Síntese de Fase Sólida

Fonte: Vy M. Dong e Diane Le, Departamento de Química da Universidade da Califórnia, Irvine, CA

A síntese em fase sólida de Merrifield é uma invenção vencedora do Prêmio Nobel onde uma molécula reagente é ligada a um suporte sólido e sofre sucessivas reações químicas para formar um composto desejado. Quando as moléculas estão ligadas a um suporte sólido, reagentes e subprodutos em excesso podem ser removidos lavando as impurezas, enquanto o composto alvo permanece ligado à resina. Especificamente, mostraremos um exemplo de síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS) para demonstrar esse conceito.

A síntese em fase sólida é um método usado para simplificar a síntese das moléculas. É frequentemente usado em química combinatória (técnica usada para preparar um grande número de moléculas em um curto período de tempo), para gerar bibliotecas de compostos devido à facilidade de purificação, e síntese química global. A síntese em fase sólida normalmente envolve o uso de uma resina; um material não solúvel, à base de polímero, que é pré-funcionalizado para que o bloco de construção inicial possa se ligar facilmente. Os blocos de construção são geralmente protegidos uma vez que são adicionados à resina, e eles podem ser facilmente desprotegidos e tratados com o próximo bloco de construção desejado na solução(Figura 1). Uma vez que a molécula desejada tenha sido sintetizada, ela pode ser facilmente cortada da resina.

Por ser robusta, a síntese em fase sólida tem sido usada para sintetizar ácidos nucleicos, oligossacarídeos e, mais comumente, peptídeos. Descoberto e relatado por Robert Bruce Merrifield em 1963, o SPPS tornou-se o método mais utilizado para gerar bibliotecas de peptídeos. Merrifield ganhou o Prêmio Nobel de 1984 pela invenção do SPPS. SpPS pode facilmente tirar proveito de grupos de proteção de Fmoc (base sensível) ou Boc (sensível a ácido)Nnos aminoácidos para construir bibliotecas de peptídeos em um curto espaço de tempo. HBTU (agente de acoplamento) e i-Pr₂EtN (base) ativam o C-terminus do aminoácido para acoplamento com outro aminoácido. Grupos de proteção de afoc podem ser removidos por 4-metilpiperidina, enquanto grupos de proteção de Boc podem ser removidos por ácidos fortes, como o ácido trifluoroacético. Neste experimento, demonstraremos SPPS através da síntese de um dipeptídeo. Usaremos o teste Kaiser, um método qualitativo para testar a presença de aminas primárias, para monitorar o progresso da reação.

Figura 1. Conceito por trás da síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS).

1. Carregando a resina

1. Para um vaso de síntese de peptídeos de 100mL, adicione resina de cloreto de clororitil (CTC) de 2ml (1,1 mmol/g, 0,360 g, 0,400 mmol). Adicione 20 mL DMF e deixe-os inchar por 30 minutos sob N_2.
2. Escorra as contas sob vácuo e adicione 10 mL DMF.
3. Adicione 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr₂EtN, e misture sob N₂ por 15 min.
4. Escorra o solvente sob vácuo e repita o carregamento com Fmoc-Ala-OH por 15 min.
5. Escorra o solvente sob vácuo e lave as contas com 10 mL DMFunder N₂, e escorra sob vácuo 3x.

2. Desproteção do Grupo Fmoc

1. Adicione 10 mL 20% 4-metilpiperidina em DMF e mexa as contas sob N₂ por 15 minutos.
2. Escorra o solvente sob vácuo e repita a desproteção.
3. Lave as contas com 10 mL DMF sob n₂ e escorra sob vácuo 3x.

3. Realizando o Teste Kaiser

1. Realize o teste Kaiser adicionando 1-2 gotas de solução A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL pyridine), solução B (1 g ninhydrin, 20 mL n-butanol) e solução C (20 g de fenol, 10 mL n-butanol) cada um em dois tubos de teste. Um tubo de ensaio será o controle, enquanto o outro monitorará a reação.
2. Adicione algumas contas da resina do vaso de reação ao tubo de ensaio de reação e aqueça os dois tubos de ensaio a 110 °C.
3. Se a desproteção estiver completa, o conteúdo do tubo de ensaio ficará uma cor azul/roxo escuro. Se a desproteção estiver incompleta ou falhar, a solução permanecerá amarela. Compare o tubo de ensaio de reação com o tubo de teste de controle.

4. Acoplamento dos próximos blocos de construção

1. Escorra o solvente sob vácuo.
2. Lave as contas com 10 mL N-metil-2-pyrrolidona sob n₂ e escorra o solvente sob vácuo.
3. Para iniciar o próximo acoplamento, adicione 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), HBTU de 610 mg (1,6 mmol) e 2,5 mLi-Pr₂EtN, e deixe a resina borbulhar sob n₂ por 30 minutos.
4. Escorra o solvente sob vácuo.
5. Lave as contas com 10 mL DMF sob n₂ e escorra sob vácuo 3x.
6. Realize o teste Kaiser (ver etapas 3.1-3.3) para procurar a conclusão do acoplamento. As contas e a solução no tubo de ensaio devem ser amarelas.

5. Cleaving o Peptídeo Fora da Resina

1. Adoça o restante do grupo Fmoc utilizando as etapas 2.1-2.3.
2. Depois que o solvente for drenado sob vácuo, adicione 40 mL de solução de decote (95% TFA, 2,5% H₂O, 2,5% TIPS) à resina e bolha sob N₂ por 3h.
3. Coloque um novo frasco receptor no sintetizador de peptídeo e escorra a soluçãoTFA contendo o peptídeo desejado sob vácuo no novo frasco.

6. Precipitação e eu solação do Peptídeo

1. Separe a solução TFA em 4 frascos cônicos e adicione 25 mL de éter frio (−20 °C) a cada frasco para precipitar o peptídeo.
2. Centrifugar os frascos (3.000 rpm, 0-4 °C) por 20 min. Decante a solução tfa restante e éter dos frascos cônicos e concentre o peptídeo precipitado para pagar o dipeptídeo desejado como um sólido branco.

Resultados representativos para a síntese de peptídeos de fase sólida para o Procedimento 3.

Mesa 1. Resultados representativos para Procedure 3.

Neste experimento, demonstramos um exemplo de síntese em fase sólida via SPPS através da síntese de um dipeptídeo.

A síntese em fase sólida é amplamente utilizada na química combinatória para construir bibliotecas de compostos para triagem rápida. Tem sido comumente usado para sintetizar peptídeos, oligossacarídeos e ácidos nucleicos. Além disso, esse conceito foi implementado na síntese química. Por ser heterogêneo, esses reagentes de suporte sólido podem muitas vezes ser reciclados e reutilizados em reações subsequentes.