Elettroforesi capillare

Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton - Università della Virginia

L'elettroforesi capillare (CE) è una tecnica di separazione che separa le molecole in un campo elettrico in base alle dimensioni e alla carica. La CE viene eseguita in un piccolo tubo di vetro chiamato capillare che viene riempito con una soluzione elettrolitica. Gli analiti sono separati a causa delle differenze nella mobilità elettroforetica, che varia con la carica, la viscosità del solvente e le dimensioni. L'elettroforesi tradizionale nei gel è limitata nella quantità di tensione che può essere applicata perché gli effetti di riscaldamento di Joule rovineranno il gel e la separazione. I capillari hanno un ampio rapporto superficie-volume e quindi dissipano meglio il calore. Pertanto, le tensioni applicate per un esperimento di elettroforesi capillare sono piuttosto grandi, spesso 10.000-20.000 V.

L'elettroforesi capillare è utile per separazioni ad alte prestazioni. Rispetto alla cromatografia liquida, le separazioni CE sono spesso più veloci ed efficienti. Tuttavia, l'elettroforesi capillare funziona meglio per separare le molecole cariche, che non è una limitazione della cromatografia liquida. CE ha una maggiore capacità di picco rispetto alla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), il che significa che le separazioni sono più efficienti e possono essere rilevati più picchi. La strumentazione può essere molto semplice. Tuttavia, l'HPLC è più versatile e molte fasi fisse e mobili sono state sviluppate per diversi tipi di molecole.

L'elettroforesi capillare separa le molecole a causa della loro mobilità elettroforetica. La mobilità elettroforetica di una molecola dipende dalla sua carica e da quanto è attratta o respinta dalla tensione e dalla forza di trascinamento per attrito che resiste al movimento. L'attrito è proporzionale al raggio della molecola. Pertanto, la mobilità elettroforetica si basa sulle dimensioni e sulla carica. La velocità che una molecola carica percorre lungo un capillare è il prodotto della sua mobilità elettroforetica e del campo elettrico applicato. Tensioni più elevate portano quindi a velocità più elevate e separazioni più rapide.

La maggior parte degli strumenti di elettroforesi capillare sono impostati con la tensione negativa all'estremità del rilevatore e la tensione positiva all'ingresso. Ciò significa che le molecole caricate positivamente migrano verso il catodo alla fine, mentre le molecole caricate negativamente migrano dall'altra parte. Tuttavia, tutte le molecole sono visibili al rivelatore, perché c'è un flusso di fluido di massa chiamato flusso elettroosmotico. L'ordine di migrazione è quindi molecole caricate positivamente, neutre e quindi caricate negativamente.

Il flusso elettroosmotico è causato dall'applicazione di un'alta tensione a un piccolo capillare di vetro riempito con una soluzione salina. Gli ioni caricati positivamente nella soluzione salina formano un doppio strato con i gruppi di silanoli caricati negativamente sulle pareti del vetro. Quando una tensione negativa viene applicata all'estremità del capillare, tira i cationi dal doppio strato, che tira anche la soluzione intorno ad esso a causa delle forze di attrito. Questo tipo di flusso è a forma di spina e porta a un minore allargamento della banda rispetto ai tappi di flusso a forma di parabola dell'HPLC.

Le molecole neutre scorrono tutte alla stessa velocità del flusso elettroosmotico. Tuttavia, una fase pseudo-stazionaria può essere aggiunta al buffer di esecuzione per formare micelle che le molecole possono partizionare dentro e fuori. Una tipica fase pseudo-stazionaria è il dodecilsolfato di sodio. Le micelle sono caricate negativamente all'esterno, quindi hanno una mobilità elettroforetica, quindi il tempo trascorso nella micella determina il tempo di migrazione. Questa forma di elettroforesi capillare è chiamata cromatografia elettrocinetica micellare (MEKC).

Il rilevamento in CE è simile a quello per HPLC. UV-Vis è generale e non richiede tagging finché la molecola ha un doppio legame. Tuttavia, l'assorbanza dipende dalla lunghezza del percorso, che è piccola per un capillare di 50 μm. Una cella a bolle o una cella z aumenterà la lunghezza del tracciato. La fluorescenza indotta dal laser è un metodo di rilevamento più sensibile. Un laser viene illuminato attraverso una finestra nel capillare e la fluorescenza del prodotto misurato. Mentre la fluorescenza fornisce una sensibilità molto elevata, generalmente richiede che le molecole siano etichettate perché la maggior parte non sono fluorescenti. Il rilevamento elettrochimico e il rilevamento della spettrometria di massa elettrospray stanno guadagnando popolarità. Il problema con uno di questi rivelatori è che l'alta tensione dalla separazione deve essere portata a terra prima del rilevamento, poiché l'elettrochimica e l'elettrospray richiedono l'applicazione di una tensione e la tensione CE può interferire. Nuovi metodi di disaccoppiamento della tensione CE, utilizzando elettrodi per drenare la corrente o una piccola fessura nel capillare, stanno superando queste sfide.

