Method Article
Qui, presentiamo le metodologie per valutare l'integrità della membrana di spermatozoan, una cellulare caratteristica associata con competenza di fertilizzazione dello sperma. Descriviamo tre tecniche per la valutazione di fluorimetrico delle membrane degli spermatozoi: macchiatura simultanea con sonde fluorescenti specifiche, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso di sperma-dedicato avanzate. Inoltre vengono presentati esempi di combinazione delle metodologie.
Spermiograms standard che descrivono la qualità dello sperma sono principalmente basati sui parametri fisiologici e visual, come il volume di liquido seminale e concentrazione, motilità e motilità progressiva e morfologia degli spermatozoi e vitalità. Tuttavia, nessuna di queste valutazioni è abbastanza buona per predire la qualità dello sperma. Dato che il mantenimento della vitalità degli spermatozoi e fecondazione potenziale dipende dalla funzionalità intracellulare e l'integrità della membrana, la valutazione di questi parametri potrebbe consentire una migliore previsione di competenza di fertilizzazione dello sperma. Qui, descriviamo tre possibili metodi per valutare la qualità dello sperma usando sonde fluorescenti specifiche combinate con analisi di citometria a flusso o microscopia di fluorescenza. Analisi ha valutato l'integrità della membrana del plasma utilizzando 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e ioduro di propidio (PI), l'integrità della membrana acrosomiale utilizzando fluoresceina isotiocianato-coniugato dell'agglutinina Pisum sativum (FITC-PSA) e l'integrità della membrana mitocondriale usando 5, 5', 6, 6'-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl ioduro di carbocyanine (JC-1). Combinazioni di questi metodi inoltre sono presentati. Per esempio, uso di annessina V combinato con consente di fluorocromi PI apoptosi di valutare e calcolare la percentuale di spermatozoi apoptotici (indice apoptotico). Crediamo che queste metodologie, che si basano sull'esame di membrane di spermatozoo, sono molto utili per la valutazione della qualità dello sperma.
L'integrità e la funzionalità delle membrane degli spermatozoi sono alcuni dei fattori che indica la vitalità degli spermatozoi e potenziale di fecondazione. La membrana plasmatica agisce come una barriera tra compartimenti intracellulari ed extracellulari, mantenendo l' equilibrio osmotico cellulare1. Qualsiasi stress che induce il danno all'integrità della membrana plasmatica potrebbe alterare l'omeostasi, ridurre la capacità di fertilizzazione e redditività e aumentare la morte delle cellule. Per esempio, crioconservazione riduce la vitalità degli spermatozoi causa danni alla sua membrana plasmatica, a seguito di variazioni di temperatura e stress osmotico2. Precedentemente abbiamo segnalato che esponendo lo sperma di Toro a basse concentrazioni di contaminanti di origine alimentare come i pesticidi atrazina, suo principale metabolita diaminochlorotriazine o l'aflatossina B1, la micotossina riduce sperma attuabilità1,3 . Questo è stato determinato dall'etichettatura il DNA double-stranded con DAPI in combinazione con PI, che si lega al DNA delle cellule con una membrana plasmatica danneggiata.
Reazione acrosomiale (AR) comporta la fusione della membrana acrosomiale esterna e la membrana di plasma sovrastante conseguente rilascio di enzimi acrosomiali4,5. Questi sono eventi da non mancare per penetrazione della zona pellucida e ulteriormente l'Unione dello sperma con l' ovocita6. Pertanto, la valutazione dell'integrità della membrana acrosomiale costituisce un parametro utile per valutare la qualità dello sperma e la fertilità maschile7,8,9. Parecchie tecniche fluorescenti sono utilizzabili per la verifica di integrità acrosomiale, FITC-PNA o FITC-PSA8,10. Nei nostri studi precedenti, utilizzando i modelli di FITC-PSA colorazione1,3, abbiamo fornito le definizioni precise per (i) acrosomiale intatta, (ii) danneggiato della membrana acrosomiale e (iii) ha reagito acrosomiale. Nel rapporto corrente, valutiamo lo stato acrosomiale mediante citometria a flusso di sperma-dedicato e confrontare i risultati con quelli utilizzando la microscopia a fluorescenza.
