Crescimento de Cristais para Análise de Difração de Raios-X

Fonte: Laboratório do Dr. Jimmy Franco - Merrimack College

A cristalografia de raios-X é um método comumente usado para determinar o arranjo espacial dos átomos em um sólido cristalino, que permite a determinação da forma tridimensional de uma molécula ou complexo. Determinar a estrutura tridimensional de um composto é de particular importância, uma vez que a estrutura e a função de um composto estão intimamente relacionadas. Informações sobre a estrutura de um composto são frequentemente usadas para explicar seu comportamento ou reatividade. Esta é uma das técnicas mais úteis para resolver a estrutura tridimensional de um composto ou complexo, e em alguns casos pode ser o único método viável para determinar a estrutura. O crescimento de cristais de qualidade de raios-X é o componente chave da cristalografia de raios-X. O tamanho e a qualidade do cristal são muitas vezes altamente dependentes da composição do composto que está sendo examinado pela cristalografia de raios-X. Tipicamente compostos contendo átomos mais pesados produzem um maior padrão de difração, exigindo cristais menores. Geralmente, cristais únicos com rostos bem definidos são ótimos, e tipicamente para compostos orgânicos, os cristais precisam ser maiores do que aqueles que contêm átomos pesados. Sem cristais viáveis, a cristalografia de raios-X não é viável. Algumas moléculas são inerentemente mais cristalinas do que outras, assim a dificuldade de obter cristais de qualidade de raios-X pode variar entre os compostos. O crescimento de cristais de raios-X é semelhante ao processo de recristalização que é comumente usado para purificar compostos, mas com ênfase na produção de cristais de maior qualidade. Muitas vezes, cristais de maior qualidade podem ser obtidos permitindo que o processo de cristalização prossiga lentamente, o que pode ocorrer ao longo do dia ou meses.

Há uma série de métodos para o cultivo de cristais de raios-X, como aquecimento e resfriamento, evaporação e difusão de vapor, cada um com suas próprias vantagens e limitações. ¹ Descrito aqui é um dos métodos mais úteis para o cultivo de cristais de qualidade de raios-X, difusão líquido-líquido. ² O crescimento bem sucedido do cristal de raios-X depende da escolha adequada dos solventes. O composto deve ser solúvel em um solvente, mas insolúvel em outro. A difusão líquido-líquido envolve cuidadosamente colocar um solvente de baixa densidade em cima de um solvente de maior densidade em um tubo fino, como um tubo NMR. A taxa de difusão pode influenciar muito o tamanho e a qualidade dos cristais, a difusão rápida favorece cristais menores, enquanto a difusão lenta favorece o crescimento de cristais maiores e de maior qualidade. A utilização de tubos finos, como tubos NMR, retarda a difusão dos solventes, criando assim um ambiente que facilite o crescimento de cristais de maior qualidade. Solventes comumente usados para a camada inferior, na qual o composto é dissolvido, são cloreto de metileno ou clorofórmio. O composto é dissolvido no solvente menos denso, mas isso pode ser problemático, pois o solvente superior pode começar a evaporar antes da formação de cristais. A condição ideal é ter os compostos dissolvidos no solvente mais denso. A camada superior é o anti-solvente ou precipitante. Anti-solventes frequentemente usados são hexano, pentano, éter dietil ou metanol. Uma vez que os dois solventes tenham sido cuidadosamente em camadas, eles são autorizados a difundir lentamente um no outro. O composto torna-se menos solúvel na solução binária, facilitando a formação de cristais de raios-X.

1. Preparação do tubo de cristal e filtro

1. Coloque um tubo de RMN em um frasco de Erlenmeyer.
2. Prepare um filtro de pipeta.
   1. Construa o filtro colocando um pedaço de lenço sem fiapos (1 por 1 a 1 polegada)na pipeta e use uma haste para encaixar firmemente a limpeza na porção de gargalo da pipeta(Figura 1).
   2. Faça dois filtros de pipeta para cada tubo de cristal necessário.

2. Adicionando a amostra ao tubo de cristal

1. Dissolva o composto (tetrafenilaporfirina, 10 mg) em 0,75 mL de solvente (diclorometano).
2. Com uma pipeta, adicione suavemente a mistura na parte superior do tubo, passando-a pelo filtro.
   1. As partículas são filtradas para evitar a criação de locais de nucleação, o que pode levar a pequenos cristais múltiplos em vez dos cristais maiores desejados.
3. Uma vez que a amostra tenha sido colocada no tubo de cristal, muito lentamente e suavemente, adicione o anti-solvente (1,5 mL de metanol) ao tubo através de uma nova pipeta de filtro. Permita que o anti-solvente se coloque lentamente na solução adicionada anteriormente (Figura 2). Não use uma lâmpada para empurrar o solvente através da pipeta, em vez disso, deixe o solvente fluir através do filtro por si só.
   1. Certifique-se de que o solvente de maior densidade seja adicionado primeiro ao tubo de cristal.
   2. Verifique se os dois solventes estão errados um com o outro. Isso é feito antes da adição do solvente.
4. Sele o tubo com uma tampa NMR.

