그는 글래드스톤 연구소에서 박사 캐서린 폴라드의 실험실에서 안식년에있는 동안 LeafJ는 JNM에 의해 작성되었습니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (교부금 번호 IOS-0923752)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 식물 재료 이 식물의 성장 프로토콜이 커버 회피 응답을 검출하기위한 목적으로합니다. 니가 제일 좋아하는 조건에서 식물을 성장 할 수 있습니다. <ol><li> 어둠 속에서 4 일 동안 4에 9cm 페트리 요리와 저장소 (계 충화하다)를 ° C로 필터 종이를 흠뻑 물에 Arabidopsis thaliana의 씨앗을 뿌린다. </li><li> 모의 태양 조건에 해당 페트리 요리를 전송 : 1.86에 FR 비율 : 80-100 μE photosynthetically 활성화 방사선 (PAR)과 멀리 빨간 추가 요금이 부과 R을 가지고. 긴 하루를 조건 (16 시간 조명 / 8 시간 어두운) 및 (22)의 일정한 온도 ° C.를 사용하여 씨앗이 발아 할 수 있도록 3 일이 조건에 품다. </li><li> 토양에 germinated 씨앗을 전송, 일광욕 조건에서 식물을 유지. 대규모 실험, 우리는 레이블을 만들기위한 마이크로 소프트 워드 2004 (이상)에서 관리자를 병합 데이터를 사용하여 각 식물을 라벨에 작은 태그를 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 일레븐 일 TR 후토양에 ansfer는 그늘 상태에 식물의 절반을 이동 : 태양 있지만 0.52에 R / FR 비율을 가져다 보완 멀리 붉은 빛으로 동일합니다. </li><li> 추가 십이일 후, 식물 잎 이미지에 대한 준비가되어 있습니다. 당신은 개발의 스냅 샷을 캡처 할 수 있도록 어린 잎은 여전히​​ 확장하는 반면이 단계에서는 기존의 잎이 완전히 성숙했습니다. 당신은 당신의 요구에 따라 다른 발달 시간을 선택 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 해부 잎 이미지 캡처 <ol><li> 다섯 직사각형 프레임이있는 식물 유전자형과 성장 조건과 함께 표시 투명 시트를 준비합니다. 한 프레임 한 공장에서 잎에 해당합니다. Microsoft Excel을이 레이블을 사용하여 일관된 그리드를 인쇄하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 이십육일 오래된 식물의 잎을 해부. </li><li> 검사는 평면 침대 스캐너에서 600 DPI에서 출발합니다. 씨앗에서 출발 참고 투명 시트의 샌드위치에 검은 창에서 세로로 배치해야합니다. 감동 잎을 피다음 절차에 오류를 줄 것이다 검은 창 프레임과 중복 잎 있습니다. </li></ol> 3. LeafJ의 잎 이미지 분석 <ol><li> 다운로드 ImageJ ImageJ의 플러그인 폴더로 LeafJ.jar 파일을 드래그합니다. </li><li> ImageJ 1.45s 이상 14 이미지 파일을 엽니 다. </li><li> &quot;&gt; 분할 채널은 이미지&gt; 색상&quot;에 의해 3 색 채널 (빨강, 녹색, 파랑)로 이미지를 분할하고 파란색 채널의 이미지에 임계 값을 적용 할 수 있습니다. </li><li> 사각형 도구 (그림 1A)하여 한 공장에서 잎을 모두 선택합니다. </li><li> 플러그인 메뉴에서 &quot;LeafJ&quot;를 선택하십시오. </li><li> 나타나는 대화 상자에서이 공장 주석 정보를 선택하십시오. 당신은 할 수&quot;이러한 옵션 수정 &#39;을 클릭하여 여기에 표시되는 기본 값을 편집 할 수 있습니다. </li><li> LeafJ 플러그인을 실행 후에 &quot;OK&quot;버튼을 클릭하기 전에,이자 (ROI) 관리자 창 (, 그림 1B 필요한 경우)의 지역에서 추적 선을 편집 할 수 있습니다. 터치 스크린 태블릿 (예 : 아이 패드 등)이 절차에 유용합니다. iPads는 에어 디스플레이 소프트웨어를 사용하여 외부 모니터로 컴퓨터에 연결 할 수 있습니다. </li><li> 측정 결과 및 Microsoft Excel 또는 이에 상응하는 소프트웨어에 관련 정보 (파일 이름, 꽃 시간에 의해 해부에 의해 측정 등) 보냅니다. </li></ol> 4. ImageJ의 잎 세포 이미지 분석 <ol><li> 해부 해결은 (제 2 단계) 스캔 한 후 참조 15에 설명되어 출발합니다. FAA 고정 잎은 적어도 6 개월 이상에 대해 4 ° C에 보관하실 수 있습니다. </li><li> 현미경 관찰 15 전 1 ~ 2 시간에 클로 랄 하이드레이트 솔루션과 길러 잎에 FAA의 정착액을 변경하여 잎을 해제합니다. </li><li> 마운트 마일에 출발croscope는 trichomes가 직면과 슬라이드. trichomes 또는 정맥 근처의 세포를 피 주요 정맥의 양쪽에 각 잎의 중심 복합 현미경, 이미지 mesophyll 층에 40x 배율을 사용합니다. </li><li> 추적 잎 셀은 터치 스크린 태블릿과 스타일러스 (3 단계에서 설명한대로)의 도움을 ImageJ 투자 수익 (ROI) 관리자 도구에 의해 설명합니다. 세포 이미지 분석 ImageJ의 내장 된 기능을 사용하지만 LeafJ을 필요로하지 않습니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리의 &quot;LeafJ&quot;플러그인은 수동 측정을 통해 처리 할 거의 6 배 증가, 반 자동으로 잎자루 길이의 측정을 할 수 있습니다. 잎자루 길이는 SAS의 중요한 인덱스이며 또한 잠수 저항과 hyponastic 성장 17과 같은 다른 현상의 랜드 마크입니다. 따라서이 플러그인은 식물 연구자의 다양한 유용 할 수 있습니다. 우리 플러그인은 잘 알려진 자바 기반의 무료 소프트웨어, ImageJ에서 구현됩니다. 이 쉽게 크로스 플랫폼 설치를 사용할 수 있습니다. ImageJ가 이미 자바와 ImageJ 매크로 언어 (에 의해 작성되었습니다 플러그인의 큰 도서관이 있기 때문에 프로그램의 수정 용이성 또한 LeafJ 플러그인의 장점 <a href="http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial:start" target="_blank">http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial을 : 시작</a> ). 현재 우리는 Arabidopsis 잎을 테스트하지만, 잎자루 / 잎 블레이드 경계 검출 우리의 알고리즘은 t를 적용 할 수 있습니다O 다른 쌍떡잎 식물은 플러그인의 일부 수정 후 출발합니다. LeafJ 플러그인을 테스트하는 동안, 우리는 14 오류의 대부분은 이러한 데이터 시트 및 / 또는 식물 genotypes의 mislabeling에 복사 결과를 misplacing 인간 실수에서 나온 발견했다. 드문 경우에 잎자루 / 잎 블레이드 경계는 수동으로 수정을 necessitating 복사 및 붙여 넣기 실수의 추가 위험을 생성, 잘못 불렀습니다. 우리는 임계 값 값을 기준으로 데이터를 () (잎의 길이보다 긴 예 petioles)에보고 한 후 이러한 오류를 감지 할 수 (B) 복제 샘플 조건 (예 : &quot;일&quot;또는 &quot;그늘&quot;), 유전자형, 또는 잎의 위치를 찾아서. 우리의 터치 스크린 태블릿 방법은 측정의 정확성과 속도를 촉진. 우리의 방법의 제한은 주 컴퓨터와 터치 스크린 태블릿 간의 통신은 무선 로컬 영역 네트워크 (LAN)의 속도에 의존합니다.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td></td></tr><tr><td> 멀리 붉은 빛 LED </td><td> Orbitec </td><td> 사용자가 만든 </td><td></td></tr><tr><td> 투명도 </td><td> 상 </td><td> HSCA / 5 </td><td></td></tr><tr><td> 스캐너 </td><td> 엡손 </td><td> 엡손 완벽 V700 PHOTO </td><td></td></tr><tr><td> 이미지 J </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr><tr><td> LeafJ </td><td> 관습 </td><td></td><td> <a href="http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab" target="_blank">http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab</a> </td></tr><tr><td> 에어 디스플레이 </td><td> Avatron 소프트웨어 주식회사 </td><td></td><td>빈 &quot;&gt; http://avatron.com/ </td></tr><tr><td> iPad2 </td><td> 애플 </td><td></td><td> <a href="http://www.apple.com/" target="_blank">http://www.apple.com/</a> </td></tr></tbody></table>

leafj: an imagej plugin for semi-automated leaf shape measurement

높은 처리량 phenotyping (phenomics (주) 검토 1 최근 예 2-4 참조)의 기능과 유전자를 연결하기위한 강력한 도구입니다. 잎은 기본 광합성 기관이며, 크기와 모양이 공장 내에 발달 및 환경 다를 수 있습니다. 이러한 이유로 잎 형태에 대한 연구는 가장 반 자동화 phenomics 도구 5,6에 의해 수행됩니다 많은 잎에서 여러 매개 변수의 측정을 필요로합니다. 캐노피 그늘 공장 건축과 생활의 역사에 영향을 미치는 중요한 환경 큐, 응답의 스위트 룸은 총체적으로 그늘 회피 증후군 (SAS) 7이라고합니다. SAS 응답 중 그늘 유도 잎 잎자루의 신장 및 블레이드 지역의 변화는 인덱스 8과 같은 특히 유용합니다. 현재까지, 잎 모양 프로그램 (예 : SHAPE 9, 얇은 판 10, LeafAnalyzer 11 LEAFPROCESSOR 12) 잎 윤곽선을 측정하고 잎 모양을 분류 할 수 있습니다하지만 잎자루 길이를 출력 할 수 없습니다. 잎 petioles의 대규모 측정 시스템의 부족 SAS 연구 phenomics 방식을 저해하고 있습니다. 이 논문에서, 우리는 신속하게 모델 식물 Arabidopsis thaliana의의 잎자루 길이와 잎 블레이드 매개 변수를 측정 할 수 LeafJ라는 새로 개발 된 ImageJ 플러그인을, 설명합니다. 잎자루 / 잎 블레이드 경계의 필요한 수동 보정은 우리가 터치 스크린 태블릿을 사용하는 가끔 잎하십시오. 또한, 잎 세포 모양과 잎 셀 번호는 잎 크기로는 13의 중요한 determinants 있습니다. LeafJ는 별도로 우리는 또한 세포 모양, 면적 및 크기를 측정하기위한 터치 스크린 타블렛을 사용하는 프로토콜을 제시한다. 우리 잎의 특성 측정 시스템은 그늘 회피 연구에 한정되지 않고 잎 phenotyping에 의해 많은 돌연변이 검사 식물의 잎 phenotyping을 가속화합니다.

1. 잎자루과 리프 블레이드 경계의 견적보기 잎 이미지, 그리고 그들의 측정 창 LeafJ의 가장 유용한 기능 중 하나는 잎 블레이드 / 잎자루 경계 (그림 1)의 자동 감지합니다. 다음과 같이 LeafJ 알고리즘은 작동 내장 된 ImageJ ParticleAnalyzer 기능은 사용자 선택의 안쪽 잎의 방향을 찾아 결정하는 데 사용됩니다. 각 잎의 경우 잎의 폭은 잎의 전체 축을 따라 결정됩니다. 그런 다음 축을 따라 각 위치에서 폭의 변화는 실행 창을 (초점 위치에 인접 일곱 위치에 대한 평균 폭은 초점 위치로 말초 일곱 위치에 대한 평균 폭에서 공제됩니다)를 사용하여 결정됩니다. 잎자루 / 블레이드 경계 폭의 변화가 모든 계산 폭의 차이의 90 %보다 더 큰 잎베이스 이외의 첫 번째 위치로 정의됩니다. LeafJ 추가 검사가 reliabi을 증가하는 것이 전화 lity는, 2) 초점 위치로 인접 지역은 큰 변화가없는, 특히 LeafJ도 1)의 폭이 길이 위치의 좁은 5 %를 (이 잎자루베이스에서 탈선 통화를 않도록)를 초과합니다 폭, 그리고 3) 초점 위치로 말초 잎의 20 % 폭의 경계에 인접 20 % 따라서 블레이드하게해야하기 때문에 초점 위치의 경계 경우 초점 위치 (해당시보다 적어도 1백50% 넓은입니다 더 넓은). 일단 LeafJ은 잎자루 / 블레이드 경계를 정의했다 ImageJ 수업 내장 및 방법은 블레이드 지역, 주변, 그리고 순환 성을 결정하는 데 사용됩니다. 내장 ImageJ 방법 또한 블레이드에 타원을 맞게 그 타원 (당시 블레이드 길이와 폭으로 사용)의 전공 및 부전공 축를 계산하는 데 사용됩니다. 잎자루 길이는 잎자루 지역의 중심을 따라 흔적있는 라인에 의해 결정됩니다. 2. 그늘에서 유도 잎자루의 신장의 검색 &lt;/ P&gt; LeafJ 측정은 그늘 방지를 시금에 유용하는지 여부를 묻고, 우리는 임의의 효과로 고정 효과와 복제로 치료와 잎 번호로 혼합 효과 모델을 사용했습니다. 블레이드 순환 성 및 블레이드의 길이 / 날개 폭 비율 (P &lt;0.05)하지 못했습니다 반면에 우리는 그 잎자루 길이, 블레이드 공간, 블레이드 길이, 블레이드 폭과 잎자루 길이 / 날개 길이 비율 크게 그늘 치료에 의해 영향을 받았다고을 발견했다. 우리의 데이터는 LeafJ 플러그인은 잎 그늘 회피 응답 (그림 2)에 대한 연구에 유용 것으로 나타났다. 3. LeafJ 플러그인의 정확성과 속도 큰 데이터의 LeafJ 플러그인의 성능을 결정하는 것은 우리가 작업 시간 및 수동 및 플러그인 측정 사이의 정확도를 비교 설정합니다. 수동 측정을 위해 우리는 잎의 폭이 빠르게 증가 게재 된 곳으로 잎자루 / 블레이드 경계를 정의. 그것은 숙련 된 연구자에게 하나의 평균을했다<html> 그것은 단지 3 분 20 초했다 LeafJ과 동시에 9 분 3 초는, 수동 측정하여 최대 5 개의 식물 (50 잎)와 하나 투명성을 측정합니다. 플러그인이 5.7 배 빠른 수동 측정보다이었습니다을 측정, 5 투명에 걸쳐 평균 한 값입니다. 수동 측정은 많은 수동 측정을 만드는 경험이있는 연구자에 의해 수행되었다, 초보자 LeafJ의 더 큰 장점의 결과로, 수동 측정에서 상당히 느려질 것입니다. 우리는 두 가지 방법의 데이터를 비교하여 정확도를 평가, 데이터는 매우 (그림 3) 모든 잎 매개 변수 상관이되었습니다. 3532 데이터 포인트의 방법 (상관 관계 플롯에 특이점 됨으로써 입증) 사이의 강한 차이를 보여 172 (4.9 %)은 있었다. 우리는이 특이점의 원인을 분석했다. 172 특이점 중 29 LeafJ 플러그인 측정하는 동안 오류에 의한하며, 크기는 143 수동 측정의 오류로 인해했습니다. 이 오류 분석은 또한 플러그인 측정의 정확성을 보여 주었다. jove_step &quot;&gt; 4. 세포 크기와 세포 수 측정 LeafJ의 독립 우리는 또한 휴대폰 번호와 크기를 측정하기위한 효율적인 워크 플로우를 개발했다. 이론적으로 휴대폰 번호와 크기는 야생 유형과 비교했을 때 아홉 카테고리로 돌연변이 식물을 분류하는 데 사용할 수 있습니다, 감소 전화 번호 (1) 작은 셀 크기, (2) 일반 전화 번호가있는 작은 세포, (3) 증가 셀 작은 세포 번호, 감소 셀 번호 (4) 일반 세포 크기, (5) 일반 전화 번호로 정상 세포의 크기, (6) 감소 셀 번호를 일반 셀 크기, (7) 감소 전화 번호가있는 큰 셀 크기, (8) 큰 일반 전화 번호가있는 셀 크기, (9) 증가 전화 번호 15,16가있는 큰 셀 크기입니다. 우리는 우리의 태블릿 기반의 셀 크기 및 전화 번호 측정 방법을 사용하여 Arabidopsis thaliana의 67 genotypes에 잎 세포 매개 변수를 측정. 우리는 224 식물의 잎에서 877 8629 셀의 셀 크기를 측정했습니다. 셀 밀도 B를 곱한Y 잎 면적은 (LeafJ에 의해 측정), 우리는 219 식물에서 438 잎 총 잎 전화 번호 데이터를 추정했다. 우리 분석은 가능한 구 범주 (F IG. 4) 여섯에 이러한 genotypes을 배치. 일반 셀의 크기 및 숫자, 두 번째로 큰 (8)했다 : 가장 큰 범주는 (5)였습니다 일반 휴대폰 번호로 큰 셀 크기입니다. 후속 작업이 필요하지만, 이곳은 우리의 태블릿 기​​반의 방법은 잎 세포의 크기와 수에 따라 돌연변이를 분류하는 데 사용할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. <img alt="그림 1" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig1.jpg" /> 그림 1. 잎자루 / 잎 블레이드 경계 탐지 및 사용자 인터페이스의 예라고 할 수 있습니다. LeafJ는 (그림 1B)이 자동으로 잎 / 잎자루 블레이드 경계를 정의 할 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50028/50028fig1large.jpg" target="_blank">큰 figu을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>다시. <img alt="그림 2" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig2.jpg" /> 그림 2. LeafJ 플러그인은 다양한 잎 매개 변수에 커버 회피 응답을 감지 수 있습니다. 각 조건 (태양과 그늘)에서 일곱 야생 형 식물 (Arabidopsis thaliana 콜롬비아 ecotype)에서 잎 6 잎 3 조사되었다. 오른쪽 아래 왼쪽 상단에서 Y 축 단위는 mm, mm, mm, mm 2, 블레이드 길이 잎자루 길이의 비율, 그리고 블레이드 폭 블레이드 길이의 비율입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50028/50028fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig3.jpg" /> 그림 3. LeafJ 플러그인은 매우 정확합니다. C3532 데이터 포인트에서 수동 측정 및 LeafJ 플러그인 측정의 데이터 orrelation. 각 점은 한 잎을 나타냅니다. 녹색 점은이 그래프에서 170 특이점을 나타냅니다. 잎 영역의 축 2 모든 다른 mm 아르 mm입니다. 각 매개 변수 앞의 숫자는 잎의 위치 (예 : &quot;3&quot;는 세 번째 잎 임) 나타냅니다. <img alt="그림 4" fo:src="/files/ftp_upload/50028/50028fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50028/50028fig4.jpg" /> 그림 4. Arabidopsis thaliana의 67 genotypes 사이에 잎 셀 영역과 잎 전화 번호의 분산 플롯. 각 점은 그늘 조건에서 성장 각 유전자형의 phenotypes을 나타냅니다. 감소 전화 번호 (1) 작은 셀 크기, (2) 작은 셀 : 식물은 P-값을 수정 선형 혼합 효과 모델과 여러 테스트에 의해 결정으로 야생 유형 (열)에서의 차이에 따라 아홉 가지 범주로 분류되었다 규범과 크기야외 휴대폰 번호, (3) 증가 휴대폰 번호가있는 작은 셀 크기, 감소 셀 번호 (4) 일반 세포 크기, (5) 일반 휴대폰 번호로 정상 세포의 크기, (6) 감소 핸드폰 번호로 정상 세포 크기, (7 ) 감소 핸드폰 번호, (8) 일반 전화 번호로 큰 셀 크기, (9) 증가 휴대폰 번호가있는 큰 셀 크기가 큰 셀 크기입니다. &quot;*&quot;와일드 유형 (열)의 표현형 나타냅니다.