I mitocondri sono organelli multifunzionali coinvolti in, tra le altre cose, ATP sintesi, produzione di specie reattive dell'ossigeno, segnalazione del calcio e apoptosi. Disfunzioni fisiologiche, tra cui l'infertilità maschile e femminile, sono associate con la funzione mitocondriale alterata11. I mitocondri dello sperma sono disposti nel midpiece e svolgono un ruolo cruciale in spermatozoi motilità12. È ben accettato che potenziale di membrana mitocondriale alta (ΔΨm) è associata con normale motilità e fertilizzazione alta capienza13. Al contrario, ΔΨm basso è associato con un livello elevato di specie reattive dell'ossigeno e ridotto tasso di fertilizzazione14. Tuttavia, vari composti ambientali, per esempio gli interferenti endocrini, possono indurre stress cellulare e portare a un aumento transitorio nel ΔΨm, hyperpolarization1,3, aumentata produzione di radicali liberi e, infine, apoptosi15. La sonda fluorescente 5, 5', 6, 6'-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl ioduro di carbocyanine (JC-1) consente, ad esempio, esaminare gli effetti delle tossine di origine alimentare sul sperma ΔΨm1,3.
Spermiograms standard, basato su parametri fisiologici e morfologici, non sono abbastanza buone predire la qualità dello sperma. Metodi più accurati sono tenuti a garantire la qualità dello sperma. Qui, forniamo fattibile due metodi per determinare la qualità dello sperma sulla base delle valutazioni delle membrane degli spermatozoi: colorazione quadrupla simultanea con sonde fluorescenti specifiche e microscopia a fluorescenza, descritto nei nostri studi1,3 e citometria a flusso di sperma-dedicato avanzate, recentemente utilizzato nel nostro laboratorio e già utilizzato da altri16,17,18.
Tutti gli esperimenti sono stati effettuati conformemente agli orientamenti israeliano 1994 per il benessere animale. Sperma di bovini è stato fornito da società commerciale israeliana per inseminazione artificiale e l'allevamento. Eiacula di 11 tori sono stati valutati in questo studio.
1. preparazione del campione di sperma
Nota: La procedura è basata sul protocollo1,3 di laboratorio Roth.
2. tecnica #1: Valutazione simultanea delle membrane degli spermatozoi utilizzando più fluorescente sonde
Nota: Membrane degli spermatozoi (plasma, acrosomale e mitocondriale) sono state valutate come precedentemente descritto da Celeghini et al.10, con alcune modifiche. Epifluorescente microscopia è stata usata, combinato con una videocamera digitale con eccitazione a 450-490 nm ed emissione a 515-565 nm utilizzando un triplo filtro.
3. tecnica #2: Valutazione delle membrane degli spermatozoi con kit pronti per l'uso e citometria a flusso
Nota: Valutazione dell'integrità della membrana plasmatica, l'integrità di membrana acrosomiale e potenziale di membrana mitocondriale è stato effettuato con kit di citometria a flusso di ready-to-use contenenti liofilizzati fluorocromi in ciascun pozzetto. La procedura è stata eseguita secondo i costruttori con alcune modifiche.
4. tecnica #3: Valutazione delle membrane degli spermatozoi, utilizzando sonde fluorescenti e citometria a flusso
Nota: Uso di annessina V combinato con consente di fluorocromi PI apoptosi di valutare e calcolare la percentuale di spermatozoi apoptotici (indice apoptotico).
Figura 1 spettacoli fluorimetrica simultanea valutazione delle membrane degli spermatozoi (plasma, acrosomale e mitocondriale) usando PI, DAPI, FITC-PSA e JC-1. Valutazione delle membrane dello sperma usando la macchiatura simultanea con quattro sonde fluorescenti permette, ad esempio, valutare la percentuale di spermatozoi in ogni categoria — live vs morti; alta vs bassa ΔΨm; intatto vs. danneggiato acrosomiale — contemporaneamente per ogni spermatozoo.
