetto screening ad alto contenuto offre il vantaggio di alta risoluzione, imaging quantitativo ma a costo di usare lettori di piastre specializzati attrezzati per microscopia confocale 7,8. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di dosaggio fluorescenza automaticamente tessuto-specifica in embrioni di zebrafishin una piastra a 96 pozzetti utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard. Fluorescenza tessuto-specifica può essere distinto con questa tecnica e può essere un approccio ragionevole per i laboratori che non hanno accesso ai lettori di piastre specializzati o apparecchiature ad alto contenuto di screening. In questo protocollo, utilizziamo l&#39;imaging automatizzato per rilevare il recettore degli estrogeni tessuto-specifica (ER) agonisti in zebrafish vivo in tre giorni dopo la fecondazione (dpf). La linea transgenica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contiene 5 tandem risposta estrogenica elemento sequenze di DNA (ERE) a monte della proteina fluorescente verde (GFP) 3. In assenza di ligando, ER sono normalmente inattive. Legame del ligando innesca un cambiamento conformazionale, che permette recettori legano il DNA ERE e regolano la trascrizione 9. 5xERE: pesce GFP possono essere usati per lo screening librerie chimiche per modulatori ER e possono essere usati per lo screening campioni di acqua ambientale per contaminanti estrogenici.

<table><tbody><tr><td>Plastic transfer pipettes; wide bore</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes; fine tip</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>96-well, round, flat bottom plates</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>100 x 35 mm plates</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>35 x 60 mm plates</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &amp;mu;M in E3B&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td></tr><tr><td>20x long working distance objective</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td></tr><tr><td>Axiocam HRm digital camera</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011 microscope control software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MB-1; 25 grams</td><td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td></tr><tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60X E3 SOLUTION:&lt;br/&gt; NaCl&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 17.2 grams&lt;br/&gt; KCl&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.76 grams&lt;br/&gt; CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 2.9 grams&lt;br/&gt; MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp; - 4.9 grams or MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; - 2.39 grams&lt;br/&gt; Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH:&lt;br/&gt; 60X E3&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 150 ml&lt;br/&gt; 2% methylene blue&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 100 &amp;mu;l&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Bring to 9 liters with Milli-Q water&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

Embrioni di zebrafish sono un potente strumento per lo screening su larga scala di piccole molecole. Zebrafish transgenico che esprimono proteine ​​reporter fluorescenti sono spesso utilizzati per identificare le sostanze chimiche che modulano l&#39;espressione genica. Schermi chimici che saggio fluorescenza in zebrafish vivo spesso si basano su costosi, attrezzature specializzate per lo screening ad alto contenuto. Descriviamo una procedura utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard con un palco motorizzato per l&#39;immagine automaticamente embrioni di zebrafish e rilevare la fluorescenza tessuto-specifica. Utilizzando zebrafish transgenico che segnala l&#39;attività del recettore degli estrogeni attraverso l&#39;espressione di GFP, abbiamo sviluppato una procedura semi-automatica per schermare per ligandi del recettore degli estrogeni che attivano il giornalista in maniera tessuto-specifica. In questo video si descrivono le procedure per arraying embrioni di zebrafish a 24-48 ore dopo la fecondazione (HPF) in una piastra a 96 pozzetti e l&#39;aggiunta di piccole molecole che legano i recettori degli estrogeni. A 72-96 hpf, immagini di ogni bene dal&#39;intera piastra vengono raccolte automaticamente e controllato manualmente per fluorescenza tessuto-specifica. Questo protocollo dimostra la capacità di rilevare estrogeni che attivano i recettori in valvole cardiache ma non nel fegato.

La Figura 1 mostra immagini composite di singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Ogni immagine composita è composto di 59 immagini singole con 5% immagine sovrapposizione. Si noti che il zebrafish vivo sono orientati in modo casuale all&#39;interno di ogni bene, ma siamo in grado di distinguere la fluorescenza nel cuore dal fegato. Immagini Brightfield sono utili come riferimenti per valutare l&#39;orientamento zebrafish e visualizzare anomalie morfologiche (Figure 1A e 1C). Imaging automatico utilizzando un obiettivo 10x è usata per selezionare chimici e determinare quale garantisce valutazione manuale con un ingrandimento maggiore. Figura 2 mostra le immagini catturate con un obiettivo lunga distanza di lavoro 20x per un&#39;analisi più dettagliata. Queste immagini sono state scattate subito dopo la scansione automatizzata illustrato nella figura 1 senza rimuovere la piastra dal palco microscopio. Utilizzando un obiettivo 20x, la fluorescenza nel cuore può essere localizzato proprio a val cuoreves (Figure 2C-2F). Occasionalmente, l&#39;orientamento degli embrioni può essere sub-ottimale per catturare le immagini e può portare a risultati ambigui. Posizionamento 3 zebrafish per bene e l&#39;esecuzione di ogni trattamento in triplice copia (protocollo step 2.3) offre molteplici possibilità di visualizzare con precisione la fluorescenza. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51533/51533fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51533/51533fig1.jpg" /> . Figura 1 Automated Imaging composito rivela fluorescenza tessuto-specifica delle valvole cardiache e del fegato Brightfield (A, C) e fluorescenti (B, DH) le immagini di Tg (5xERE: GFP). Embrioni c262/c262 trattati con sostanze chimiche indicate a 2 giorni dopo fecondazione (dpf) e ripreso alle 3 dpf. Ogni pannello mostra un&#39;immagine composita di un singolo bene (composta da 59 singole immagini con il 5%sovrapposizione) da una piastra a 96 pozzetti. A e B, embrioni incubate nello 0,1% DMSO (controllo del veicolo) sono GFP-negativi. CH, embrioni incubati con 100 ng / ml 17β-estradiolo (E2), 1,85 micron genisteina (gen) , o 10 mM BPA mostra fluorescenza nelle valvole cardiache (frecce) e del fegato (punte di freccia), embrioni trattati con 18,5 nM gen o 1 micron BPA mostra fluorescenza valvole cardiache, ma non il fegato. B &#39;, immagine ingrandita digitalmente di una singola larva dalla regione scatola in pannello B. D&#39;, immagine ingrandita digitalmente da regione scatola del pannello D, e così via. Barra della scala = 500 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51533/51533fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51533/51533fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51533/51533fig2.jpg" /> <stron.. g&gt; Figura 2 visualizzazione dettagliata delle valvole cardiache GFP-positive Tg (5xERE: GFP) embrioni c262/c262 esposti a sostanze chimiche indicate in piastra a 96 pozzetti (vedi Figura 1) sono stati ripresi manualmente un ingrandimento maggiore, consentendo la visualizzazione di GFP in le valvole atrioventricolare (frecce) e le valvole aortica (frecce) del cuore. Immagini B, D fluorescenza e brightfield fuse. Tutte le immagini sono vista laterale, anteriore a fianco, dorsale all&#39;inizio. Barra della scala = 50 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51533/51533fig2highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Qui descritto è un protocollo per l&#39;imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Views.  University of Alabama at Birmingham.  Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish. 

Video: Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Neuroscienze

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Marcatura fluorescente delle proteine nelle larve di zebrafish utilizzando CRISPR/Cas9 Knock-In

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Genetica

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo di microscopia a foglio luminoso multiview perfezionato per embrioni di zebrafish

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Strategie per il montaggio di embrioni di zebrafish per la microscopia a foglio luminoso multivista ad alta risoluzione - Tecniche per l'ima

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish