Preparazione di cristalli per l'analisi mediante diffrazione dei raggi X

Fonte: Laboratorio del Dr. Jimmy Franco - Merrimack College

La cristallografia a raggi X è un metodo comunemente usato per determinare la disposizione spaziale degli atomi in un solido cristallino, che consente la determinazione della forma tridimensionale di una molecola o di un complesso. Determinare la struttura tridimensionale di un composto è di particolare importanza, poiché la struttura e la funzione di un composto sono intimamente correlate. Le informazioni sulla struttura di un composto vengono spesso utilizzate per spiegarne il comportamento o la reattività. Questa è una delle tecniche più utili per risolvere la struttura tridimensionale di un composto o complesso, e in alcuni casi può essere l'unico metodo praticabile per determinare la struttura. La crescita dei cristalli di qualità a raggi X è il componente chiave della cristallografia a raggi X. La dimensione e la qualità del cristallo dipendono spesso molto dalla composizione del composto esaminato dalla cristallografia a raggi X. Tipicamente i composti contenenti atomi più pesanti producono un modello di diffrazione maggiore, quindi richiedono cristalli più piccoli. Generalmente, i cristalli singoli con facce ben definite sono ottimali e, in genere, per i composti organici, i cristalli devono essere più grandi di quelli contenenti atomi pesanti. Senza cristalli vitali, la cristallografia a raggi X non è fattibile. Alcune molecole sono intrinsecamente più cristalline di altre, quindi la difficoltà di ottenere cristalli di qualità a raggi X può variare tra i composti. La crescita dei cristalli a raggi X è simile al processo di ricristallizzazione che viene comunemente usato per purificare i composti, ma con un'enfasi sulla produzione di cristalli di qualità superiore. Spesso, è possibile ottenere cristalli di qualità superiore consentendo al processo di cristallizzazione di procedere lentamente, il che può verificarsi nel corso del giorno o dei mesi.

Esistono diversi metodi per la coltivazione di cristalli a raggi X, come il riscaldamento e il raffreddamento, l'evaporazione e la diffusione del vapore, ognuno con i propri vantaggi e limiti. ¹ Qui descritto è uno dei metodi più utili per la coltivazione di cristalli di qualità a raggi X, diffusione liquido-liquido. ² Il successo della crescita dei cristalli a raggi X dipende dalla corretta scelta dei solventi. Il composto deve essere solubile in un solvente ma insolubile in un altro. La diffusione liquido-liquido comporta l'accurata stratificazione di un solvente a bassa densità sopra un solvente ad alta densità in un tubo sottile, come un tubo NMR. Il tasso di diffusione può influenzare notevolmente le dimensioni e la qualità dei cristalli: la rapida diffusione favorisce i cristalli più piccoli, mentre la diffusione lenta favorisce la crescita di cristalli più grandi e di qualità superiore. L'utilizzo di tubi sottili, come i tubi NMR, rallenta la diffusione dei solventi, creando così un ambiente che facilita la crescita di cristalli di qualità superiore. I solventi comunemente usati per lo strato inferiore, in cui il composto viene disciolto, sono cloruro di metilene o cloroformio. Il composto viene disciolto nel solvente meno denso, ma questo può rivelarsi problematico in quanto il solvente superiore può iniziare ad evaporare prima della formazione del cristallo. La condizione ottimale è quella di avere i composti disciolti nel solvente più denso. Lo strato superiore è l'anti-solvente o precipitante. Gli anti-solventi frequentemente usati sono esano, pentano, etere etilico o metanolo. Una volta che i due solventi sono stati accuratamente stratificati, vengono lasciati diffondersi lentamente l'uno nell'altro. Il composto diventa meno solubile nella soluzione binaria, facilitando la formazione di cristalli a raggi X.

1. Preparazione del tubo di cristallo e del filtro

1. Posizionare un tubo NMR in un matraccio Erlenmeyer.
2. Preparare un filtro per pipette.
   1. Costruire il filtro posizionando un pezzo di salvietta senza lanugine (1 in. per 1 in.) nella pipetta, quindi utilizzare un'asta per incuneare saldamente la salvietta nella parte del collo di bottiglia della pipetta (Figura 1).
   2. Crea due filtri a pipetta per ogni tubo di cristallo necessario.