Figura 2 presenta risultati di sperma membrana valutazione usando le sonde fluorimetrico. Solo lo sperma che conteneva almeno 80% di spermatozoi mobili sono stati usati nell'esperimento. Almeno 200 cellule sono state esaminate al toro. È stato possibile valutare le differenze nella qualità di campione dello sperma in termini di integrità della membrana. Ad esempio, il liquido seminale del Toro n. 7 aveva una percentuale relativamente bassa di cellule morte, una bassa percentuale di spermatozoi con pseudo reagito acrosomiale e più alta potenziale, rispetto al liquido seminale di bull n. 1 di membrana mitocondriale.
La figura 3 Mostra campioni rappresentativi valutati per redditività (Figura 3A–3C) e l'attività mitocondriale (Figura 3D–3F). Intensità di fluorescenza dei campioni sono stati valutati da un citometro a flusso sperma microcapillary dedicato, con software dedicato. Questo citometro a flusso contiene un laser blu di fase solida (448 nm) e due fotodiodi: forward scatter e dispersione laterale. Esso misura in particolare proprietà di emissione di sperma con tre tubi di fotomoltiplicatore (verde: 525/30 nm, giallo: 583/26 nm; rosso: 655/50 nm) ed accoglie ottiche filtri e splitter16. Permette la valutazione di 5.000 spermatozoi per analisi.
Il kit di valutazione di attuabilità contiene una sonda con permeabilità differenziale praticabile (membrana plasmatica intatta) e sugli spermatozoi morti (membrana plasmatica danneggiata) (Figura 3). ΔΨm di sperma è stata valutata utilizzando un kit che consente di distinguere tra polarizzati membrana mitocondriale (fluorescenza che appare in arancione) e depolarizzate membrana mitocondriale (fluorescenza che appaiono in verde) (Figura 3F).
Figura 4 presenta una valutazione dell'integrità acrosomiale eseguita con il kit di ready-to-use, leggere con la citometria di flusso (figure 4A–4C), dividendo l'istogramma risultante degli spermatozoi con cancello in tre aree del marcatore, che rappresenta le cellule che reagiscono basso trascurabile con acrosoma intatto, senza macchia (R1), che reagiscono bassa delle cellule con residuo macchiato parte del acrosomiale (R2) e altamente che reagiscono cellule con acrosoma perturbato (R3).
La tabella 1 presenta un confronto tra le due tecniche fluorimetriche per valutazione delle membrane degli spermatozoi. Gli stessi campioni di sperma da tre diversi tori sono stati valutati per vitalità, potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) e l'integrità di acrosomiale utilizzando simultanea colorazione quadruple nonché citometria a flusso. Questo confronto è molto importante, come dimostra i risultati corrispondenti utilizzando ciascuna delle due tecniche. I dati sono stati analizzati da un'analisi e test t di Student. Sono state osservate differenze statisticamente significative.
La figura 5 Mostra un campione rappresentativo valutato per apoptosi utilizzando Annessina V (AV) e fluorocromi di propidio ioduro (PI). Uso di questi due sonde consente di distinguere tra quattro modelli che indica cellule vitali (AV-, PI-), in cellule apoptotiche precoci (AV +, PI-), cellule apoptotiche (AV +, PI +) e cellule necrotiche (AV-, PI +).
Figura 1: la fotomicrografia epifluorescenza degli spermatozoi macchiato simultaneamente con diverse sonde fluorescenti. (A) simultanee macchiatura con quattro sonde in PI, DAPI, FITC-PSA e JC-1) (B) spermatozoo Live con DAPI la colorazione del nucleo e potenziale di membrana mitocondriale alta (ΔΨm), macchiato con JC-1 sonda. (C) morto spermatozoo con membrana plasmatica danneggiata macchiato con sonda PI, danneggiato acrosomiale macchiato con sonda di FITC-PSA e ΔΨm basso. (D) Live, ha reagito acrosoma spermatozoo con residuo di macchiatura equatoriale e bassa ΔΨm. (E) Live, ha reagito acrosoma spermatozoo con colorazione superiore residua e alta ΔΨm. Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: valutazione delle membrane di sperma di Toro usando le sonde fluorimetrica. (A) sperma attuabilità è stata determinata con sonde fluorescenti 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e ioduro di propidio (PI). Acrosoma (B) lo stato è stato determinato secondo modelli di macchiatura FITC-PSA. La percentuale di spermatozoi con reazione acrosomiale sono presentati. (C) potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) è stata valutata usando con sonda fluorescente JC-1 e presentato come il rapporto tra la percentuale media dei rosso-macchiato (alto potenziale) e macchiato di verde dello sperma (basso potenziale). I dati sono presentati come percentuale delle cellule fuori cellule totali valutate. Almeno 200 spermatozoi sono stati analizzati al toro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: redditività (A-C) e valutazione di fluorescenza di attività mitocondriale (D-F) di campioni rappresentativi misurata dal cytometer di flusso EasyCyte. Gli istogrammi rappresentano gli spermatozoi ungated e spermatozoi di detriti (A, D), all'ingresso (B, E), distribuzione degli spermatozoi vitali (verde) e cellule morte (rosso) (C) e distribuzione degli spermatozoi a polarizzata (giallo) e depolarizzate ( membrana mitocondriale verde) (F). Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: valutazione di fluorescenza dell'integrità acrosomiale di campioni rappresentativi misurata dal cytometer di flusso EasyCyte. (A) istogramma di spermatozoi ungated e detriti. (B, C) Istogrammi di spermatozoi gated con valutazione di integrità acrosomiale eseguita con kit di ready-to-use, leggere con impostazione adattata 'InCyte', dividendo l'istogramma risultante di gated spermatozoi in tre aree del marcatore, che rappresenta trascurabile, cellule che reagiscono basso con acrosoma intatto, senza macchia (R1), cellule che reagiscono basso con residuo macchiato parte del acrosomiale (R2) e cellule altamente fluorescenti con interrotto acrosomiale (R3). Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
N ° medio di cellule | Vialbility | Potenziale di membrana mitocondriale | Acrosomiale integrità | ||||||
Vitali | Morti | Depolarizzato | Polarizzato | Rapporto di rosso/verde | Acrosoma intatto | Reazione acrosomiale | Acrosomiale interrotte | ||
Macchiatura Quadrupla | 253 | 32,7 ± 1,53% | 67,3 ± 1,53% | 65,7 ± 2,25% | 34,3 ± 2,52% | 0,5 ± 0,06 | 37,3 ± 7,2% | 38,0 ± 5,7% | 24,3 ± 3,0% |
Flusso Cytomtery | 5.000 | 32,3 ± 2,08% | 67,7 ± 2,08% | 65,0 ± 1,00% | 35.0 ± 1,00% | 0,5 ± 0.02 | 39,5 ± 5,7% | 39,5 ± 6,5% | 21,0 ± 8.0% |
Tabella 1: confronto tra le due tecniche fluorimetriche per valutazione delle membrane degli spermatozoi. Gli stessi campioni di sperma sono stati valutati per la vitalità economica, potenziale di membrana mitocondriale e l'integrità acrosomiale utilizzando macchiatura quadrupla simultanea e citometria a flusso. I dati sono presentati come media ± DS di proporzione delle cellule esaminate, calcolata per 3 repliche.
Figura 5: Annessina V e PI di un campione rappresentativo di fluorescenza misurata da un citofluorimetro. Ungated rappresentano gli istogrammi (A) gli spermatozoi e detriti e (B) distribuzione degli spermatozoi con cancello per primo apoptotica (AV +, PI-), apoptotico (AV +, PI +), vitali (AV-, PI-) e necrotiche (AV-, PI +) cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Potenziale di fertilizzazione dello sperma dipende da molteplici fattori che riflettono la sua qualità. Un'alta concentrazione di spermatozoi e un'alta percentuale di spermatozoi mobili altamente progressivamente potrebbe essere considerati la qualità dello sperma. Tuttavia, tale valutazione non prendere in considerazione altri parametri cellulari e funzionali. L'uso di 'Banco' microcapillary citometro a flusso può essere facilmente adattato alla valutazione delle varie strutture di sperma usando sonde fluorescenti, come precedentemente indicato da altri17 e dimostrato nel presente documento (tecnica n. 3). Ad esempio, sperma acrosomiale integrità è molto importante per l'avvenimento di fecondazione naturale e pertanto, precisa valutazione dello status acrosomale è autorizzata. Tale valutazione può essere eseguita facilmente da classificazione dello stato acrosomiale utilizzando i modelli di colorazione (FITC-PSA, FITC-PNA, vale a dire, tecnica n. 1, come descritto in precedenza) fluorescente1,3. In particolare, è molto importante determinare la percentuale di spermatozoi con acrosoma intatto (cioè, esibisce un innocente acrosomiale) riguardante quelli con acrosoma danneggiato. Con rispetto per lo sperma di quest'ultimo, con acrosoma danneggiato può esibire cap acrosomiali (i) un completamente macchiato, che indica che la membrana sia danneggiata, consentendo la tintura a fluire attraverso la membrana della vescicola acrosomiale; (ii) ha reagito acrosomiale spermatozoi che presentano solo acrosomiale residuo contenuto, che indica che l'AR è già verificato (cioè, pseudo AR). Si deve osservare che tale valutazione può essere eseguita anche con il citofluorimetro dedicato.
