Identificazione dei percorsi host mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando la tossicità del lievito e gli schermi soppressori

I patogeni batterici secernono proteine nell'ospite che prendono di mira processi biologici cruciali. Identificare le vie host mirate alle proteine degli effetti batterici è fondamentale per affrontare la patogenesi molecolare. Qui, viene descritto un metodo che utilizza un soppressore di lievito modificato e uno schermo di tossicità per chiarire le vie dell'ospite mirate alle proteine degli efettori batterici tossici.

I batteri intracellulari secernono fattori di virulenza chiamati proteine eftraenti nel citosol ospite che agiscono per sovvertire le proteine ospiti e/o i loro percorsi biologici associati a beneficio del batterio. L'identificazione delle proteine degli effetti batterici putativi è diventata più gestibile grazie ai progressi nel sequenziamento del genoma batterico e all'avvento di algoritmi che consentono l'identificazione in silico dei geni che codificano i candidati alla secrezione e/o quelli eucarioti Domini. Tuttavia, l'identificazione di questi importanti fattori di virulenza è solo un primo passo. Naturalmente, l'obiettivo è quello di determinare la funzione molecolare delle proteine efmarcatori e chiarire come interagiscono con l'ospite. Negli ultimi anni, tecniche come lo schermo bi-ibrido del lievito e le immunoprecipitazioni su larga scala accoppiate con la spettrometria di massa hanno aiutato nell'identificazione delle interazioni proteina-proteina. Sebbene l'identificazione di un partner di legame ospite sia il primo passo fondamentale per chiarire la funzione molecolare di una proteina efmarcatore batterica, a volte la proteina ospite si trova ad avere molteplici funzioni biologiche (ad esempio, actina, clathrin, tubulina), o la proteina batterica non può legare fisicamente le proteine ospiti, privando il ricercatore di informazioni cruciali sulla precisa via ospite manipolata. È stato adattato uno screening di tossicità del lievito modificato abbinato a uno schermo soppressore per identificare le vie dell'ospite influenzate dalle proteine degli effetti batterici. Lo schermo di tossicità si basa su un effetto tossico nel lievito causato dalla proteina efcontadina che interferisce con i percorsi biologici ospiti, che spesso si manifesta come un difetto di crescita. L'espressione di una libreria genomica del lievito viene utilizzata per identificare i fattori ospiti che sopprimono la tossicità della proteina degli effetti batterici e quindi identificano le proteine nel percorso che la proteina esecutore prende di mira. Questo protocollo contiene istruzioni dettagliate sia per le schermate di tossicità che per le schermate di soppressore. Queste tecniche possono essere eseguite in qualsiasi laboratorio in grado di clonazione molecolare e coltivazione di lievito ed Escherichia coli.

Il primo rapporto di procedure simili a quelle qui presentate ha caratterizzato l'effetto della legionella pneumophila di tipo IV SidD, una deAMPylase che modifica Rab1¹. Tecniche comparabili sono state utilizzate per la caratterizzazione di diversi effetti L. pneumophila ^1,2,3. Il saggio è stato adattato per caratterizzare una proteina effettore Coxiella burnetii tipo^{IV 4}, e recentemente l'utilità di questa tecnica è stata ampliata per la caratterizzazione delle proteine della membrana di inclusione della Chlamydia trachomatis ⁵ .

Questo protocollo può essere suddiviso in due parti principali: 1) lo schermo di tossicità del lievito, in cui la proteina dell'effettore batterico di interesse è espressa in lievito e i cloni vengono sottoposti a screening per un fenotipo tossico come evidenziato da un difetto di crescita, e 2) lo schermo soppressore del lievito , in cui il fenotipo tossico viene soppresso dall'espressione di una libreria genomica del lievito nel ceppo tossico. Pertanto, lo schermo di tossicità è uno schermo per i fenotipi tossici che si manifestano come difetti di crescita quando l'effetto batterico di interesse è sovraespresso. I cloni tossici, trasformati con successo ed esprimendo l'effettore batterico, vengono selezionati e salvati per la fase successiva. Il secondo passo importante consiste nell'esprimere sovraesprimenza di una libreria genomica di lievito parzialmente digerito nel clone del lievito tossico. I plasmidi che compongono la libreria genomica del lievito suggerita per l'uso in questo protocollo trasportano inserti da 5,20 kb, di solito corrispondenti a 3-13 telai di lettura aperti di lievito (ORF) di una dimensione media del gene di 1,5 kb su tutti i plasmidi, che rappresentano l'intero genoma del lievito coperto circa 10x. Questa parte del saggio è chiamata lo schermo del soppressore, in quanto l'obiettivo è sopprimere la tossicità della proteina dell'effettore batterico. I potenziali plasmidi soppressori sono isolati dal lievito, sequenziati e gli ORF soppressori identificati. La logica alla base dello schermo soppressore è che la proteina eflatrice si lega, interagisce e/o travolge i componenti del percorso host a cui si rivolge, e che fornire le proteine ospiti in eccesso può salvare l'effetto tossico sul percorso e quindi, il difetto di crescita. Pertanto, gli ORF identificati che sopprimono la tossicità spesso rappresentano più partecipanti di un percorso host. Vengono quindi eseguiti esperimenti ortogonali per verificare che l'effettuatore batterico interagisca effettivamente con il percorso implicato. Ciò è particolarmente necessario se è stato identificato un partner di legame come clathrin o actin, perché queste proteine sono coinvolte in una moltitudine di processi host. Ulteriori esperimenti possono quindi chiarire la funzione fisiologica della proteina dell'effettore durante l'infezione. Gli schermi di tossicità e soppressore sono anche potenti strumenti per decifrare la funzione fisiologica delle proteine degli effetti batterici che non legano fisicamente le proteine ospiti con affinità sufficienti da rilevare per immunoprecipitazioni o che interagiscono con il ospite in interazioni eseguito e con hit-and-run enzimatiche che potrebbero non essere rilevate da uno schermo ibrido yeast-two.

Anche se lo schermo soppressore può essere un metodo potente per rivelare potenziali interazioni fisiologiche tra le proteine degli effetti batterici e le vie dell'ospite, la proteina degli effetti batterici deve indurre un difetto di crescita nel lievito, altrimenti schermo soppressore sarà di scarsa utilità. Inoltre, il fenotipo tossico deve comportare una crescita di almeno 2-3 log₁₀ o sarà difficile identificare i soppressori. Se un laboratorio è impostato per la coltura cellulare, lo screening delle proteine effettori per la tossicità in linee cellulari comuni come HeLa può spesso fornire informazioni sul fatto che valga la pena procedere con lo schermo di tossicità del lievito. L'espressione ectopica della proteina esecutore nelle cellule HeLa a volte si traduce in una tossicità che correla fortemente con la tossicità nel ceppo di lievito utilizzato per questi schermi⁴. I segni osservabili di stress nelle cellule HeLa includono la perdita di fibre di stress, il distacco cellulare dalla piastra e la condensa nucleare che indica l'apoptosi. Qualsiasi indicazione visiva dello stress nelle cellule HeLa rende la proteina di interesse un buon candidato per indurre un difetto di crescita nel lievito, che si replicano molto più rapidamente e sono quindi più sensibili alla perturbazione delle vie essenziali.

Va notato che lo schermo del soppressore non sempre identifica i partner di associazione dell'ospite come soppressori, ma può ancora implicare componenti critici del percorso o dei percorsi host presi di mira, producendo una visione olistica dei processi biologici dirottati dal proteina degli effetti batterici. In superficie, questo sembra controintuitivo, perché fornire il partner legante della proteina efsiatore in eccesso ci si aspetterebbe per salvare il difetto di crescita. Nel tentativo di identificare i percorsi presi di mira dalla proteina eflacuta c.ocoficida CT229 (CpoS), che si lega ad almeno 10 diversi Rab GTPases durante l'infezione⁵, nessuno dei partner di legame Rab ha soppresso la tossicità del CT229. Tuttavia, sono stati identificati numerosi soppressori coinvolti nel traffico di vescicle rivestite di clatrari (CCV), il che ha portato a ulteriori lavori di dimostrando che il CT229 sovverte specificamente il traffico di CCV dipendente da Rab. Allo stesso modo, quando si studia la proteina effettore C. burnetii Cbu0041 (CirA) sono stati identificati diversi Rho GTPases che hanno salvato il difetto di crescita del lievito, e in seguito si è scoperto che CirA funziona come una PROTEINa attivando GTPase (GAP) per RhoA⁴.

L'utilità dello schermo del soppressore del lievito per chiarire le vie dell'ospite mirate alle proteine degli effetti batterici non può essere sopravvalutata, e altri ricercatori che tentano di caratterizzare le proteine degli effetti batterici intracellulari possono trarne grande beneficio queste tecniche. Questi saggi hanno un valore se le immunoprecipitazioni e/o gli schermi ibridi di lievito-due non sono riusciti a trovare un partner vincolante e possono chiarire quali vie sono prese di mira dalla proteina degli effetti batterici. Qui vengono forniti protocolli dettagliati per la tossicità e gli schermi soppressori per identificare i percorsi biologici dell'ospite presi di mira dalle proteine degli effetti batterici intracellulari, nonché alcuni degli ostacoli comuni incontrati quando si utilizzano questi saggi e i loro soluzioni corrispondenti.

1. Preparazione di supporti e reagenti

NOTA: Le piastre devono essere preparate prima del giorno del saggio e sono buone per 1 mese. I supporti e i reagenti possono essere realizzati in qualsiasi momento e sono buoni per 1 mese.

1. Preparare 1 L della soluzione per il glucosio (10% w/v) sciogliendo 100 g di glucosio D-() in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Regolare il volume a 1 L con acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterile da 0,2 m in una bottiglia sterile da 1 L.
2. Preparare 1 L della soluzione galactose (10% w/v) sciogliendo 100 g di D-(z)- galactose in 800 mL di acqua distillata in un becher 1 L. Regolare il volume a 1 mL utilizzando acqua distillata e filtrare attraverso un filtro sterile di 0,2 m in una bottiglia sterile da 1.000 mL.
3. Preparare 1 L di estratto di lievito peptone dextrose (YPD) agar sciogliendo 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 g di glucosio, e 20 g di agar in 1.000 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare a 56 gradi centigradi fino a raffreddare. Versare in piastre da 100 mm utilizzando 20 mL di supporti per piastra.
4. Preparare 1 L di brodo YPD sciogliendo 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone e 20 g di glucosio in 1.000 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min.
5. Preparare l'uracile di abbandono sintetico (Ura^{- ).} Per 1 L, sciogliere 6,7 g di base di lievito senza aminoacidi, 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil e 15 g di agar in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50-60 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 mL della soluzione di glucosio preparata al punto 1.1. Mescolare bene vorticoso o mettere su piastra di mescolare. Versare in piastre da 100 mm utilizzando 20 mL di supporti per piastra.
6. Preparare l'uracil di dropout sintetico (Ura^-) agar galactose. Per 1 L, sciogliere 6,7 g di base di lievito senza aminoacidi, 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil e 15 g di agar in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50-60 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 mL della soluzione galactose preparata al passaggio 1.2. Mescolare bene vorticoso o mettere sul piatto di mescolare. Versare in piastre da 100 mm utilizzando 20 mL di supporti per piastra.
7. Preparare l'uracile di abbandono sintetico (SD) (Ura^-) brodo di glucosio. Per 1 L, sciogliere 6,7 g di base di lievito senza aminoacidi e 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50-60 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 ml o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 ml della soluzione di glucosio preparata al punto 1.1.
8. Preparare l'uracile di abbandono sintetico (SD) (Ura^-) leucina (Leu^-) agar di glucosio. Per 1 L, sciogliere 6,7 g della base di azoto di lievito senza aminoacidi; 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil, leucina e eurptofano; 15 g di agar; e 0,076 g di metatofano in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50-60 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 mL della soluzione di glucosio preparata al punto 1.1. Versare in piastre da 100 mm utilizzando 20 mL di supporti per piastra.
9. Preparare l'uracil di dropout sintetico (Ura^-) leucina (Leu^-) agar galactose. Per 1 L, sciogliere 6,7 g di base di azoto di lievito senza aminoacidi; 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil, leucina e eurptofano; 15 g di agar; e 0,076 g di metatofano in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50-60 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 mL della soluzione galactose preparata al passaggio 1.2. Mescolare bene vorticoso o mettendosu una piastra di mescolare. Versare in piastre da 100 mm utilizzando 20 mL di supporti per piastra.
10. Preparare l'uracil di dropout sintetico (Ura^-) brodo di glucosio (Leu^-). Per 1 L, sciogliere 6,7 g di base di azoto di lievito senza aminoacidi; 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil, leucina, eurfano; e 0,076 g di metatofano in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56-60 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 mL della soluzione di glucosio preparata al punto 1.1.
11. Preparare la soluzione PEG (Polyetilene glicole). Aggiungere il 50% w/v di glicole di polietilene 3350 in acqua distillata. Sterilizzare autoclaving.
12. Preparare 1 M di acetato di litio (LiAc) sciogliendo 10,2 g di disidratazione di acetato di litio in 200 mL di acqua distillata. Sterilizzare autoclaving.
13. Preparare il DNA dello sperma di aringhe. Diluire 10 mg/mL di DNA di sperma di aringhe a 2 mg/mL utilizzando acqua distillata. Riscaldare a 100 gradi centigradi per 5 minuti e mettere immediatamente sul ghiaccio per 5 minuti.

2. Clonazione del gene di interesse nel plasmide di tossicità del lievito pYesNTA-Kan

NOTA: Attualmente, ci sono una varietà di vettori di tossicità del lievito disponibili sia commercialmente che accademicamente. Lo schermo del soppressore del lievito può essere utilizzato in combinazione con molti di questi vettori a condizione che il plasmide che esprimo la proteina effettrice di interesse utilizzi una selezione di dropout diversa dall'uracile e da un marcatore antibiotico diverso da Bla^R. Questo lavoro ha utilizzato un vettore pYesNTA modificato^4,5 che include una cassetta di resistenza alla kanamicina per uno screening più semplice per potenziali soppressori. Lo schema di clonazione deve consentire che la proteina efsiatrice sia in-frame con il promotore Gal e His-Tag. La proteina membrana di inclusione Chlamydia CT229 è stata utilizzata come prova di principio per questi saggi.

1. Utilizzare la PCR per amplificare il CTR229 dal DNA genomico di C. trachomatis seguendo le istruzioni del produttore utilizzando i primi di TE229 Kpn F (CCGGTACCAATGAGAGTTCTAGTTAATTAGTGTGT) e CT229 XhoI R (CCCTCGAGTTTTTTTCTCTCTCGGGGGGCC). Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: (1) 98 gradi centigradi per 30 s; (2) 98 gradi centigradi per 10 s, 55 gradi centigradi per 30 s, 72 gradi centigradi per 2 min; (3) ripetere il passaggio 2 per un totale di 25x; (4) 72 gradi centigradi per 10 min; e (5) attesa di 4 gradi centigradi.
2. Analizzare 5 -L del prodotto PCR su un 1% gel di agarose (Figura 1).
3. Purificare i restanti 45 gradi di DNA utilizzando un kit di purificazione PCR seguendo le istruzioni del produttore.
4. Digerire il 50 -L di inserto PCR purificato e pYesNTA-Kan (Figura 2) per 1 h a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua utilizzando KpnI-HF e XhoI-HF.
   NOTA: Per pYesNTA-Kan, digerire 5 g di plasmide utilizzando 5 L di KpnI-HF, 5 l di XhoI-HF e 6 l di buffer in un volume totale di 60 l. Per l'inserto, digerire l'intero 50 o L di prodotto PCR purificato utilizzando 2 L di KpnI-HF, 2 L di XhoI-HF e 6 L di buffer.
5. Eseguire l'intero digest del plasmide su un gel di agarose dell'1%. Eseguire la purificazione del plasmide digerito utilizzando un kit di estrazione gel seguendo le istruzioni del produttore.
6. Purificare l'inserto PCR digerito utilizzando un kit di purificazione PCR seguendo le istruzioni del produttore.
7. Clonare l'inserto in pYesNTA-Kan utilizzando 2 l di pYesNTA-Kan (passaggio 2,5), 2 -L di buffer di ligase di DNA, 1 L di T4 ligase e 15 L di inserto (passaggio 2.6). Incubare a temperatura ambiente per 1 h.
8. Aggiungere l'intera reazione di clonazione a 50 -L di cellule competenti di E. coli ed eseguire la reazione di trasformazione.
9. Piastrare l'intera reazione di trasformazione su una piastra LB contenente 100 g/mL di carbenicillina.
10. Inoculare 10 mL del LB contenente 100 g/mL di carbenicillina con tre colonie individuali. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/min.
11. Isolare il plasmide utilizzando un kit miniprep plasmio seguendo le istruzioni del produttore.
12. Sequenziare i plasmidi isolati usando primer specifici del gene (passaggio 2.1).

3. Testare la proteina di interesse per la tossicità nel lievito

1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 su YPD agar (passaggio 1.3) per ottenere colonie isolate. Incubare a 30 gradi centigradi per 24 ore.
2. Inoculare 10 mL di brodo YPD (passaggio 1.4) con una singola colonia dalla piastra di agar (passaggio 3.1). Incubare a 30 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/mdurante.
3. Aggiungere 0,5 mL della coltura notturna a 10 mL di brodo YPD (passaggio 1.4) e incubare a 30 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/mper per 4 h.
   1. Pellet i 10 mL di coltura a 3.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
   2. Risospendere il pellet in 1 mL di acqua sterile, trasferire al tubo di microcentrifuga e pellet a 3.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.
   3. Risospendere il pellet in 1 mL di acetato di litio da 1 mM (LiAc) e pellet a 3.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.
   4. Ripetere il lavaggio LiAc 2x.
   5. Rimuovere il lavaggio. Risospendere il pellet in 2,4 mL del 50% PEG 3350. Aggiungete 360 luna di 1M LiAc, 500 l l di 2 mg/mL di DNA di sperma di aringhe e 400 l di acqua sterile.
      NOTA: questo è sufficiente per 20 trasformazioni.
   6. Aggiungete 180 l della miscela di trasformazione dal passo 3.3.5 a un tubo di microcentrifuga contenente 5 L di pYesNTA-Kan CT229 dna plasmid (100-500 ng) dal passo 2.12.
   7. Incubare in un bagno d'acqua a 30 gradi centigradi per 30 min.
   8. Incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi centigradi per 30 min.
   9. Pellet a 3.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.
   10. Rimuovere il mix di trasformazione con la pipetta. Risospendere il pellet in 100 litri di acqua sterile. Piastra la trasformazione su SD Ura^- agar con glucosio (passaggio 1.5).
   11. Incubare piastre a 30 gradi centigradi per 48 ore.
4. Inoculare 5 mL di SD Ura^- brodo contenente glucosio (passaggio 1.7) con una singola colonia dalla piastra. Incubare pernottamento a 30 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/min. Includere il lievito trasformato con il solo vettore come controllo negativo.
   1. Aggiungete 180 l di acqua sterile a 5 pozze di una piastra di 96 pozze (A2-A6).
   2. Vorticare la cultura durante la notte per mescolare.
   3. Aggiungere 180 l di lievito al primo pozzo (A1). Diluire in serie 1:10 (sei campioni in totale, incluso non diluito).
   4. Utilizzando una pipetta multicanale, individuate 5 lun di ogni diluizione su SD Ura^- glucosio (passaggio 1.5) e Ura^- galactose (passaggio 1.6) piastre di agar. Incubare a 30 gradi centigradi per 48 ore.
5. Valutare la tossicità confrontando la crescita del lievito esprimendo la proteina eftraitrice di interesse coltivata sui supporti contenenti galactosi con la crescita del lievito che esprime il solo vettore.
6. Confermare l'espressione della proteina di fusione His-tag mediante gonfiore occidentale.

4. Trasformare il lievito tossico con la libreria genomica del lievito

1. Inoculare 100 mL di SD Ura^- brodo di glucosio (passaggio 1.7) utilizzando 1 mL del brodo dal passo 3.4. Incubare per 16-24 h a 30 gradi centigradi con agitazione a 150 giri al rinfuso. Mettere 900 mL di SD Ura^- brodo di glucosio a 30 gradi durante la notte per preriscaldare i media.
2. Aggiungere l'intero 100 mL della coltura notturna al pallone preriscaldato da 1 L L. Incubare per 4/5 h a 30 s con agitazione a 150 giri/min.
   1. Pellet la coltura a 6.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
   2. Scartare il super-attardato. Risospendere il pellet in 250 mL di acqua sterile. Pellet la coltura a 6.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
   3. Scartare il super-attardato. Risospendere il pellet in 250 mL di 1 mM LiAc. Pellet la coltura a 6.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
   4. Rimuovere LiAc e risospendere il pellet in 9,6 mL del 50% PEG 3350. Aggiungere 1,44 mL di 1M LiAc, 2 mL di 2 mg/mL di DNA di spermatozoi da 2 mg/mL, 50 g della libreria genomica del pYep13 (ATCC 37323). Regolare il volume a 15 mL con acqua sterile. Mescolare delicatamente per inversione.
   5. Incubare in un bagno d'acqua a 30 gradi centigradi per 30 min.
   6. Aggiungere 750 l di zolfo dimetile (DMSO) per migliorare l'efficienza di trasformazione. Incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi centigradi per 30 min. Mescolare per inversione delicata ogni 10 min.
   7. Pellet il lievito a 3.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
   8. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di acqua sterile. Pellet a 3.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
   9. Risospendere il pellet in 8 mL di acqua sterile.
   10. Per determinare l'efficienza di trasformazione, diluire 1:10 e piastra 100 l di ogni diluizione su SD Ura^- Leu^- agar di glucosio (passaggio 1.8).
   11. Piastra 200 - L del campione su piastre SD Ura^- Leu^- galactose agar (passaggio 1.9). Utilizzare 50 piastre in totale.
   12. Incuba a 30 gradi centigradi per 48-96 h o fino a quando non appaiono colonie.
       NOTA: Le colonie appaiono generalmente sulle piastre di agar del glucosio a 48,72 h e sulle piastre di galactosi a 72-96 h.
3. Colonie di patch (potenziali salvataggi) su SD Ura^- Leu^- galactose agar (passaggio 1.9) per espandere e fare magazzino. Incubare a 30 gradi centigradi per 24-48h.
4. Inoculare 5 mL di SD Ura^- Leu^- brodo di glucosio (passaggio 1.10) utilizzando la parte del cerotto. Incubare pernottamento a 26 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/min.
   1. Aggiungete 180 l di acqua sterile a 5 pozze di una piastra di 96 pozze (A2-A6).
   2. Vorticare la cultura durante la notte per mescolare.
   3. Aggiungere 180 l di lievito al primo pozzo (A1). Diluire in serie 1:10 (sei campioni in totale, incluso non diluito).
   4. Utilizzando una pipetta multicanale, individua5 l'una di ogni diluizione su SD Ura^- glucosio e SD Ura^- piastre di agar galactose. Includere effettore tossico da solo come controllo.
   5. Incubare a 30 gradi centigradi per 48 ore.
5. Confrontare la crescita del lievito esprimendo l'effettore tossico da solo al lievito contenente i potenziali soppressori. Procedere solo con potenziali soppressori che hanno diminuito la tossicità rispetto al lievito che esprime l'effettore da solo.

5. Identificare e confermare i soppressori

1. Inoculare 5 mL di SD Ura^- Leu^- brodo di glucosio (passaggio 1.10) con 100 l di lievito dal passo 4.4 e incubare durante la notte a 30 s con agitazione a 150 giri/m.
   1. Pellet il lievito a 3.000 x g per 2 min a temperatura ambiente. Scartare delicatamente il supernatante usando una pipetta.
   2. Isolare il plasmide con un kit miniprep plisma plisma di lievito seguendo le istruzioni del produttore.
2. Trasformate il plasmide isolato nelle cellule competenti di E. coli e placcate l'intera trasformazione sull'agar LB con 100 g/mL di carbenicillina. Incubare a 37 gradi centigradi per 24 ore.
3. Inoculare 10 mL di brodo LB contenente 100 g/mL di carbenicillina, con tre colonie dalla piastra e incubare a 37 gradi durante la notte con agitazione a 150 giri/m.
   1. Colture pellet a 3.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Isolare il plasmide utilizzando un kit miniprep seguendo le istruzioni del produttore.
4. Ritrasformare il lievito tossico con i plasmidi isolati dal passo 5.3.1 seguendo i passaggi nella parte 3 del protocollo.
   1. Inoculato 5 mL di SD Ura^- Leu^- brodo di glucosio con una colonia dalla piastra di trasformazione. Incubare pernottamento a 30 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/min.
   2. Spot su Ura^- Leu^- agar di glucosio e galactose per confermare la soppressione della tossicità.
5. Sequenza utilizzando pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) e pYep13 R (TGATGCCGGCCACGAT) primer per identificare le ORF di lievito.

