Determinazione dell'efficienza dell'inibitore chimico contro la crescita intracellulare del Toxoplasma Gondii utilizzando un saggio di crescita basato su Luciferase

Presentato qui è un protocollo per valutare l'efficacia dell'inibizione dei composti chimici contro la crescita intracellulare in vitro di Toxoplasma gondii utilizzando un analisi della crescita basata sulla luciferasi. La tecnica viene utilizzata per confermare la specificità dell'inibizione mediante la delezione genetica del gene bersaglio corrispondente. L'inibizione di LHVS contro la proteasi TgCPL viene valutata come esempio.

Il toxoplasma gondii è un patogeno protozoo che colpisce ampiamente la popolazione umana. Gli attuali antibiotici utilizzati per il trattamento della toxoplasmosi clinica sono limitati. Inoltre, essi esibiscono effetti collaterali negativi in alcuni gruppi di persone. Pertanto, la scoperta di nuove terapie per la toxoplasmosi clinica è imperativa. Il primo passo dello sviluppo di nuovi antibiotici è quello di identificare composti chimici che mostrano un'elevata efficacia nell'inibizione della crescita dei parassiti utilizzando una strategia di screening ad alto throughput. Come agente patogeno intracellulare obbligato, Toxoplasma può replicarsi solo all'interno delle cellule ospiti, il che vieta l'uso di misurazioni ottiche di assorbimento come indicatore rapido della crescita. Presentato qui è un protocollo dettagliato per un saggio di crescita di luciferasi. Ad esempio, questo metodo viene utilizzato per calcolare il tempo di raddoppio dei parassiti Toxoplasma di tipo selvatico e misurare l'efficacia del morfnurea-leucyl-omofenicolo-vicinquel-vinile sulfone fenil (LHVS, un composto che mira la proteasi cisteina) per quanto riguarda l'inibizione della crescita intracellulare. È stato descritto anche un protocollo di eliminazione genica basato su CRISPR-Cas9 nel Toxoplasma che utilizza regioni omologhe da 50 bp per la ricombinazione dipendente dall'omologia (HDR). Quantificando i efficacidi di inibizione di LHVS in wild-type e TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficiente-deficiente parassiti, è dimostrato che LHVS inibisce la crescita del parassita di tipo selvatico più efficiente rispetto alla crescita zcpl, suggerendo che TgCPL è un obiettivo che LHVS si lega a Toxo. L'elevata sensibilità e il facile funzionamento di questo analisi della crescita di luciferasi lo rendono adatto per monitorare la proliferazione di Toxoplasma e valutare l'efficacia dei farmaci in modo ad alto consumo.

Toxoplasma gondii è un parassita intracellulare di grande successo che infetta circa un terzo della popolazione umana. Il suo alto tasso di trasmissione è principalmente dovuto alle sue diverse vie di trasmissione, tra cui il consumo di carne poco cotta, l'esposizione ai serbatoi di mammiferi e la trasmissione congenita durante la nascita. T. gondii provoca principalmente infezioni opportunistiche che possono portare a una grave morbilità e mortalità in individui immunocompromessi^1,2,3,4,5,6. Gli antibiotici attualmente utilizzati per il trattamento della toxoplasmosi acuta sono particolarmente inefficienti nel trattamento delle infezioni congenite e latenti e causano gravi reazioni in alcuni individui^3,7,8. Pertanto, esiste un'urgente necessità di identificare nuove terapie. Comprendere le differenze nei processi subcellulari all'interno di Toxoplasma e del suo ospite aiuterà a identificare potenziali bersagli farmacologici. Pertanto, sono necessarie tecniche di manipolazione del genoma efficienti e convenienti per studiare i ruoli dei singoli geni all'interno di Toxoplasma. Inoltre, Toxoplasma appartiene al phylum Apicomplexa, che include diversi altri patogeni umani significativi, come Plasmodium spp. e Cryptosporidium spp. Quindi, Toxoplasma può essere utilizzato come organismo modello per aiutare a studiare la biologia di base in altri parassiti apicomplessi.

Per identificare nuovi antibiotici contro gli agenti patogeni microbici, viene inizialmente eseguito lo screening ad alto throughput di una biblioteca di composti chimici per determinarne l'efficacia nella repressione della crescita microbica. Finora, sono stati sviluppati diversi saggi di crescita basati su microplaciper per misurare la crescita intracellulare di T. gondii (cioè, quantificazione radioattiva ³H-uracil basata sull'incorporazione⁹, rilevamento quantitativa dei parassiti a base di ELISA utilizzando anticorpi specifici T. gondii^10,11, misurazione basata sulle proteine dei reporter utilizzando ceppi Toxoplasma che esprimono YFP^12,13e un'imaging ad alto contenuto recentemente sviluppata comesay¹⁴).

Queste strategie individuali hanno tutti vantaggi unici; tuttavia, alcune limitazioni limitano anche le loro applicazioni. Ad esempio, poiché il toxoplasma può replicarsi solo all'interno di cellule animali nucleate, l'autofluorescenza e il legame non specifico di anticorpi anti-T.gondii per ospitare le cellule causano interferenze nelle misurazioni basate sulla fluorescenza. Inoltre, l'uso di isotopi radioattivi richiede una particolare conformità alla sicurezza e potenziali problemi di sicurezza. Alcuni di questi saggi sono più adatti per valutare la crescita in un unico momento piuttosto che un monitoraggio continuo della crescita.

Presentato qui è un protocollo basato su luciferasi per la quantificazione della crescita intracellulare del Toxoplasma. In uno studio precedente, il gene della luciferasi di NanoLuc è stato clonato sotto il promotore di tubulina Toxoplasma, e questo costrutto di espressione luciferasi è stato transincato in parassiti di tipo selvaggio (RHku80) per creare un RHku80zhxg::ceppo NLuc (chiamato RHku80::NLuc qui dopo)¹⁵. Questo ceppo è servito come ceppo parentale per la determinazione della crescita intracellulare e la delezione genica in questo studio. Utilizzando il ceppoRH-ku80::NLuc, la crescita dei parassiti nei fibroblasti prepuzio (HFF) è stata monitorata in un periodo di 96 ore dopo l'infezione per calcolare il tempo di raddoppio del parassita.

Inoltre, l'efficacia dell'inibizione di LHVS contro la crescita dei parassiti può essere determinata tracciando i tassi di crescita di Toxoplasma contro le concentrazioni seriali di LHVS per identificare il valore di IC_50. Letteratura precedente ha riferito che TgCPL è un obiettivo principale di LHVS nei parassiti e che il trattamento con LHVS diminuisce lo sviluppo di infezioni toxoplasma acute e croniche^16,17,18,19. Inoltre, ilku80ceppo parentale per la modifica del genoma èstato utilizzato come ceppo parentale per generare un ceppo TgCPL-deficiente (RHku80::NLuc), e l'inibizione di LHVS è stata misurata rispetto a questo mutante. Osservando un upshift di valori Di_C50 per LHVS nei parassiti carenti di TgCPLrispetto al ceppo WT, è stato convalidato che TgCPL è preso di mira da LHVS in vivo.

In questo protocollo, RHku80::NLuc viene utilizzato come ceppo parentale, che manca di un efficiente percorso di giunzione finale non omologa (NHEJ), facilitando così la ricombinazione dipendente da omologia crossover (HDR)^20,21. Inoltre, le regioni omologhe di 50 bp sono affiancate ad entrambe le estremità di una cassetta di resistenza ai farmaci da PCR. Il prodotto PCR funge da modello di riparazione per rimuovere l'intero locus genico tramite HDR utilizzando strumenti di editing del genoma basati su CRISPR-Cas9. Tali regioni omologhe brevi possono essere facilmente incorporate in primer, fornendo una comoda strategia per la produzione del modello di riparazione. Questo protocollo può essere modificato per eseguire la delezione genica universale e l'etichettatura genica endogena.

Ad esempio, nella nostra pubblicazione più recente, tre geni proteasi, TgCPL, TgCPB ( Proteasi a cathepsina B-comeToxoplasma) e TgSUB1 ( proteasi simile allatossoplasma 1), sono stati geneticamente ablati in TgCRT (Toxoplasma cloroleccanter-resistanceer) parassiti carenti utilizzando questo metodo¹⁵. Inoltre, TgAMN (aminopeptidase putativo N [TgAMN, TGGT1_221310]) è stato etichettato endogenamente¹⁵. Il laboratorio di Lourido ha anche riferito di aver usato brevi regioni omologhe nell'intervallo di 40-43 bp per l'introduzione della mutazione genica diretta dal sito e dell'etichettatura genica endogena nel genoma del Toxoplasma utilizzando un metodo simile²². Queste modifiche del genoma di successo suggeriscono che una regione omologa di 40-50 bp è sufficiente per una ricombinazione efficiente del DNA nel ceppo tgKU80-carente,che semplifica notevolmente la manipolazione del genoma in Toxoplasma gondii.

Toxoplasma gondii è classificato nel Gruppo di Rischio 2 e deve essere gestito a livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Il protocollo è stato rivisto e approvato dal Comitato di Biosicurezza Istituzionale dell'Università di Clemson.

1. Saggio sulla crescita di Toxoplasma basato su Luciferate

1. Fibroblasti di prepuzio umano di semi (HFF) 1 settimana prima dell'inoculazione dei parassiti per garantire che le cellule ospiti siano completamente confluenti. Eseguire un saggio fittizio in una piastra trasparente per garantire che i parassiti rimangano intracellulari per tutto il periodo di valutazione.
   NOTA: Qui, il saggio è condotto in 96 microplacche ben. Secondo le esigenze sperimentali, può essere scalato fino a 384 o 1536 microplacche ben.
2. Passare i parassiti toxoplasma in HFF confluenti 2 giorni prima dell'uso trasferendo 0,3-0,4 mL di parassiti completamente lisci in una flacone T25. Incubare le cellule ospiti infette a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂ per 2 giorni.
3. Siringa 5 mL di parassiti appena lised attraverso un ago di sicurezza 21 G 5x per liberare i parassiti intracellulari, quindi passare attraverso un filtro di 3 m per rimuovere i detriti delle cellule ospiti. Risciacquare i parassiti residui dal flacone usando 7 mL di fenolo medio-libero D10 medio, quindi passare attraverso il filtro di nuovo.
4. Centrifuga parassiti a 1000 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT). Versare il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di fenolo senza rosse D10.
5. Contare i parassiti usando un emocitometro per determinare la concentrazione.
6. Diluire i parassiti a 1 x 10⁴ parassiti/mL per il ceppo di tipo selvaggio (WT). Per i ceppi di parassiti carenti di crescita, aumentare la concentrazione di conseguenza per osservare un aumento significativo nei segnali luciferasi.
7. Aspirati i media con attenzione da 96 microplacche ben pre-semied con HFF e inoculato 150 -L di sospensione parassita in pozzi in un formato di tre colonne e cinque file, che rappresenta tre repliche tecniche e cinque momenti.
8. Incubare la micropiastra a 37 e il 5% di CO₂ per 4 h.
9. Aspirati i media con attenzione dai pozzi per rimuovere i parassiti non invasi, quindi riempiono i pozzetti con supporti senza rosso fenolo RT in ogni riga (ad eccezione della prima riga).
10. Mescolare volumi uguali di PBS e 2x luciferase assaggio tampone e diluire il substrato luciferasi a 12,5 M.
11. Aggiungere 100 l di substrato luciferasi diluito in ogni pozzetto della fila superiore. Incubare le microplacche a RT per 10 min per consentire alle cellule di eseguire completamente la liscivia.
12. Misurare l'attività della luciferasi utilizzando un lettore di microplacino. Le impostazioni del lettore di lastre sono elencate nella Tabella 1. Ogni lettura rappresenta il numero iniziale di parassiti invasi a 4 h dopo l'infezione.
13. Ripetere i passaggi da 1,9 a 1,12 per ogni riga ogni 24 ore per 4 giorni senza modificare il supporto. Queste letture riflettono il numero totale di parassiti replicati a 24 h, 48 h, 72 h e 96 h dopo l'infezione.
14. Calcolare le letture medie ad ogni punto temporale e dividerle per le letture medie a 4 h per determinare i cambiamenti di piega nella crescita dei parassiti nel tempo.
15. Tracciare i dati utilizzando un software di grafica. Una tabella di lettura di crescita rappresentativa e le trame diRH-ku80:: i parassitiNLuc sono mostrati in Figura 1A, B.
16. Per calcolare il tempo di raddoppio, tracciare i valori log2 delle modifiche di piegatura nei singoli punti temporali nel tempo di incubazione. Utilizzare una funzione di regressione lineare per calcolare la pendenza, che rappresenta il tempo di raddoppio di ogni deformazione (Figura 1A,C).

2. Valutazione dell'efficacia dell'inibizione del composto chimico rispetto alla crescita del toxoplasma

NOTA: Qui, la valutazione dell'inibizione dell'LHVS nella crescita di Toxoplasma è presentata come esempio. Vengono testate otto diverse concentrazioni di LHVS, e vengono eseguite tre repliche tecniche per ciascuna delle tre repliche biologiche per entrambi i ceppi RHku80::NLuc eRH-ku8 zcpl::NLuc.

1. Prima dell'infezione da parassiti, gli HFF di semi a 96 microplacche ben nel formato di tre righe e nove colonne per una replica biologica per ogni ceppo. Le cellule ospiti potranno crescere per almeno 7 giorni prima dell'uso.
2. Passare i parassitiRH:ku80::NLuc eRH-ku8-cpl::NLuc per 2 giorni prima dell'uso. Seguire i passaggi da 1.2-1.6 per la purificazione e la quantificazione dei parassiti. Risospendere i parassiti nei supporti fenolici senza rosso a 1 x 10⁴ parassiti/mL.
3. Aspirare i supporti da una piastra contenente HFF confluenti e inoculare ogni pozzo con 150 l di sospensione parassita. Incubare la micropiastra a 37 e il 5% di CO₂ per 4 h.
4. Preparare LHVS a otto diverse concentrazioni in un serbatoio di 12 pozzi per diluizione seriale. In generale, le concentrazioni sono ridotte di tre volte in modo diluizione seriale.
   NOTA: La concentrazione più bassa è ridotta di 6.561 volte rispetto alla più alta concentrazione. Il cambiamento di piegatura della diluizione può essere regolato di conseguenza in base alle diverse proprietà dei singoli composti.
5. Alle 4 h dopo l'infezione, aspirare i media per rimuovere i parassiti non invasi e riempire ogni pozzo dalle colonne 2-9 con 150 - L di supporti integrati con LHVS a diverse concentrazioni. Lasciare la prima colonna riempita con un supporto regolare per fungere da controllo non trattato.
6. Incubare la micropiastra a 37 e il 5% di CO₂ per altri 96 h.
7. Eseguire i passaggi 1.9-1.11 e misurare l'attività luciferasi dei singoli pozzi.
8. Media delle attività luciferasi di tre repliche tecniche da pozzi di ogni singola concentrazione di LHVS.
9. Dividere l'attività media di luciferasi per ogni concentrazione di LHVS per l'attività di luciferasi media derivata da parassiti non trattati per calcolare l'attività di luciferasi normalizzata come percentuale.
10. Tracciare le attività di luciferasi normalizzate rispetto alle singole concentrazioni di LHVS utilizzando un software grafico (Figura 2). L'inibizione della pirimethamina contro la crescita parassitaria è misurata anche come controllo. Pyrimethamine è un antibiotico clinico usato per trattare la toxoplasmosi acuta inibendo il metabolismo degli acidi folichi nel Toxoplasma.
11. Calcolare i valori IC₅₀ per i singoli composti utilizzando il metodo incorporato nel software di grafica, risposta normalizzata vs. L'IC₅₀ viene calcolato utilizzando la seguente formula:
    Y : 100/(1 X/IC₅₀)
    Dove: Y rappresenta le attività di luciferasi normalizzate di cellule infette in diverse concentrazioni di inibitori, e X rappresenta concentrazioni individuali di inibitore.

3. Delezione genica a base di CRISPR-Cas9 nei parassiti di Toxoplasma

1. Generazione di un costrutto plasmide che esprime l'RNA (sgRNA) e il Cas9 per l'eliminazione di un gene di interesse
   1. Vai a www.ToxoDB.org e recupera l'intera sequenza di codifica genica, inclusi introni ed esoni, insieme a 1,5 kb 5'-UTR e 3'-UTR (regioni non tradotte).
      NOTA: In questo caso, TgCPL (TGGT1_321530) è destinato come esempio rappresentativo.
   2. Copiare la sequenza TgCPL recuperata nel software di analisi della sequenza (fare riferimento alla Tabella dei materiali per il nome e la versione) ed etichettare le regioni 5' e 3'-UTR.
   3. Seleziona l'icona Strumenti nella barra dei menu in alto, quindi seleziona Clonazione Trovare Siti CRISPR.
   4. Scegliere 3'(Cas9)' per la posizione del sito PAM e selezionare la cartella contenente la sequenza genomica Toxoplasma nella sezione del punteggio di specificità. Lasciare le altre impostazioni come predefinite.
   5. Scegliere uno sgRNA con i seguenti due criteri: 1) mostrando un punteggio di specificità elevato, generalmente >98%, e 2) privo di una G dopo il NGG, una sequenza di motivi adiacenti (PAM) protospaziale. Lo sgRNA selezionato si trova di solito in siti vicini all'inizio e arresto dei codoni del gene di interesse.
   6. Copiate la sequenza dello sgRNA selezionato e incollatela nel seguente modello di primer.
      
      La porzione in rosso rappresenta la sequenza di sgRNA TgCPL selezionata. Può essere sostituito con diversi sgRNA per vari geni di interesse.
      NOTA: Se lo sgRNA selezionato non inizia con G, aggiungere G all'inizio dello sgRNA per contribuire a migliorarne l'espressione.
   7. Eseguire una reazione PCR per modificare il plasmide preesistente esprimendo sgRNA (Figura 3A) che si rivolge toxoplasma uracil phosphoribosyltransferase (TgUPRT) gene²³ utilizzando un premix PCR con le impostazioni fornite nella tabella 2.
   8. Eseguire il prodotto PCR su un gel di agarose per confermare l'amplificazione di successo. Un prodotto PCR da 10 kb dovrebbe essere amplificato (Figura 3B).
   9. Estrarre il prodotto PCR utilizzando un kit di estrazione gel di DNA e circolarlo utilizzando un kit di mutagenesi diretto al sito. Fare riferimento alla tabella 3 per la ricetta. Incubare la reazione per 10-20 min a RT.
   10. Trasforma il prodotto PCR circolare in E. coli e scegli 10 cloni per un'ulteriore verifica dell'incorporazione dello sgRNA progettato.
   11. Crescere due cloni ed estrarre plasmidi. Tagliare le plasmidi purificate con BamHI ed EcoRV. I plasmidi candidati produrranno due bande a 2,4 kb e 7,2 kb (Figura 3C).
   12. Inviare i plasmidi per il sequenziamento di Sanger utilizzando i primer inversi M13 per confermare la sostituzione corretta dello sgRNA TgUPRT con lo sgRNA progettato (Figura 3D).
2. Generazione di un modello di riparazione per la cancellazione genica tramite il meccanismo HDR
   1. Secondo i siti di targeting dello sgRNA selezionato, individuare 50 bp di 5'-UTR o 3'-UTR del gene bersaglio per la ricombinazione dipendente dall'omologia (HDR, vedi sezione discussione). La selezione delle regioni segue i criteri elencati di seguito, a seconda della posizione dei bersagli sgRNA.
      1. Se il sito di scissione di Cas9 si trova a monte del codone iniziale, selezionare quanto segue: una sequenza di DNA di 50 bp a monte del sito di scissione come regione HDR sinistra e una sequenza di DNA di 50 bp a valle del codone di arresto come regione HDR destra.
      2. Se il sito di scissione di Cas9 si trova tra i codoni di avvio e arresto, selezionare le seguenti opzioni: una sequenza di DNA di 50 bp a monte del codone di partenza come regione HDR sinistra e una sequenza di DNA di 50 bp a valle del codone di arresto come regione HDR destra.
      3. Se il sito di scissione di Cas9 si trova a valle del codone di arresto, selezionare quanto segue: una sequenza di DNA di 50 bp a monte del codone iniziale come regione HDR sinistra e una sequenza di DNA di 50 bp a valle del sito di scissione come regione HDR destra.
         NOTA: Per il gene TgCPL, il sito di scissione si trova tra i codoni di partenza e arresto. Così, i seguenti primer sono progettati per amplificare il modello di riparazione utilizzando pMDC64 come modello, che codifica una cassetta di resistenza alla pirimethamina. Le sequenze in nero anneal al plasmide pMDC64 per amplificazione PCR. Le regioni etichettate in rosso sono sequenze specifiche di TgCPLper la ricombinazione omologa.
         
   2. Eseguire PCR utilizzando un premix PCR nelle condizioni PCR descritte nella tabella 4.
   3. Eseguire il prodotto PCR su un gel di agarose (Figura 3E), seguito dall'estrazione del gel e dalle procedure standard di quantificazione dell'acido nucleico.
      NOTA: se la banda prevista non può essere amplificata correttamente, ottimizzare le condizioni PCR e/o cambiare le coppie di primer.
3. Trasfezione toxoplasma
   1. PassareRHku80::NLuc parassiti per 2 giorni in una fiaschetta T25 contenente HFF confluenti. Una fiaschetta T25 di parassiti completamente lisci è sufficiente per due o tre trasfettazioni.
   2. Siringa e parassiti purificanti dal filtro come descritto al punto 1.2. Risospendere i parassiti nel tampone di citomix e girare verso il basso a 1.000 x g per 10 min a RT.
   3. Lavare i parassiti pelleta con 10 mL di tampone di citomix e far girare verso il basso i parassiti a 1.000 x g per 10 min a RT.
   4. Versare con attenzione il supernatante e risospendere i parassiti nello stesso buffer ad una concentrazione di 1 x 10⁸ parassiti/mL.
   5. Mescolare 2 g di DNA modello di riparazione con 20 g di plasmidi espressione sgRNA/Cas9 (rapporto di massa : 1:5, equivalente a un rapporto molare 1:3). Se la resa dell'amplificazione del modello di riparazione è bassa, ridurre di conseguenza l'input di entrambi i pezzi di DNA. È possibile utilizzare un minimo di 0,5 g di modello di riparazione.
   6. Mescolare 400 l di resospensione parassita, DNA, e 5 . Portare il volume totale a 500 o L con tampone di citomix, se necessario.
   7. Trasferire la miscela di parassiti e DNA in una cuvette di elettroporazione (larghezza 4 mm di gap) ed eseguire l'elettroporazione (2 kV tensione, resistenza 50 ) utilizzando un apparato di elettroporazione.
   8. Trasferire i parassiti elettroporati in un flacone T25 contenente HFF confluenti nel mezzo D10 fresco. Applicare antibiotico appropriato per la selezione di farmaci dopo 24 h.
   9. Mantenere la pressione selettiva del farmaco fino a quando la crescita dei parassiti transgenici è stabile.
   10. Purifica il DNA genomico dalla popolazione knockout e verifica l'integrazione della cassetta di resistenza alla pirimethamina nel locus TgCPL da PCR. Dopo la verifica, passare alla sezione 3.4. In caso contrario, eseguire un altro giro di trasfezione parassita e selezione di farmaci. L'incapacità di rilevare la corretta integrazione della cassetta di resistenza ai farmaci di solito suggerisce che il gene bersaglio è essenziale o che il locus genico non è accessibile.
4. Clonazione di parassiti da urlo
   1. Semina due 96 microplacche ben con cellule HFF e incuba a 37 e 5% di CO₂ per 1 settimana prima di clonare i parassiti.
   2. Passare 0,3-0,4 mL della popolazione di parassiti transgenici in una fiaschetta T25 contenente HFF confluenti e farli crescere per 2 giorni. Considerare il passaggio di più parassiti se il mutante mostra difetti di crescita.
      NOTA: Per ottenere la migliore resa e vitalità, le cellule ospiti sono fortemente infettate dai parassiti e la maggior parte dei parassiti sono mantenuti nello stadio intracellulare.
   3. Siringa infettato cellule ospiti e filtranti parassiti appena lised come menzionato nel passo 1.3. Risospendere i parassiti nel mezzo D10 e farli scendere a 1.000 x g per 10 min a RT.
   4. Risospendere i parassiti pelleta in 10 mL di D10 medio.
   5. Contare i parassiti usando un emocitometro per determinare la concentrazione di parassiti.
   6. Condurre una diluizione in due fasi per portare la concentrazione a 10 parassiti/mL nel mezzo D10 integrato con l'antibiotico appropriato. Di solito, la resospensione iniziale del parassita viene diluita di 1.000 volte, seguita da una seconda diluizione a 10 parassiti/mL.
   7. Aspirati supporti da 96 microplacche contenenti HFF confluenti e inoculati 150 -L di parassiti diluiti in ogni pozzo.
   8. Incubare piastre a 37 gradi centigradi con 5% di CO₂ per 7 giorni senza disturbi per consentire la formazione di placca. Il periodo di incubazione può essere più lungo se i parassiti transgenici presentano difetti di crescita.
   9. Schermare le piastre utilizzando un microscopio a contrasto di fase e contrassegnare solo i pozze contenenti una singola placca.
   10. Eseguire colonia PCR per identificare i cloni corretti.
       1. Utilizzare punte pipette per raschiare il fondo di ogni pozzo per sollevare monostrati HFF infetti.
       2. Pipet 75 -L della sospensione cellulare da ciascuno marcato bene in tubi di microcentrifuga da 1,5 mL.
       3. I tubi di centrifuga per 10 min alla massima velocità a RT. Aspirano con attenzione il superatante e risospendono nuovamente il pellet in 10,25 l di buffer di lisi contenente buffer di diluizione e additivo per il rilascio del DNA fornito nel kit (Tabella dei Materiali).
       4. Incubare i campioni per 4 min a RT, quindi 2 min a 98 gradi centigradi. Successivamente, i campioni possono essere utilizzati per la PCR o conservati a -20 gradi centigradi fino all'uso. Tre serie di reazioni PCR sono utilizzate per testare l'integrazione della cassetta di resistenza ai farmaci e la perdita del gene di interesse (Figura 4A). Fare riferimento alla tabella 5 per l'impostazione della reazione PCR e alla tabella 6 per le impostazioni del termociclore.
   11. Identificare i cloni corretti e trasferire quattro cloni in flaconi T25 contenenti HFF confluenti.
   12. Dopo che singoli cloni lisizzano le cellule ospiti, purifica il DNA genomico per un'ulteriore verifica PCR.
   13. Se è disponibile un anticorpo che riconosce la proteina di interesse, seguire una procedura di immunobloment standard per verificare la perdita della proteina bersaglio nei correggere knockout Toxoplasma. Immagini rappresentative per lo screening di un mutante TgCPL-deletion sono mostrate nella figura 4B,C.

