Sintesi in fase solida

Fonte: Vy M. Dong e Diane Le, Dipartimento di Chimica, Università della California, Irvine, CA

La sintesi in fase solida di Merrifield è un'invenzione vincitrice del premio Nobel in cui una molecola reagente è legata su un supporto solido e subisce successive reazioni chimiche per formare un composto desiderato. Quando le molecole sono legate a un supporto solido, i reagenti e i sottoprodotti in eccesso possono essere rimossi lavando via le impurità, mentre il composto bersaglio rimane legato alla resina. In particolare, mostreremo un esempio di sintesi peptidica in fase solida (SPPS) per dimostrare questo concetto.

La sintesi in fase solida è un metodo utilizzato per semplificare la sintesi delle molecole. Viene spesso utilizzato in chimica combinatoria (una tecnica utilizzata per preparare un gran numero di molecole in un breve periodo di tempo), per generare librerie di composti a causa della facilità di purificazione e sintesi chimica complessiva. La sintesi in fase solida comporta tipicamente l'uso di una resina; un materiale non solubile a base di polimeri, che è pre-funzionalizzato in modo che il blocco di costruzione di partenza può facilmente legarsi. I blocchi di costruzione sono generalmente protetti una volta aggiunti alla resina e possono essere facilmente deprotetti e trattati con il successivo blocco desiderato in soluzione (Figura 1). Una volta che la molecola desiderata è stata sintetizzata, può essere facilmente scissa dalla resina.

Poiché è robusta, la sintesi in fase solida è stata utilizzata per sintetizzare acidi nucleici, oligosaccaridi e, più comunemente, peptidi. Scoperto e riportato da Robert Bruce Merrifield nel 1963, SPPS è diventato il metodo più utilizzato per generare librerie di peptidi. Merrifield ha vinto il premio Nobel 1984 per l'invenzione di SPPS. SPPS può facilmente sfruttare i gruppi di protezioneNFmoc (sensibile alla base) o Boc (sensibile agli acidi) sugli amminoacidi per costruire librerie di peptidi in un breve lasso di tempo. HBTU (agente di accoppiamento) e i-Pr₂EtN (base) attivano il C-terminusdell'amminoacido per l'accoppiamento con un altro amminoacido. I gruppi protettivi fmoc possono essere rimossi dalla 4-metilpiperidina, mentre i gruppi protettivi Boc possono essere rimossi da acidi forti come l'acido trifluoroacetico. In questo esperimento, dimostreremo SPPS attraverso la sintesi di un dipeptide. Useremo il Kaiser test, un metodo qualitativo per testare la presenza di ammine primarie, per monitorare l'andamento della reazione.

Figura 1. Concetto alla base della sintesi peptidica in fase solida (SPPS).

1. Caricamento della resina

1. In un recipiente di sintesi peptidica da 100 ml, aggiungere resina di cloruro di 2-clorotrityl (CTC) (1,1 mmol / g, 0,360 g, 0,400 mmol). Aggiungere 20 mL DMF e lasciarli gonfiare per 30 minuti sotto N_2.
2. Scolare le perle sotto vuoto e aggiungere 10 mL di DMF.
3. Aggiungere 500 mg di Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr₂EtN e mescolare sotto N₂ per 15 minuti.
4. Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere il caricamento con Fmoc-Ala-OH per 15 min.
5. Scaricare il solvente sotto vuoto e lavare le perle con 10 ml DMFunder N₂e scaricare sotto vuoto 3x.

2. Deprotezione del Gruppo Fmoc

1. Aggiungere 10 mL 20% 4-metilpiperidina in DMF e mescolare le perle sotto N₂ per 15 min.
2. Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere la deprotezione.
3. Lavare le perle con 10 mL DMF sotto N₂ e scolare sotto vuoto 3x.

3. Esecuzione del Kaiser Test

1. Eseguire il test Kaiser aggiungendo 1-2 gocce di soluzione A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL piridina), soluzione B (1 g ninidrina, 20 mL n-butanolo) e soluzione C (20 g fenolo, 10 ml n-butanolo)ciascuna in due provette. Una provetta sarà il controllo mentre l'altra monitorerà la reazione.
2. Aggiungere alcune pere di resina dal recipiente di reazione alla provetta di reazione e riscaldare le due provette a 110 °C.
3. Se la deprotezione è completa, il contenuto della provetta diventerà di un colore blu scuro/viola. Se la deprotezione è incompleta o non riuscita, la soluzione rimarrà gialla. Confrontare la provetta di reazione con la provetta di controllo.

4. Accoppiamento dei prossimi elementi costitutivi

1. Scaricare il solvente sotto vuoto.
2. Lavare le perle con 10 ml di N-metil-2-pirrolidone sotto N₂ e scaricare il solvente sotto vuoto.
3. Per iniziare l'accoppiamento successivo, aggiungere 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) e 2,5 mLi-Pr₂EtN e lasciare bollire la resina sotto N₂ per 30 minuti.
4. Scaricare il solvente sotto vuoto.
5. Lavare le perle con 10 mL DMF sotto N₂ e scolare sotto vuoto 3x.
6. Eseguire il test Kaiser (vedere i passaggi 3.1-3.3) per cercare il completamento dell'accoppiamento. Le pere e la soluzione nella provetta devono essere gialle.

5. Scindere il peptide dalla resina

1. Scindere il gruppo Fmoc rimanente utilizzando i passaggi 2.1-2.3.
2. Dopo che il solvente è stato drenato sotto vuoto, aggiungere 40 mL di soluzione di scissione (95% TFA, 2,5% H₂O, 2,5% TIPS) alla resina e bolle sotto N₂ per 3 ore.
3. Posizionare un nuovo pallone ricevente sul sintetizzatore peptidico e scolare la soluzione di FIA contenente il peptide desiderato sotto vuoto nel nuovo matraccio.

6. Precipitazione e I solazione del peptide

1. Separare la soluzione di TFA in 4 flaconcini conici e aggiungere 25 mL di etere freddo (-20 °C) a ciascun flaconcino per precipitare il peptide.
2. Centrifugare i flaconcini (3.000 giri/min, 0-4 °C) per 20 min. Decantare il TFA rimanente e la soluzione di etere dalle fiale coniche e concentrare il precipitato peptidico per consentire il dipeptide desiderato come solido bianco.

Risultati rappresentativi per la sintesi di peptidi in fase solida per la procedura 3.

Tabella 1. Risultati rappresentativi per Procedure 3.

In questo esperimento, abbiamo dimostrato un esempio di sintesi in fase solida tramite SPPS attraverso la sintesi di un dipeptide.

La sintesi in fase solida è ampiamente utilizzata nella chimica combinatoria per costruire librerie di composti per lo screening rapido. È stato comunemente usato per sintetizzare peptidi, oligosaccaridi e acidi nucleici. Inoltre, questo concetto è stato implementato nella sintesi chimica. Poiché è eterogeneo, questi reagenti supportati da solidi possono spesso essere riciclati e riutilizzati nelle reazioni successive.