2. Aggiunta del campione al tubo di cristallo

1. Sciogliere il composto (tetrafenilporfirina, 10 mg) in 0,75 ml di solvente (diclorometano).
2. Con una pipetta, aggiungere delicatamente la miscela nella parte superiore del tubo, facendola passare attraverso il filtro.
   1. Le particelle vengono filtrate per evitare la creazione di siti di nucleazione, che possono portare a piccoli cristalli multipli invece dei singoli cristalli più grandi desiderati.
3. Una volta che il campione è stato posto nel tubo di cristallo, molto lentamente e delicatamente, aggiungere l'anti-solvente (1,5 ml di metanolo) al tubo attraverso una nuova pipetta filtrante. Lasciare che l'anti-solvente si strati lentamente sulla soluzione aggiunta in precedenza (Figura 2). Non utilizzare una lampadina per spingere il solvente attraverso la pipetta, ma lasciare che il solvente scorra attraverso il filtro da solo.
   1. Assicurarsi che il solvente di densità più elevata venga aggiunto prima al tubo di cristallo.
   2. Controllare che i due solventi siano miscibili l'uno con l'altro. Questo viene fatto prima dell'aggiunta del solvente.
4. Sigillare il tubo con un tappo NMR.

3. Crescita dei cristalli

1. Senza causare la miscelazione dei due solventi, posizionare i tubi di cristallo in un armadio dove non saranno disturbati.
2. Il tempo di cristallizzazione varierà con ogni composto, in genere i tubi di cristallo dovrebbero essere lasciati indisturbati per una settimana.
3. Dopo una settimana, ispezionare i tubi per la crescita dei cristalli.
   1. La crescita dei cristalli avviene tipicamente all'interfaccia dei due solventi.
   2. Ispezionare visivamente i tubi per la prova della crescita dei cristalli. Fare attenzione a non facilitare la miscelazione dei solventi, nel caso in cui il composto richieda più tempo per la formazione dei cristalli.
   3. Se sembra che si sia verificata la crescita dei cristalli, ispezionare ulteriormente i tubi utilizzando un microscopio.

4. Selezione dei cristalli

1. I cristalli di diffrazione a raggi X dovrebbero avere facce ben definite.
2. I cristalli che si sono raggruppati insieme dovrebbero essere evitati, se possibile.
3. Lasciare i cristalli nel tubo di cristallo fino al momento di raccogliere il cristallo, immediatamente prima di posizionare il cristallo sul diffrattometro.
   1. Mantenere i cristalli nel tubo assicurerà che i cristalli rimangano solvatati. La de-solvatazione può causare la rottura dei cristalli e ostacolare la diffrazione del cristallo.

Figura 1. Immagine del filtro pipetta. Un piccolo pezzo di salvietta senza lanugine è stato saldamente incastrato al collo di bottiglia della pipetta. Le soluzioni vengono passate attraverso questi filtri a pipetta prima di essere introdotte nel tubo di cristallo.

Figura 2. Una volta che la soluzione contenente il composto mirato viene posizionata nel tubo di cristallo, l'anti-solvente viene lentamente stratificato sopra facendolo passare attraverso un nuovo filtro a pipetta.

La tecnica di diffusione liquido-liquido è stata utilizzata per creare cristalli di qualità a raggi X di tetrafenilporfirina. Utilizzando il diclorometano come solvente e il metanolo come anti-solvente, i liquidi sono stati lasciati diffondersi lentamente nel corso di una settimana senza essere disturbati. Grandi cristalli viola-rossastri scuri ben definiti formati all'interfaccia dei due solventi (Figura 3). La crescita dei cristalli può essere osservata visivamente. I cristalli sono cresciuti con facce molto ben definite, che possono essere viste al microscopio.

Figura 3. Cristalli di qualità di diffrazione a raggi X di TPP. I cristalli che sono raggruppati insieme o che stanno crescendo l'uno dall'altro dovrebbero essere evitati. Grandi cristalli singoli con facce ben definite in genere producono risultati migliori.