La figura 1 rappresenta un esempio di una curva di crescita per la deformazioneRH-ku80::NLuc e il calcolo derivato per il tempo di raddoppio. Generalmente, il saggio viene eseguito in tre repliche tecniche per ciascuna delle tre repliche biologiche per tenere conto delle variazioni delle letture di attività luciferasi. Al fine di calcolare il cambiamento di piega normalizzata della crescita del parassita, ogni lettura a 24-96 h post-infezione è stata divisa dalla lettura iniziale a 4 h post-infezione, che riflette la quantità iniziale di parassiti vivi nel saggio (Figura 1A, B). In termini di determinazione del tempo di raddoppio dei parassiti, i valori log2 dei cambiamenti di piega normalizzata della crescita del parassita sono stati tracciati rispetto a ogni punto temporale. Successivamente, il grafico è stato sottoposto a una funzione di regressione lineare per ottenere la pendenza, che rappresenta il tempo di raddoppio (Figura 1C).

I efficaci di inibizione di LHVS nei ceppi wild-type ez cpl sono stati determinati tramando le attività di luciferasi contro otto concentrazioni di inibitori nella Figura 2. È essenziale includere le cellule infette senza trattamento inibitore per la normalizzazione delle attività di luciferasi crude nel saggio. Inoltre, è necessario un esperimento fittizio eseguito in una microplacca chiara per il saggio per garantire che i parassiti siano ancora in fase intracellulare alla fine del periodo di analisi.

Nella Figura 3, viene mostrata la generazione e la convalida di un costrutto di espressione sgRNA destinato a TgCPL e la produzione di un modello di riparazione per l'eliminazione TgCPL. La corrispondenza di 20 bp dello sgRNA con il gene TgUPRT codificato nel plasmide originale è stata mutata nella sequenza di DNA che colpisce il gene TgCPL tramite la mutagenesi diretta al sito basato sulla PCR. Per raggiungere questo obiettivo, le sequenze di DNA che codificano per gli sgRNA che riconoscono geni diversi sono state progettate per il primer in avanti, mentre l'innottimo inverso è stato mantenuto invariato per semplificare la progettazione del primer.

Figura 3A mostra una regione ingrandita delle sequenze di DNA sgRNA che prendono di mira il gene TgUPRT nel modello originale plasmide, nonché il set di primer utilizzato per la generazione del vettore di espressione sgRNA linearizzato. La figura 3B mostra un'immagine rappresentativa del gel rappresentativo del plasmide di espressione sgRNA lineizzata TgCPL. La figura 3C mostra la digestione di endonuclease di restrizione del plasmide di espressione sgRNA circolato tgCPL. Un primer inverso M13 è stato utilizzato per sequenziare l'RNA guida incorporato all'interno del vettore di espressione sgRNA generato per il gene specifico. Nella figura 3D, la regione del DNA sequenziata è stata allineata al modello plasmide per la conferma della mutagenesi riuscita. Figura 3E illustra le regioni di inizio e fine della cassetta di resistenza al pirifhamina, che mostra dove i primer possono annettere per la produzione del modello di riparazione per la delezione del gene TgCPL. Il modello di riparazione è stato amplificato IN PCR e caricato in un gel di agarose 1% per la verifica delle dimensioni e l'estrazione del gel.

La strategia complessiva per la generazione e lo screening del knockout TgCPL è illustrata nella Figura 4. Tre set di primer illustrati nella Figura 4A sono stati utilizzati per vagliare TgCPL-deletion parassiti per la corretta integrazione di 5'- e 3'-AGM e l'eliminazione della sequenza di codifica TgCPL. Come illustrato nella Figura 4B, in genere, da sette a otto cloni vengono selezionati inizialmente per lo screening. Lo screening di solito inizia con il controllo per la cancellazione della sequenza di codifica per il gene di interesse. Questo è seguito dal rilevamento di 5' e 3'-ARM, che aiuta a ridurre al minimo il numero totale di cloni da vagliare. Ulteriori verifiche mediante immunoblotting mostrate nella Figura 4C possono essere completate se è disponibile un anticorpo che riconosce la proteina bersaglio.