Prima di poter eseguire lo schermo del soppressore effettivo del lievito, la proteina dell'effettore di interesse deve essere testata per la tossicità nel lievito. Ciò si ottiene esprimendo la proteina di interesse per il lievito sotto il controllo di un promotore inducibile di galactose. La crescita del glucosio (condizioni non induttive) dovrebbe prima essere confrontata per garantire che la tossicità sia specificamente dovuta all'espressione della proteina di interesse e non sia un difetto generale. Come mostrato nella Figura 3, la tossicità si manifesta come colonie più piccole e/o crescita ridotta. Una diminuzione del log di 2/3 nella crescita del lievito è ideale per gli schermi di soppressore del lievito.

Come illustrato nella Figura 4, la tossicità e lo schermo soppressore possono essere eseguite in otto passaggi utilizzando i metodi descritti nella sezione relativa al protocollo. Il gene di interesse viene clonato in un vettore adatto¹e i costrutti risultanti vengono trasformati in lievito per valutare la tossicità. Questo studio ha usato il CT229 come gene di interesse e pYesNTA-Kan come vettore. Inoltre, l'espressione della proteina di fusione Con etichettatura His è stata confermata dal gonfiore occidentale. Idealmente, dovrebbe essere osservata una riduzione del log di 2/3 del lievito coltivato su supporti contenenti galactosi. Se la proteina di interesse è tossica per lievito (Figura 3 e Figura 4), lo schermo del soppressore può essere condotto trasformando il ceppo tossico con la libreria genomica del lievito pYep13. I trasformazioni sono placcati sull'agar del glucosio per determinare l'efficienza della trasformazione e l'agar galactose per identificare i potenziali soppressori. Utilizzando questo protocollo, è stata raggiunta un'efficienza di trasformazione minima di 5 x 10⁵ con un totale di 10-250 colonie sull'agar galactose. La patch di queste colonie su SD Ura^- Leu^- galactose agar (Figura 4) ha aiutato a individuare i veri soppressori, perché molti falsi positivi non cresceranno quando patchati. Qui sono state riparate 50 colonie e sono stati ottenuti otto cloni che hanno soppresso la tossicità degli esertori (Figura 4). Avvistare i soppressori su SD Ura^- Leu^- galactose agar è stato fatto per confermare la soppressione della tossicità. Come mostrato nella Figura 4, pSup1 e pSup 2 sopprimevano la tossicità della proteina eftraitrice, mentre pSup3 non lo ha fatto. Pertanto, pSup3 è stato scartato. I plasmidi sono stati successivamente isolati dai soppressori e trasformati in E. coli per aumentare la resa plasmide. Il plasmide può quindi essere ritrasformato nel lievito tossico per confermare che il plasmide isolato sopprime definitivamente la tossicità degli esertori (Figura 4). Mentre la maggior parte dei plasmidi isolati dovrebbe salvare la tossicità, occasionalmente si ottiene un plasmide che non sopprime la tossicità quando viene ritrasformata nel ceppo di lievito tossico. Questi plasmidi vengono scartati e solo quelli che sopprimono la tossicità dopo la ritrasformazione devono essere sequenziati.

Il plasmide isolato conterrà più ORF di lievito⁴. Per identificare quale sia il vero soppressore, ogni ORF può essere clonato individualmente ed espresso nel ceppo di lievito tossico come descritto in precedenza^1,2,3^,4.

Figura 1: amplificazione PCR del gene bersaglio. CT229 da Chlamydia trachomatis serovar L2 è stato PCR amplificato dal DNA genomico. I prodotti PCR sono stati analizzati su un gel di agarose dell'1% macchiato di bromuro di etidio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: mappa plasmid pYesNTA-Kan. Il gene bersaglio di interesse è stato clonato nel sito di clonazione multipla (MCS) di pYesNTA-Kan. Kanamycin è stato utilizzato per la selezione in E. coli e l'eliminazione dell'uracile è stata utilizzata per la selezione in S. cerevisiae. L'espressione della proteina di fusione con il suo taglio è stata verificata dalla gonfiore occidentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati rappresentativi della tossicità del lievito. Le proteine di interesse sono state clonate in pYesNTA-Kan. I plasmidi verificati dalla sequenza sono state trasformate in S. cerevisiae e i trasformatori sono stati diluiti e avvistati in serie su Ura^- agar di glucosio e galactose per valutare la tossicità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Panoramica dello schermo del soppressore del lievito. Il gene bersaglio di interesse è stato clonato in pYesNTA-Kan e plasmidi sono stati trasformati in S. cerevisiae. I trasformatori sono stati diluiti in serie e avvistati su Ura^- agar di glucosio e galactose per valutare la tossicità. Per identificare la via mirata dalla proteina degli eftori tossici, il ceppo di lievito che esprime la proteina tossica è stato trasformato con una libreria genomica del lievito. Le colonie sono state patchate su Ura^- Leu^- agar galactose e avvistati per valutare la tossicità. I plasmidi sono stati isolati da quelli che sopprimono la tossicità della proteina efvigorerice. I plasmidi sono stati ritrasformati nel ceppo di lievito tossico per confermare che il plasmide isolato è un soppressore. I plasmidi dei soppressori sono stati sequenziati per identificare gli ORF di lievito presenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo protocollo delinea le procedure passo-passo per identificare i percorsi biologici dell'ospite mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando una tossicità del lievito modificato e uno schermo soppressore. Il ceppo di lievito utilizzato, S. cerevisiae W303, è auxotrofico sia per uracil che per leucina. L'auxotrotrofia uracildela del ceppo viene utilizzata per selezionare il lievito che trasporta la proteina di interesse sul vettore pYesNTA-Kan, mentre l'auxotrotrotrotrofia leucita viene utilizzata per selezionare per il vettore della libreria genomica del lievito pYep13. I plasmidi della libreria genomica del lievito trasportano 3-13 ORF, quindi ogni ORF deve essere clonato individualmente nel vettore p415-ADH⁶ o in un vettore simile e ritrasformato nel lievito tossico per identificare quale sia il vero soppressore. È tipico identificare diversi soppressori che rappresentano un percorso biologico ospite. I soppressori a volte possono essere partner di legame diretto della proteina batterica di interesse, ma non sempre.

La generazione di cloni di lievito che trasportano la proteina batterica di interesse su pYesNTA-Kan è il primo passo importante e si dovrebbe fare molta attenzione a preservare l'integrità di questi cloni il più presto possibile perché c'è una forte selezione negativa per il trasporto di lieviti tossici proteine, anche senza induzione intenzionale galactose, e possono perdere il plasmide. Occasionalmente c'è perdita di plasmide anche quando il lievito è mantenuto sotto selezione sui supporti di abbandono. Un metodo è stato precedentemente segnalato per diminuire l'insorgenza di perdita di plasmide linearizzando il vettore e integrandolo all'interno del genoma del lievito¹.

Uno dei principali svantaggi di queste tecniche è che lo schermo del soppressore produce dati significativi solo se la sovraespressione della proteina degli effetti batterici innesca un difetto di crescita osservabile e coerente nel lievito. La difficoltà principale in questo metodo è quando non vengono identificati soppressori. È difficile determinare se la mancata identificazione dei soppressori sia dovuta a motivi biologici o problemi tecnici. Da un punto di vista biologico, ci potrebbero essere diverse cause: la proteina di interesse potrebbe essere così tossica che le proteine della libreria genomica non sono in grado di sopprimere significativamente la tossicità, la via mirata potrebbe essere incapace di essere salvata, o numerosi fattori possono essere necessari per superare l'effetto tossico. Avvicinarsi alla spiegazione biologica è impegnativo, in quanto ci sono molte variabili indefinite da sezionare. Poiché esiste un protocollo stabilito, l'esplorazione delle spiegazioni tecniche è un approccio molto più trattabile. Dal punto di vista tecnico, un'incapacità di identificare i soppressori è probabilmente il risultato di una bassa efficienza di trasformazione della libreria genomica del lievito. Questo protocollo utilizza la libreria genomica ATCC S. cerevisiae AB320 parzialmente digerita in pYEp13. Altre librerie possono essere sufficienti così come altri vettori, ma questo protocollo utilizza specificamente la libreria ATCC e non ci sono studi attualmente pubblicati che riportano librerie alternative o fonti vettoriali. Si raccomanda vivamente che la copertura del genoma del lievito debba essere almeno 10x, o la sottorappresentazione può ostacolare l'identificazione dei soppressori. La diminuzione dell'efficienza di trasformazione può portare questi numeri sotto 1x. Pertanto, parti del genoma del lievito potrebbero non essere rappresentate nello schermo del soppressore. Una bassa efficienza di trasformazione può essere dovuta a molti problemi, tra cui reagenti difettosi o scarsa preparazione della libreria. Questo metodo aderisce in gran parte al metodo di trasformazione DMSO/LiAc prima messo avanti da Hill et al.⁷. Si raccomanda di acquistare e preparare i nuovi spermatozoi DMSO, 50% PEG e spermatozoi di aringhe fresche per le trasformazioni e utilizzati esclusivamente per questi saggi per ridurre la contaminazione o la degradazione della qualità dei reagenti. DMSO è altamente igroscopico e assorbe facilmente l'acqua dall'atmosfera. Pertanto, si raccomanda di fare molti aliquot di uso individuale per evitare l'apertura ripetuta del coperchio di un contenitore e l'esposizione all'atmosfera. Il DNA dello sperma di aringhe di alta qualità può essere conservato a -20 gradi centigradi e rimane idoneo per l'uso per diversi anni, anche se una preparazione fresca dovrebbe essere preparata dal magazzino per ogni trasformazione. Una volta bollito e raffreddato, il DNA dello sperma di aringhe non deve essere ribollito o riutilizzato, quindi è meglio rimuovere solo ciò che è necessario ed evitare di fare più di quanto sia necessario per la trasformazione corrente. L'attenzione ai dettagli può migliorare notevolmente l'efficienza di trasformazione del lievito e migliorare le possibilità di identificare un soppressore.

