Electroforesis capilar (EC)

Fuente: Laboratorio del Dr. B. Jill Venton - Universidad de Virginia

Electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que separa las moléculas en un campo eléctrico según tamaño y carga. CE se realiza en un tubo pequeño de vidrio llamado un tubo capilar que se llena con una solución electrolítica. Los analitos se separan debido a diferencias en la movilidad electroforética, que varía con la carga, solvente viscosidad y tamaño. Tradicional electroforesis en geles es limitada por la cantidad de voltaje que se puede aplicar porque Julio calefacción efectos arruinará el gel y la separación. Los capilares tienen una relación grande de superficie a volumen superficial y así disiparán mejor el calor. Por lo tanto, los voltajes aplicados para un experimento de la electroforesis capilar son bastante grandes, a menudo 10.000 – 20.000 V.

Electroforesis capilar es útil para separaciones de alto rendimiento. En comparación con cromatografía líquida, separaciones de CE son a menudo más rápida y eficaz. Sin embargo, electroforesis capilar funciona mejor para separar moléculas cargadas, que no es una limitación de la cromatografía líquida. CE tiene una capacidad máxima mayor de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), significando las separaciones son más eficientes y más picos pueden ser detectados. La instrumentación puede ser muy simple. Sin embargo, HPLC es más versátil y muchas fases estacionarias y móvil se han desarrollado para diferentes tipos de moléculas.

Electroforesis capilar separa moléculas debido a su movilidad electroforética. Movilidad electroforética de una molécula depende de su carga y cuánto es atraído o repelido por el voltaje como la fuerza de arrastre friccional que resiste el movimiento. Fricción es proporcional al radio de la molécula. Así, la movilidad electroforética se basa en tamaño y carga. La velocidad de que una molécula cargada viaja por un tubo capilar es el producto de su movilidad electroforética y el campo eléctrico aplicado. Voltajes más altos, por tanto, conducen a velocidades más rápidas y separaciones más rápidas.

Mayoría de los instrumentos de electroforesis capilar está configurada con tensión negativa en el extremo del detector y el voltaje positivo en la entrada. Esto significa que las moléculas cargadas positivamente migran hacia el cátodo en el final, mientras que moléculas con carga negativa migran al revés. Todas las moléculas se ven en el detector, porque hay un flujo de fluidos a granel llamado flujo electroosmotic. La orden de migración es así moléculas de carga positiva, neutrales y luego-con carga negativa.

Flujo Electroosmotic es causado aplicando un alto voltaje a un pequeño vaso capilar lleno con una solución de sal. Los iones cargados positivamente en la solución de sal forman una doble capa con los grupos silanol cargados negativamente en las paredes del vaso. Cuando un voltaje negativo se aplica al extremo del tubo capilar, tira de los cationes de la capa doble, que también tira la solución alrededor de él debido a las fuerzas de fricción. Este tipo de flujo es en forma de clavija y conduce a menos ampliación de banda que los enchufes de flujo con forma parabólica de HPLC.

Fluyen de las moléculas neutrales de todos en la misma proporción que el flujo electroosmotic. Sin embargo, una fase pseudo-estacionaria puede agregarse al búfer de ejecución a micelas de forma que las moléculas pueden particionar en y fuera de. Una típica fase pseudo estacionaria es dodecylsulfate del sodio. Las micelas son carga negativa en el exterior, por lo que tienen una movilidad electroforética, por lo que el tiempo invertido en la micela determina el tiempo de la migración. Esta forma de la electroforesis capilar se llama cromatografía Electrocinética Micelar (MEKC).

Detección en CE es similar a la de HPLC. UV-Vis es general y no requiere de etiquetado como la molécula tiene un enlace doble. Sin embargo, la absorción depende de la longitud del camino, que es pequeña para un capilar de 50 μm. Una burbuja celda o z aumentará la longitud del camino. Fluorescencia inducida por láser es un método de detección más sensible. Un láser se brilla a través de una ventana en el tubo capilar y la fluorescencia del producto medido. Mientras que la fluorescencia proporciona muy alta sensibilidad, requiere generalmente moléculas al etiquetado porque la mayoría no son fluorescente. Detección electroquímica y detección de espectrometría de masas por electrospray están ganando en popularidad. El problema con cualquiera de estos detectores es que el alto voltaje de la separación debe ser traído a tierra antes de la detección electroquímica y electrospray requieren la aplicación de un voltaje y el voltaje de la CE puede interferir. Nuevos métodos de la tensión de la CE, utilizando electrodos para drenar la corriente o una pequeña grieta en el tubo capilar, la disociación superación estos desafíos.