Figura 1: Quantificazione della crescita intracellulare per i parassiti di Toxoplasma utilizzando un metodo a base di luciferasi. (A) Letture di attività luciferare grezze in un software per fogli di calcolo. Le letture a 24 h, 48 h, 72 h, e 96 h post-infezione sono state normalizzate contro le letture iniziali a 4 h post-infezione per calcolare i cambiamenti di piega nella crescita del parassita. (B) I dati normalizzati sono stati stampati e tracciati. (C) Anche i valori log2 dei cambiamenti di piegatura sono stati tracciati e sottoposti a regressione lineare per la determinazione del tempo di raddoppio del parassita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Valutazione dell'efficacia dell'inibizione di LHVS e pirifamina utilizzando il saggio di crescita basato sulla luciferasi. I parassiti sono stati inoculati in una microplacca da 96 pozzetto per 4 h per consentire l'invasione delle cellule ospiti. I parassiti non invasi sono stati lavati via, e la piastra è stata riempita con supporti contenenti diverse concentrazioni di LHVS o pirithamina e incubato per un ulteriore 96 h prima della determinazione dell'attività luciferasi. Le letture delle luciferasi misurate per i parassiti trattati con concentrazioni di inibitori individuali sono state normalizzate contro il segnale rilevato da parassiti non trattati. I dati sono stati tracciati in un programma di grafici ed è stata eseguita un'analisi di regressione per la determinazione di IC_50. Il saggio è stato ripetuto in tre repliche biologiche con tre repliche tecniche ciascuna. I dati rappresentano la media : SEM, n - 3 repliche biologiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Generazione del costrutto plasmide che esprime sgRNA mirata TgCPL e produzione di un modello di riparazione per l'eliminazione TgCPL. (A) Il plasmide²³ originale di pSAG1-Cas9-sgRNA-UPRT è stato modificato tramite un kit di mutagenesi diretto in loco per la sostituzione dello sgRNA che punta il gene TgUPRT al TgCPL. La regione di codifica dello sgRNA è ingrandita per mostrare le aree in cui i primer anneal. Dopo la PCR, il plasmide mutato è stato linearizzato e caricato in un gel di agarose dell'1% per verificare l'amplificazione di successo, seguita dall'estrazione del gel. (B) L'immagine gel del costrutto di espressione sgRNA linearizzata amplificata PCR. (C) Dopo l'estrazione del gel, il prodotto PCR è stato circularizzato e successivamente trasformato in E. coli. I cloni contenenti i plasmidi attesi sono stati sottoposti a screening per restrizione della digestione endonucleasi e del sequenziamento del DNA. Le dimensioni della banda dopo la digestione del DNA erano di 7,2 bp e 2,4 kb. La banda generata da scissione non specifica da endonucleases è etichettata da un asterisco. (D) L'primer inverso M13 etichettato nella figura è stato utilizzato per sequenziare la regione dell'RNA guida mutata all'interno del vettore di espressione sgRNA generato da TgCPL. La regione del DNA sequenziata è stata allineata al modello plasmico per confermare la mutagenesi di successo. (E) In questo studio, le regioni omologhe da 50 bp corrispondenti alle 5' e 3'-UTR della TgCPL sono state progettate nelle prime adire per amplificare il modello di riparazione e affiancate alle estremità 5' e 3'-estremità della cassetta di resistenza alla pirorehamina della PCR, rispettivamente. L'elettroforesi gel di Agarose è stata utilizzata per verificare la dimensione corretta del prodotto PCR prima dell'estrazione del gel. La dimensione prevista del modello di riparazione è di 2,7 kb. Di solito, 5-6 g di modello di riparazione può essere ottenuto da 200 .L di reazione PCR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: PCR e conferma immunoblofare dei parassiti tgCPL-deficienti. (A) Un diagramma schematico che illustra le strategie generali di TgCPL-deletion in Toxoplasma e lo screening basato su PCR dei cloni da eliminazione corretti tgCPL. I primer utilizzati per lo screening sono etichettati. (B) L'elettroforesi gel PCR e agarose sono stati utilizzati per selezionare cloni contenenti la corretta integrazione della cassetta di resistenza alla pirithamina nel locus TgCPL e la perdita del gene TgCPL. Il DNA genomico della popolazione dicpl è servito come controllo positivo per il rilevamento 5'- e 3'-ARM, mentre il DNA genomico WT è stato utilizzato per la rilevazione del gene TgCPL come controllo positivo. L'acqua è stata usata al posto del modello di DNA nelle reazioni PCR per fungere da controllo negativo. Le bande previste sono indicate da frecce, mentre le amplificazioni PCR non specifiche sono etichettate da asterischi. (C) Il clone 1 identificato dallo screening PCR è stato coltivato nella coltura dei tessuti per la preparazione del lisato delle cellule e un'ulteriore analisi dell'immunoblotting per confermare la perdita di espressione TgCPL nel knockout. TgActin è stato utilizzato come controllo di carico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Impostazioni del lettore di microplasi per la misurazione dell'attività luciferate durante il saggio di crescita Toxoplasma basato su luciferate.

Tabella 2: Impostazioni termocicliche per la generazione del vettore di espressione sgRNA.

Tabella 3: Ricetta di reazione per la circolarizzazione del vettore di espressione sgRNA.

Tabella 4: Impostazione termociclore per la generazione del modello di riparazione.

Tabella 5: Colony PCR ricetta reazione per lo screening singoli cloni Toxoplasma.

Tabella 6: Impostazione termociclore per lo screening di singoli cloni Toxoplasma.

Tabella supplementare 1: Ricette per i buffer.

Questo protocollo descrive un protocollo basato su luciferasi per valutare la crescita intracellulare del Toxoplasma e valutare l'efficacia dell'inibizione dei composti chimici contro la crescita dei parassiti. Rispetto alle strategie esistenti per misurare la crescita intracellulare del Toxoplasma, questo metodo presenta un'elevata sensibilità e specificità. Durante il monitoraggio della crescita del parassita, si raccomanda un saggio fittizio in una micropiastra chiara 96 bene per confermare che il ceppo testato non lisi prematuramente le cellule ospiti prima della fine del periodo di valutazione. In caso contrario, le letture della luminescenza non rifletteranno accuratamente la crescita dei parassiti, poiché Toxoplasma si replica solo all'interno delle cellule ospiti.

È stato osservato che il tincolo rosso fenolo discide rapidamente l'attività di luciferasi, il che può comportare differenze significative nelle letture di luciferasi tra le repliche tecniche a causa di un ritardo nelle misurazioni individuali dei pozzi da parte del lettore di piastre. Pertanto, è ottimale preparare gli HFF in mezzo fenolo rosso-libero prima della seeding nelle 96 microplacche del pozzo. Inoltre, nel caso di alta attività di luciferasi, l'interferenza cross-well può portare a variazioni significative tra i pozzi vicini che mostrano una forte attività di luciferasi. Quindi, si consiglia di posizionare una colonna vuota tra ogni ceppo.