3. Crescimento de Cristal

1. Sem fazer com que os dois solventes se misturem, coloque o tubo de cristal em um armário onde eles não serão perturbados.
2. O tempo de cristalização vai variar com cada composto, normalmente os tubos de cristal devem ficar imperturbáveis por uma semana.
3. Depois de uma semana, inspecione os tubos para o crescimento de cristais.
   1. O crescimento de cristal normalmente ocorre na interface dos dois solventes.
   2. Inspecione visualmente os tubos em busca de evidências de crescimento de cristais. Tenha cuidado para não facilitar a mistura dos solventes, caso o composto exija tempo adicional para a formação de cristais.
   3. Se parece que o crescimento do cristal ocorreu, inspecione ainda mais os tubos usando um microscópio.

4. Seleção de Cristal

1. Cristais de difração de raios-X devem ter rostos bem definidos.
2. Cristais que se agruparam devem ser evitados, se possível.
3. Deixe os cristais no tubo de cristal até que estejam prontos para colher o cristal, imediatamente antes de colocar o cristal no difrítômetro.
   1. Manter os cristais no tubo garantirá que os cristais permaneçam solvados. A dess solvação pode fazer com que os cristais quebrem, e dificultar a difração do cristal.

Figura 1. Uma imagem do filtro de pipeta. Um pequeno pedaço de lenço sem fiapos foi firmemente preso ao gargalo da pipeta. As soluções são passadas embora estes filtros de pipeta antes de serem introduzidos no tubo de cristal.

Figura 2. Uma vez que a solução contendo composto direcionado é colocada no tubo de cristal, o anti-solvente é lentamente em camadas em cima, passando-o através de um novo filtro de pipeta.

A técnica de difusão líquido-líquido foi utilizada para criar cristais de qualidade de raios-X de tetrafenilaporfirina. Usando diclorometano como solvente e metanol como anti-solvente, os líquidos foram autorizados a difundir lentamente ao longo de uma semana sem serem perturbados. Cristais grandes, bem definidos e escuros roxo-avermelhados formados na interface dos dois solventes(Figura 3). O crescimento dos cristais pode ser observado visualmente. Os cristais cresceram com rostos muito bem definidos, que podem ser vistos com um microscópio.

Figura 3. Cristais de qualidade de difração de raios-X de TPP. Cristais que estão agrupados ou que estão crescendo uns dos outros devem ser evitados. Grandes cristais individuais com rostos bem definidos normalmente produzem melhores resultados.

Cristais de qualidade de raios-X podem ser cultivados por difusão líquido-líquido. A difusão lenta do sistema de solventes binários permite a criação de cristais adequados para difração de raios-X. Este método permite que a rede de cristal se forme lentamente, muitas vezes levando a cristais maiores e mais bem definidos. O uso de tubos de RMN facilita a difusão lenta dos solventes, permitindo um crescimento ideal de cristal. Esse processo pode levar de alguns dias a vários meses. Muitas vezes durante o processo de cristalização, moléculas de solventes são incorporadas à rede cristalina. Assim, é importante evitar permitir que os cristais "sequem". Assim, uma das vantagens da difusão líquido-líquido é que os cristais normalmente crescem na interface dos dois solventes, o que contorna esse fenômeno.

A difusão líquido-líquido é uma das técnicas mais úteis para a produção de cristais de qualidade de raios-X, que é o componente mais essencial da cristalografia de raios-X. A obtenção de cristais de qualidade de raios-X é tipicamente o fator limitante na realização de experimentos de cristalografia de raios-X. A cristalografia de raios-X essencialmente cria uma imagem tridimensional da estrutura de uma molécula, tornando-a o método menos ambíguo para determinar a configuração completa de um composto. Uma vez que a estrutura e a função das moléculas estão intimamente relacionadas, a capacidade de decifrar a estrutura tridimensional de um composto é extremamente útil para uma variedade de aplicações químicas e farmacêuticas. Pesquisadores e empresas farmacêuticas usam a cristalografia de raios-X para determinar a estrutura das proteínas para examinar como pequenas moléculas interagem com enzimas com o propósito de descoberta e design de medicamentos. A cristalografia de raios-X ^3-5 também é um dos métodos mais úteis para avaliar complexos metálicos. Esta técnica divulga uma visão valiosa sobre como os metais interagem uns com os outros e seus ligantes. A primeira ligação quintupla identificada entre dois átomos de cromo foi identificada usando cristalografia de raios-X. ⁶ Esta técnica também pode ser usada para explicar as propriedades luminescentes dos complexos metálicos. ⁷ A cristalografia também tem sido amplamente utilizada na química ho-guest, pois este método tem sido fundamental para revelar informações valiosas sobre interações não covalentes entre moléculas. ⁸

1. Gilman, J. J., The art and science of growing crystals. Wiley: (1963).
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4. Batt, S. M.; Jabeen, T.; Bhowruth, V.; Quill, L.; Lund, P. A.; Eggeling et. al. Structural basis of inhibition of Mycobacterium tuberculosis DprE1 by benzothiazinone inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,109 (28), 11354-9 (2012)
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