1. configuración de instrumentación CE

1. Encienda el instrumento de la CE y la computadora. Utilizando el software de la computadora, encienda la fuente de luz para el análisis de la UV permitir que se caliente. Algunos programas tienen un indicador cuando la lámpara está lista para usar (icono de la lámpara ilumina en color).
2. Hacer un archivo de métodos. Configure los parámetros importantes para el funcionamiento de la CE. En este análisis las temperaturas del almacenaje del cartucho y de la muestra son de 35 ° C. La longitud de onda para la detección de UV es 214 nm.
3. Escribir un programa de tiempo. El programa consiste en generalmente pasos de enjuague (para limpiar el capilar antes del análisis), pasos de la inyección y luego un paso de electroforesis. Para el paso de enjuague, realizar 2 enjuagues durante 1 minuto con 20 psi de presión. El primer enjuague es con NaOH, que ayuda a asegurarse de que los grupos silanol de la pared capilar son deprotonated. La segunda aclaración es con tampón de ejecución (aquí para el tampón de borato de 0,025 M) para asegurarse de que el tubo capilar es izquierda equilibrada con el tampón.
4. Para la inyección, inyección a presión se utiliza en 0,5 psi para 5 s.
5. Para el paso de la electroforesis, las condiciones son separación tensión: 20 kV, tiempo: 5 min, polaridad normal. Para cada paso, también indican que vial es la entrada y que vial es la salida. Guarde el archivo de métodos después de entraron todos los parámetros.

2. preparación de los estándares y las muestras de Soda

1. Hacer soluciones madre de 500 ppm de aspartamo, cafeína y ácido benzoico en agua. Tomar 50 mL de cada uno, utilizando un matraz aforado.
2. Hacer una solución estándar de aspartamo 150 ppm, 150 ppm cafeína y ácido benzoico de 100 ppm en un matraz aforado de 10 mL.
3. Hacer soluciones de cafeína estándar de 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm y 200 ppm en un matraces aforados de 10 mL.

3. ejecutar los ejemplos en la CE

1. Coloque los frascos que contienen estándares o muestras de soda en el soporte para el frasco de muestra. Asegúrese de anotar que la muestra está en que ranura. Dos ranuras tienen el borato ejecutar el buffer y la solución de enjuague de NaOH de 0.1 M.
2. En el fichero, la entrada ranura que es el primer frasco de la muestra.
3. Adquirir una única prueba, asegurándose de que toda la información de datos del programa de entrada las solicitudes.
4. Seguir para la adquisición de datos, cambiando el frasco de entrada para cada muestra. Ejecutar la norma de combinación, las 3 concentraciones de cafeína y una Pepsi y diet Pepsi muestra.
5. Inserte el blanco en el instrumento y elegir el instrumento adecuado.
6. Analizar los datos en el ordenador. Calcular las áreas de pico y superposición de normas y muestras reales para ayudar a identificar picos. Hacer una curva de calibración para los datos de la cafeína.

Electropherograms recogidas para dieta Pepsi y Pepsi muestras se muestran en las figuras 1 y 2, respectivamente. Los tres picos de la cafeína, el aspartamo y el ácido benzoico se observan en la dieta Pepsi y tienen tiempos similares de migración como los estándares. Para Pepsi regular, el pico de cafeína está presente pero no los picos del aspartamo y ácido benzoico. El análisis de la CE es rápido como los tiempos de migración son sólo 3-4 minutos.

La curva de calibración para cafeína se muestra en la figura 3. Esta curva puede usarse para calcular la concentración de cafeína en cada muestra.

Figura 1. Análisis de la CE de Pepsi de dieta. Los rojos son estándares de cafeína, aspartamo y ácido benzoico. El negro es una dieta Pepsi muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Análisis de la CE de Pepsi. El negro es una muestra de Pepsi mientras que el rojo es una muestra de las normas de la cafeína, aspartamo y ácido benzoico. No hay aspartame o ácido benzoico, indicando que la sosa no es dieta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Parcela de calibración de cafeína con el CE. Una parcela del pico zona vs concentración de cafeína estándares medidos con CE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Electroforesis capilar se utilizan para muchas separaciones de especialidad. Por ejemplo, se utiliza en la industria farmacéutica para la prueba, para asegurarse de que no hay productos secundarios ni interferentes de la calidad. CE es particularmente útil para la separación de drogas con un grupo amino básico, como las paredes del tubo capilar pueden hacerse neutras con un pH ácido y así la droga no se pegue en el capilar.

Un modo de CE también se utilizó para secuenciar el genoma humano y separar el ADN. Este modo de CE es la electroforesis capilar y para estas separaciones, un polímero se inyecta en el tubo capilar de la CE. El polímero da un modo adicional de separación, basado en el tamaño, como los fragmentos más pequeños pueden viajar más rápido a través del gel. Esto se llama tamizado, y junto con la separación electroforética, tiene 1 resolución de pares para el análisis de ADN.