In particolare, per il ceppoRH-ri::NLuc, 1.500 parassiti vengono inoculati in ogni pozzo per il saggio di crescita. Dal momento che il tempo di raddoppio per i parassiti WT Toxoplasma è di 6-8 h²⁴, si prevede un aumento dell'attività di luciferasi da 8 a 16 volte a 24 h post-infezione. Tuttavia, alcuni ceppi con difetti di crescita significativi produrranno solo un leggero aumento dell'attività luciferasi. Pertanto, se l'inoculo parassita iniziale è basso, la variazione intrinseca nell'attività luciferasi maschera l'osservazione di un aumento della luminescenza durante il periodo di crescita. Quindi, si raccomanda di inoculare un numero maggiore di parassiti per ottenere un cambiamento di piegatura accurato per i ceppi con carenze di crescita.

Nel protocollo, la progettazione dell'RNA guida segue le regole generali utilizzate per la modifica del genoma a base di CRISPR-Cas9 nelle cellule dei mammiferi²⁵. Attualmente, molti tipi di software e piattaforme online forniscono servizi per la progettazione di RNA guida in vari organismi, come CHOPCHOP²⁶, E-CRISP²⁷, e EuPaGDT²⁸. Qui, il software commerciale (Tabella dei materiali) viene utilizzato per progettare sgRNA. Rispetto ai programmi online menzionati in precedenza, questo software fornisce un ambiente locale per la progettazione di sgRNA. Calcola i punteggi di attività e specificità per ogni sgRNA candidato utilizzando un algoritmo pubblicato in precedenza^25,29.

Tecnicamente, qualsiasi sgRNA situato all'interno di un gene di interesse che contiene un punteggio di alta specificità può mediare in modo efficiente la scissione del DNA genomico per la ricombinazione dipendente dall'omologia a valle. In pratica, è preferibile il targeting sgRNA per una regione vicina all'inizio o all'arresto del codon. I geni di interesse possono essere endogeniamente etichettati con lo sgRNA, che genera una fessura a doppio filamento alla fine del gene. La marcatura endogena di un gene prima della sua delezione aiuterà a confermare la perdita genica tramite il rilevamento immunoblotante nel caso in cui non sia disponibile un anticorpo contro la proteina di interesse. L'etichettatura dell'epitopo di un gene può anche aiutare a determinare la posizione subcellulare della proteina di interesse tramite la microscopia immunofluorescenza. Inoltre, se il gene bersaglio è essenziale, lo sgRNA che riconosce la regione iniziale del gene può essere utilizzato per sostituire il suo promotore di cognati con un promotore che risponda alla tetraciclina per generare un knockout condizionale.

Inoltre, il protocollo descrive una tecnica per la delezione del gene nel Toxoplasma sostituendo il gene TgCPL con una cassetta di resistenza alla pirithamina. Utilizzando diversi modelli di plasmide che codificano altre cassette di resistenza ai farmaci, i ricercatori possono modificare le sequenze di primer per incorporare altri geni di resistenza agli antibiotici nel modello di riparazione tramite PCR. Inoltre, questo protocollo può essere modificato per eseguire altre modifiche del genoma, come l'etichettatura genica endogena, la sostituzione del promotore e la mutagenesi diretta al sito. È interessante notare che le regioni omologhe utilizzate in questo protocollo hanno una lunghezza di soli 50 bp. Uno studio separato ha usato con successo sequenze di DNA omologate 40-43 bp per introdurre mutazioni mononucleotidi e tag genetici epitopi nei parassiti di Toxoplasma ²². Le sequenze di DNA omologhe di tale lunghezza breve possono essere facilmente incorporate nei primer. Anche se non abbiamo valutato quantitativamente l'efficienza HDR per questa particolare lunghezza della regione omologa, sembra che una regione di 40-50 bp sia sufficiente per una ricombinazione efficiente del DNA nel ceppo Toxoplasma carente di TgKu80,come dimostra la corretta manipolazione genetica di diversi geni recentemente raggiunta^15,22.

Durante la determinazione dell'efficacia dei composti chimici, se il gene bersaglio prospettico è essenziale, un confronto dei cambiamenti nei valori di IC₅₀ tra i ceppi wild-type e knockout non è pratico. In questo scenario, è necessario un saggio che misura direttamente la capacità dei composti chimici di inibire l'attività proteica ricombinante per valutare l'efficacia e la specificità dei farmaci. La letteratura recente ha riportato i punteggi di idoneità dei singoli geni nel Toxoplasma eseguendo uno schermo CRISPR³⁰a livello di genoma, che può servire come guida per aiutare a valutare la difficoltà di generare un mutante ad eliminazione diretta per il gene di interesse.

Nel loro insieme, il protocollo descrive il completamento di un test sulla crescita intracellulare di Toxoplasma basato sulla luciferasi e una strategia di valutazione per gli inibitori chimici contro la crescita del tossoplasma. Inoltre, è stato dettagliato un protocollo di editing del genoma basato su CRISPR-Cas9 per la delezione genica nei parassiti Toxoplasma, ampiamente utilizzato nel campo. I singoli laboratori possono modificare il protocollo descritto in base alle esigenze sperimentali, come l'etichettatura genica endogena, la commutazione dei marcatori di selezione dei farmaci e la modifica del periodo di valutazione per la crescita dei parassiti intracellulari.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli autori desiderano ringraziare i dottori Sibley e Carruthers per aver condiviso pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid e anticorpi anti-TgCPL e TgActin. Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo Clemson Startup (a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.