Il kit di integrità ready-to-use vitalità & acrosomiale definisce sia la sopravvivenza degli spermatozoi (praticabile o morti) e l'integrità acrosomale (intatto o perturbato). Qui, si consiglia di utilizzare il citometro a flusso dedicato per definire i tre stati di acrosomiali sopraccennati (cioè, intatto, danneggiato, ha reagito). Abbiamo adattato la piattaforma cytometer di flusso microcapillary per la valutazione più accurata, che identifica lo sperma ha reagito acrosomiale (cioè, bassa fluorescenza) mentre loro esclusione da quelli con acrosoma perturbato (alta fluorescenza), piuttosto che la loro inclusione con quelli che hanno un acrosomiale intatta. Questo dà una precisa proporzione di sperma con acrosoma funzionale o non funzionali. Sperma con reazione acrosomiale, nonché a membrana acrosomiale interrotta hanno perso la loro capacità fecondante. Inoltre, un'analisi accurata potrebbe far luce sul meccanismo sottostante alterazione acrosomiale, vale a dire, danneggiato la membrana acrosomiale vs attivazione acrosomiale pseudo.
Abbiamo confrontato i risultati ottenuti con tecnica 1 e tecnica n. 2 e trovato grande compatibilità tra di loro, in particolare nella valutazione della vitalità e ΔΨm (tabella 1). Uno dei vantaggi principali di usando il citofluorimetro dedicato è il gran numero di spermatozoi valutati rispetto al piccolo numero di spermatozoi che vengono valutati in pratica da microscopia di fluorescenza e sonde (migliaia vs centinaia, rispettivamente ). Inoltre, la procedura di quest'ultima è che richiede tempo e soggettivo, anche quando eseguita da un osservatore esperto. Come flusso cytometry rileva solo la fluorescenza delle particelle-collegato, non c'è nessuna necessità di lavare la sonda non associata dalla soluzione, che è una perdita di tempo17. D'altra parte, la valutazione di fluorimetrico delle membrane degli spermatozoi descritto nella tecnica #1 consente valutazione simultanea di più membrane. Siamo stati in grado di utilizzare fino a quattro sonde fluorescenti insieme1,3.
Infine, si noti che il citometro a flusso dedicato è stato sviluppato come un modulo di analisi aperto, fornendo tutti gli strumenti di base per esempio acquisizione e analisi dei dati. La funzione di acquisizione consente la raccolta di vari tipi di informazioni da un campione di cellule e quindi permette un adattamento per una valutazione più accurata, come mostrato qui per indice di status e apoptotici acrosomiale.
In conclusione, le metodologie descritte in questo documento sono molto utili per la valutazione della qualità dello sperma. Esaminando le membrane dello spermatozoo è estremamente importante per determinare la competenza di fertilizzazione dello sperma.
Gli autori dichiarano che non esistono senza conflitti di interesse.
Gli autori vorrei ringraziare la società israeliana "SION" per inseminazione artificiale e l'allevamento (Hafetz Haim, Israele) per il loro aiuto e la cooperazione e la sig. ra Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Francia) per assistenza con la messa in funzione e la formazione.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
PBS | Sigma | P5493 | |
DMSO | Sigma | D2438 | |
Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
Annexin V binding buffer 20x stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
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