Considerando che il vettore yeast pYep13 trasporta 3,13 ORF di lievito diverso, ridurre il numero di plasmidi falsi positivi è fondamentale per identificare i soppressori. Il lievito può occupare e ospitare più copie di vettori simili, mentre la saggezza generale associata all'incompatibilità del plasmide tradizionalmente impone che E. coli mantenga solo un tipo di plasmide con la stessa origine della replica (ORI) alla volta, anche se questo non è sempre il caso. Questo può diventare un problema importante quando si tenta di identificare i candidati soppressori. Se vengono identificati cloni di lievito soppressore, i plasmidi verranno estratti e ritrasformati in E. coli per la propagazione e il successivo sequenziamento per l'identificazione. Una volta che il candidato soppressore plasmide è stato isolato e ritrasformato in E. coli, si raccomanda vivamente che almeno cinque colonie di E. coli siano selezionate per il sequenziamento, perché è possibile che singoli cloni stiano trasportando diversi plasmidi. Poiché E. coli dovrebbe essere in grado di propagarsi solo un plasmide alla volta, se l'isolamento del lievito produce più plasmidi, diversi cloni di E. coli sulla piastra dovrebbero trasportare solo uno di essi alla volta. Pertanto, raccogliere cinque colonie basate sulla normale efficienza di trasformazione in E. coli dovrebbe mostrare se i cloni portano gli stessi plasmidi o diversi. Se più plasmidi sorgono successivamente al sequenziamento dei plasmidi da E. coli, ognuno dovrebbe essere trasformato nel clone di lievito tossico e valutato per il salvataggio del difetto di crescita. Inoltre, anche se viene identificato un solo plasmico soppressore, per il rigore e la riproduttoribilità del plasmide nel clone tossico è incoraggiata.

Il saggio del soppressore del lievito è un esperimento molto grande e il tempo e i materiali appropriati dovrebbero essere pianificati di conseguenza. Questo protocollo contiene molti dettagli che devono essere aderenti rigorosamente e si raccomanda che il ricercatore conducendo questi saggi attentamente leggere e guardare il protocollo per intero prima di iniziare un saggio. Si tratta di una procedura multipartita che include sia batteri che lieviti che devono essere coltivati a temperature diverse. L'isolamento dei plasmidi dal lievito a volte può essere difficile a causa della loro parete cellulare dura e l'uso di DMSO aiuta a raggiungere una maggiore efficienza di trasformazione.

Uno dei maggiori vantaggi della tossicità del lievito e dello schermo soppressore è che l'effettore batterico non ha bisogno di legarsi fisicamente ai substrati ospiti per qualsiasi quantità di tempo apprezzabile per rilevare il percorso putativo mirato. Solo una piccola manciata di studi hanno riferito utilizzando questo o una tecnica simile^1–5. Tuttavia, ci sono rapporti di tecniche che identificano i percorsi host e molte tecniche da vagliare per legare i partner delle proteine degli effetti batterici. Kramer et al. ha riportato un nuovo approccio di biologia dei sistemi per identificare le vie prese di mira dalle proteine degli eftori batterici⁸. La tecnica ha utilizzato una collezione di deformazione di delezione aploide di S. cerevisiae per lo screening per i mutanti sensibili all'effetto Shigella Osp4. Utilizzando questa tecnica, Osp4 era legato alla regolazione della segnalazione MAPK e all'attenuazione dell'immunità innata nelle cellule ospiti. Gli schermi ibridi automatizzati-due per lieviti automatizzati, basati su array, ad alto contenuto di velocità, ora possono identificare rapidamente i partner di legame degli effetti batterici putativi esaminando molti contemporaneamente contro milioni di proteine ospiti⁹. Allo stesso modo, le immunoprecipitazioni ad alto throughput, insieme alla spettrometria di massa, vengono utilizzate per identificare in massa partner di legame putativo di intere famiglie di proteine efricchestiche batteriche¹⁰. Mentre molti di questi studi possono accelerare il calendario della caratterizzazione delle proteine efseche, raramente forniscono informazioni su quali processi fisiologici vengono manipolati e quale sono il risultato olistico di queste interazioni. Pertanto, tecniche come la tossicità del lievito e lo schermo soppressore sono essenziali per illuminare i processi cellulari manipolati da queste proteine eftraive. Ad un certo punto, le osservazioni che identificano i partner leganti o le vie prese di mira dalle proteine degli effetti batterici devono tornare ai modelli di infezione cellulare per determinare se questi risultati in vitro sono veri in scenari fisiologicamente rilevanti. La manipolazione genetica di patogeni intracellulari obbligatori come la tracommata C è stata un ostacolo importante fino a poco tempo fa^11-15 e la generazione di mutanti site-specific per studiare le proteine degli efmarcatori non era possibile. Negli ultimi anni, però, si è verificata una rivoluzione nella generazione di mutanti clamidiali, nell'integrarli e nell'esprimere in esordio delle proteine bersaglio. Questi recenti progressi hanno notevolmente migliorato il valore delle informazioni derivate da studi che utilizzano schermi di tossicità e soppressori in quanto è ora possibile passare dal lievito direttamente all'infezione per sondare la validità dei risultati.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamo Shelby Andersen, Abby McCullough e Laurel Woods per la loro assistenza con queste tecniche. Questo studio è stato finanziato dai fondi delle startup del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università dell'Iowa a Mary M. Weber.