I cristalli di qualità a raggi X possono essere coltivati mediante diffusione liquido-liquido. La lenta diffusione del sistema binario a solvente permette la creazione di cristalli adatti alla diffrazione a raggi X. Questo metodo consente al reticolo cristallino di formarsi lentamente, spesso portando a cristalli più grandi e ben definiti. L'uso di tubi NMR facilita la lenta diffusione dei solventi, consentendo una crescita ottimale dei cristalli. Questo processo può richiedere da pochi giorni a diversi mesi. Spesso durante il processo di cristallizzazione le molecole di solvente sono incorporate nel reticolo cristallino. Quindi è importante evitare di lasciare che i cristalli si "secchino". Pertanto, uno dei vantaggi della diffusione liquido-liquido è che i cristalli crescono tipicamente all'interfaccia dei due solventi, il che aggira questo fenomeno.

La diffusione liquido-liquido è una delle tecniche più utili per la produzione di cristalli di qualità a raggi X, che è il componente più essenziale della cristallografia a raggi X. Ottenere cristalli di qualità a raggi X è in genere il fattore limitante nella conduzione di esperimenti di cristallografia a raggi X. La cristallografia a raggi X crea essenzialmente un'immagine tridimensionale della struttura di una molecola, rendendola il metodo meno ambiguo per determinare la configurazione completa di un composto. Poiché la struttura e la funzione delle molecole sono intimamente correlate, la capacità di decifrare la struttura tridimensionale di un composto è estremamente utile per una varietà di applicazioni chimiche e farmaceutiche. Ricercatori e aziende farmaceutiche utilizzano la cristallografia a raggi X per determinare la struttura delle proteine per esaminare come le piccole molecole interagiscono con gli enzimi ai fini della scoperta e della progettazione di farmaci. La cristallografia a raggi X ^3-5 è anche uno dei metodi più utili per valutare i complessi metallici. Questa tecnica divulga preziose informazioni su come i metalli interagiscono tra loro e con i suoi ligandi. Il primo legame quintuplo mai identificato tra due atomi di cromo è stato identificato utilizzando la cristallografia a raggi X. ⁶ Questa tecnica può essere utilizzata anche per spiegare le proprietà luminescenti dei complessi metallici. ⁷ La cristallografia è stata anche ampiamente utilizzata nella chimica ospite-ospite, poiché questo metodo è stato determinante nel rivelare preziose informazioni sulle interazioni non covalenti tra molecole. ⁸

1. Gilman, J. J., The art and science of growing crystals. Wiley: (1963).
2. Orvig, C., A simple method to perform a liquid diffusion crystallization. Journal of Chemical Education 62 (1), 84 (1985).
3. Brown, C. S.; Lee, M. S.; Leung, D. W.; Wang, T.; Xu, W.; Luthra, P. et. al. In silico derived small molecules bind the filovirus VP35 protein and inhibit its polymerase co-factor activity. Journal of molecular biology, 426 (10), 2045-2058 (2014)
4. Batt, S. M.; Jabeen, T.; Bhowruth, V.; Quill, L.; Lund, P. A.; Eggeling et. al. Structural basis of inhibition of Mycobacterium tuberculosis DprE1 by benzothiazinone inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,109 (28), 11354-9 (2012)
5. Mortensen, D. S.; Perrin-Ninkovic, S. M.; Shevlin, G.; Elsner, J.; Zhao, J.; Whitefield et al. Optimization of a Series of Triazole Containing Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Kinase Inhibitors and the Discovery of CC-115. Journal of Medicinal Chemistry 58 (14), 5599-5608 (2015)
6. Nguyen, T.; Sutton, A. D.; Brynda, M.; Fettinger, J. C.; Long, G. J.; Power, P. P., Synthesis of a Stable Compound with Fivefold Bonding Between Two Chromium(I) Centers. Science310 (5749), 844-847 (2005).
7. Chen, K.; Nenzel, M. M.; Brown, T. M.; Catalano, V. J., Luminescent Mechanochromism in a Gold(I)-Copper(I) N-Heterocyclic Carbene Complex. Inorganic Chemistry 54 (14), 6900-6909.(2015).
8. Franco, J. U.; Hammons, J. C.; Rios, D.; Olmstead, M. M., New Tetraazaannulene Hosts for Fullerenes. Inorganic Chemistry49 (11), 5120-5125 (2010).