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LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

높은 처리량 잎 측정을위한 주요 방법의 시범. 이러한 방법은 잎 표현형하여 많은 식물의 돌연변이 또는 기타 검사 식물을 공부할 때 잎 phenotyping을 가속화하는 데 사용할 수 있습니다.

LeafJ : 세미 자동 리프 형상 측정을위한 ImageJ 플러그인

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

28.2K 조회수.  University of California Davis. 높은 처리량 잎 측정을위한 주요 방법의 시범. 이러한 방법은 잎 표현형하여 많은 식물의 돌연변이 또는 기타 검사 식물을 공부할 때 잎 phenotyping을 가속화하는 데 사용할 수 있습니다.

비디오: LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

연구

생물학

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

작은 하트의 세미 - 자동 광학 도면 분석

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to achieve a high stomatal conductance (gs) to capture CO2 for photosynthesis, water is lost by transpiration1,2. Water evaporating from the airspaces is replaced from cell walls, in turn drawing water from the xylem of leaf veins, in turn drawing from xylem in the stems and roots. As water is pulled through the system, it experiences hydraulic resistance, creating tension throughout the system and a low leaf water potential (&Psi;leaf). The leaf itself is a critical bottleneck in the whole plant system, accounting for on average 30% of the plant hydraulic resistance3. Leaf hydraulic conductance (Kleaf = 1/ leaf hydraulic resistance) is the ratio of the water flow rate to the water potential gradient across the leaf, and summarizes the behavior of a complex system: water moves through the petiole and through several orders of veins, exits into the bundle sheath and passes through or around mesophyll cells before evaporating into the airspace and being transpired from the stomata. Kleaf is of strong interest as an important physiological trait to compare species, quantifying the effectiveness of the leaf structure and physiology for water transport, and a key variable to investigate for its relationship to variation in structure (e.g., in leaf venation architecture) and its impacts on photosynthetic gas exchange. Further, Kleaf responds strongly to the internal and external leaf environment3. Kleaf can increase dramatically with irradiance apparently due to changes in the expression and activation of aquaporins, the proteins involved in water transport through membranes4, and Kleaf declines strongly during drought, due to cavitation and/or collapse of xylem conduits, and/or loss of permeability in the extra-xylem tissues due to mesophyll and bundle sheath cell shrinkage or aquaporin deactivation5-10. Because Kleaf can constrain gs and photosynthetic rate across species in well watered conditions and during drought, and thus limit whole-plant performance they may possibly determine species distributions especially as droughts increase in frequency and severity11-14.
We present a simple method for simultaneous determination of Kleaf and gs on excised leaves. A transpiring leaf is connected by its petiole to tubing running to a water source on a balance. The loss of water from the balance is recorded to calculate the flow rate through the leaf. When steady state transpiration (E, mmol &bull; m-2 &bull; s-1) is reached, gs is determined by dividing by vapor pressure deficit, and Kleaf by dividing by the water potential driving force determined using a pressure chamber (Kleaf= E /- &Delta;&psi;leaf, MPa)15.
This method can be used to assess Kleaf responses to different irradiances and the vulnerability of Kleaf to dehydration14,16,17.

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

We describe a relatively rapid (30 min) and realistic method for simultaneously measurement of leaf hydraulic conductance (Kleaf) and stomatal conductance (gs) for transpiring excised leaves. The method can be modified to measure the light and dehydration responses of Kleaf and gs.

증발 플럭스 방법 (EFM)를 사용 조사량과 탈수에 잎 유압 전도성과 Stomatal 전도성과 응답 측정

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

비행 성능의 정확하고 빠른 측정을위한 개선 된 방법에<em&gt; 초파리</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, morphological leaf traits have the potential to summarize plants strategies in terms of water use efficiency, growth pattern and nutrient use. The leaf economics spectrum (LES) is a recognized framework in functional plant ecology and reflects a gradient of increasing specific leaf area (SLA), leaf nitrogen, phosphorus and cation content, and decreasing leaf dry matter content (LDMC) and carbon nitrogen ratio (CN). The LES describes different strategies ranging from that of short-lived leaves with high photosynthetic capacity per leaf mass to long-lived leaves with low mass-based carbon assimilation rates. However, traits that are not included in the LES might provide additional information on the species&#39; physiology, such as those related to stomatal control. Protocols are presented for a wide range of leaf functional traits, including traits of the LES, but also traits that are independent of the LES. In particular, a new method is introduced that relates the plants&#8217; regulatory behavior in stomatal conductance to vapor pressure deficit. The resulting parameters of stomatal regulation can then be compared to the LES and other plant functional traits. The results show that functional leaf traits of the LES were also valid predictors for the parameters of stomatal regulation. For example, leaf carbon concentration was positively related to the vapor pressure deficit (vpd) at the point of inflection and the maximum of the conductance-vpd curve. However, traits that are not included in the LES added information in explaining parameters of stomatal control: the vpd at the point of inflection of the conductance-vpd curve was lower for species with higher stomatal density and higher stomatal index. Overall, stomata and vein traits were more powerful predictors for explaining stomatal regulation than traits used in the LES.

Unraveling how physiology and morphology are linked allows a deeper understanding of mechanistic functioning of plant leaves. We present both a procedure to derive parameters of stomatal regulation from stomatal conductance measurements and correlations with traditional functional leaf traits.