1. Configurazione della strumentazione CE

1. Accendere lo strumento CE e il computer. Utilizzando il software del computer, accendere la sorgente luminosa per l'analisi UV per consentirne il riscaldamento. Alcuni software hanno un indicatore quando la lampada è pronta per l'uso (l'icona della lampada diventa colorata).
2. Creare un file di metodi. Impostare i parametri importanti per l'esecuzione del CE. In questa analisi le temperature della cartuccia e della conservazione del campione sono di 35 °C. La lunghezza d'onda per il rilevamento UV è di 214 nm.
3. Scrivi un programma temporale. Il programma consiste generalmente in fasi di risciacquo (per pulire il capillare prima dell'analisi), fasi di iniezione e quindi una fase di elettroforesi. Per la fase di risciacquo, eseguire 2 risciacqui per 1 minuto utilizzando 20 psi di pressione. Il primo risciacquo è con NaOH, che aiuta ad assicurarsi che i gruppi silanolici sulla parete capillare siano deprototonati. Il secondo risciacquo è con tampone di corsa (tampone borato 0,025 M qui) per assicurarsi che il capillare sia lasciato equilibrato con tampone.
4. Per l'iniezione, l'iniezione di pressione viene utilizzata a 0,5 psi per 5 s.
5. Per la fase di elettroforesi, le condizioni sono tensione di separazione: 20 kV, tempo: 5 min, polarità normale. Per ogni passaggio, indicare anche quale flaconcino è l'ingresso e quale flaconcino è l'uscita. Salvare il file dei metodi dopo aver inserito tutti i parametri.

2. Preparazione degli standard e dei campioni di soda

1. Produrre soluzioni stock da 500 ppm di aspartame, caffeina e acido benzoico in acqua. Fare 50 ml di ciascuno, usando un pallone volumetrico.
2. Produrre una soluzione standard di 150 ppm di aspartame, 150 ppm di caffeina e 100 ppm di acido benzoico in un matraccio volumetrico da 10 ml.
3. Produrre soluzioni standard di caffeina di 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm e 200 ppm in un pallone volumetrico da 10 ml.

3. Eseguire gli esempi sul ce

1. Inserire i flaconcini contenenti campioni standard o di soda nel porta flaconcino del campione. Assicurati di annotare quale campione si trova in quale slot. Due slot hanno il buffer di esecuzione del borato e la soluzione di risciacquo NaOH da 0,1 M.
2. Nel file di metodo, inserire lo slot in cui si trova il primo flaconcino campione.
3. Acquisire una singola esecuzione, assicurandosi di inserire tutte le informazioni sui dati richieste dal programma.
4. Continuare ad acquisire dati, cambiando il flaconcino di ingresso per ciascun campione. Esegui lo standard di combinazione, le 3 concentrazioni di caffeina e un campione di Pepsi e Pepsi dietetica.
5. Inserire il target nello strumento e scegliere lo strumento appropriato.
6. Analizzare i dati sul computer. Calcola le aree di picco e gli standard di sovrapposizione e i campioni reali per aiutare a identificare i picchi. Crea una curva di calibrazione per i dati sulla caffeina.

Gli elettroferogrammi raccolti per i campioni di Pepsi e Pepsi dietetici sono mostrati rispettivamente nelle figure 1 e 2. I tre picchi per caffeina, aspartame e acido benzoico sono osservati nella dieta Pepsi e hanno tempi di migrazione simili a quelli standard. Per la Pepsi normale, è presente il picco di caffeina ma non i picchi di aspartame e acido benzoico. L'analisi CE è veloce in quanto i tempi di migrazione sono di soli 3-4 min.

La curva di calibrazione per la caffeina è mostrata nella Figura 3. Questa curva può essere utilizzata per calcolare la concentrazione di caffeina in ciascun campione.

Figura 1. Analisi CE di Diet Pepsi. I rossi sono standard di caffeina, aspartame e acido benzoico. Il nero è un campione di Pepsi dietetico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Analisi CE di Pepsi. Il nero è un campione di Pepsi mentre il rosso è un campione di standard di caffeina, aspartame e acido benzoico. Non c'è aspartame o acido benzoico, indicando che la soda non è dieta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Grafico di calibrazione della caffeina con CE. Un grafico dell'area di picco rispetto alla concentrazione per gli standard di caffeina misurati con CE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'elettroforesi capillare viene utilizzata per molte separazioni speciali. Ad esempio, viene utilizzato nell'industria farmaceutica per i test di qualità, per assicurarsi che non ci siano prodotti collaterali o interferenti. CE è particolarmente utile per separare i farmaci con un gruppo amminico di base, poiché le pareti del capillare possono essere rese neutre con un pH acido e quindi il farmaco non si attaccherà al capillare.

Una modalità di CE è stata anche utilizzata per sequenziare il genoma umano e separare il DNA. Questa modalità di CE è l'elettroforesi capillare su gel e per queste separazioni, un polimero viene iniettato nel capillare CE. Il polimero offre un'ulteriore modalità di separazione in base alle dimensioni, poiché i frammenti più piccoli possono viaggiare più velocemente attraverso il gel. Questo è chiamato setacciatura e, insieme alla separazione elettroforetica, ha una risoluzione di 1 coppia di basi per l'analisi del DNA.