Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

Questo articolo presenta una metodologia completa per preparare e conservare In vitro Acuta fettine di ippocampo di topi adulti. Questo protocollo permette la registrazione di potenziamento a lungo termine di lunga durata molto stabile (LTP) per più di 8 ore con un tasso di successo del 95%.

Potenziamento a lungo termine (LTP) è un tipo di plasticità sinaptica caratterizzata da un aumento della forza sinaptica e crede di essere coinvolti nella codifica della memoria. LTP suscitato nella regione CA1 di fettine di ippocampo acute è stata ampiamente studiata. Tuttavia i meccanismi molecolari alla base della fase di questo fenomeno manutenzione sono ancora poco conosciuti. Questo potrebbe essere dovuto in parte alle diverse condizioni sperimentali utilizzate da diversi laboratori. Infatti, la fase di mantenimento LTP è fortemente dipendente da parametri esterni come ossigenazione, temperatura e umidità. Esso dipende inoltre parametri interni come orientamento del piano di tranciatura e vitalità fetta dopo dissezione.

L'ottimizzazione di tutti questi parametri permette l'induzione di un potenziamento molto riproducibile e molto stabile a lungo termine. Questa metodologia offre la possibilità di esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari coinvolti nella crescita stabilein forza sinaptica in fettine di ippocampo. Si evidenzia anche l'importanza delle condizioni sperimentali in vitro in indagini di fenomeni neurofisiologici.

Al giorno d'oggi, non vi è limitata comprensione di come le memorie complesse vengono memorizzate e richiamate a livello di circuito neuronale. Tuttavia, un'ipotesi unificante di memoria è disponibile e ampiamente riconosciuti: memorie sono memorizzati come cambiamenti nella forza delle connessioni sinaptiche tra i neuroni nel sistema nervoso centrale. Di per sé, la ricerca sulla plasticità sinaptica ha largamente beneficiato di due scoperte svolta. (1) In un esperimento seminale, Bliss e Lomo ^1, utilizzando il coniglio anestetizzato intatta, trovato che la consegna di una breve alta frequenza (1 sec, 100 Hz) impulso alla via perforante dell'ippocampo causato una lunga durata (vari ore) aumento delle relative connessioni sinaptiche. Questo fenomeno affascinante è stato chiamato "potenziamento a lungo termine" o LTP da Douglas e Goddard nel 1975 ^2. (2) Successivamente, è stato trovato che un fenomeno simile potrebbe essere innescato in fettine cerebrali (0,4 mm) mantenuta artificialmente in vita in vitro . La LTP più studiato è stato osservato in vitro, fornendo uno o più tetani ad un fascio di assoni (cosiddetti collaterali Schaffer) durante la registrazione del campo risultante sinaptica eccitatoria potenziale evocato nei neuroni piramidali della cosiddetta regione CA1. I meccanismi di induzione di LTP sono stati ampiamente rivelato. Fondamentalmente, un afflusso di Ca ^{2 +} attraverso i recettori NMDA attiva enzimi con due conseguenze: una fosforilazione di recettori AMPA (che aumenta la loro efficienza) e una incorporazione di recettori AMPA extra nella membrana postsinaptica ^3. Per contro, i meccanismi della fase di mantenimento LTP sono largamente sconosciuti, soprattutto perché é sperimentalmente molto più difficile mantenere una fetta sano per molte ore che per 30 a 60 min.

Molti studi sono stati dedicati alla comprensione dei meccanismi di LTP e teorie interessanti sono state elaborate nel corso degli anni, ^4-11. Ma ONUfino ad ora, i meccanismi molecolari precisi alla base della crescita stabile in forza sinaptica non sono stati chiariti. Questo potrebbe essere dovuto alla difficoltà di riprodurre i risultati precedenti in laboratori diversi utilizzando tecniche diverse per la preparazione e la manutenzione di fettine ippocampali. Nel loro documento metodologia, Sajikumar et al. ¹² ha sottolineato l'importanza delle condizioni sperimentali per la preparazione di fettine di ippocampo di ratto e la registrazione delle LTP stabile. In questo video vi presentiamo tutte le fasi di ottimizzazione sviluppati nel nostro laboratorio nel corso degli anni di essere in grado di registrare un LTP molto stabile nel topo fettine di ippocampo.

Questa ottimizzazione è stata fatta dai protocolli sviluppati e utilizzati con successo da altri laboratori che studiano i meccanismi di LTP in topi e ratti ^{13 11.} Esso consente a ricercatori esperti di indurre e registrare un tempo molto lungo LTP duratura in topi adulti con un alto tasso di successo. Il pbase hysiological della indotto LTP è stato attentamente verificato e dimostrato ^14. In questo lavoro la metodologia, si dimostra che le modifiche delle condizioni sperimentali, come la temperatura o l'ossigenazione possono avere un profondo impatto sulla manutenzione LTP, mentre la procedura di dissezione può modificare profondamente le fette eccitabilità. Si deve inoltre sottolineare che il controllo preciso di tutti questi parametri richiede una formazione di diversi mesi per gli studenti alle prime armi.

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of norme sanitarie per la cura e l'uso di animali nella ricerca e con l'accordo del comitato etico locale.

1. Preparazione del Artificial liquido cerebro-spinale

Lo stesso supporto utilizzato per sezionare, tagliare e perfusione fette (1 ml / min) durante il periodo di riposo e le registrazioni elettrofisiologiche. Questo supporto è composto da 124 mM NaCl, 4.4 mM KCl, 26 mM _NaHCO3, 1 mM NaH ₂ PO _4, 2,5 mM CaCl _2, 1,3 mm MgSO ₄ e 10 mm D-glucosio.

1. Pesare i diversi componenti per 2 L di ACSF tranne _MgSO4 che è già in soluzione (1 M). Usando una soluzione standard permette di essere sicuri della esatta concentrazione di Mg ^{2 +} perché _MgSO4 in polvere è altamente igroscopico. Ca ^{2 +: Mg2 +} rapporto influenza notevolmente l'induzione e il mantenimento LTP¹⁴ e, quindi, le loro proporzioni vanno sempre rispettati.
2. Mettere tutti i componenti ad eccezione CaCl ₂ in un bicchiere cilindro graduato e portare a 2 L con acqua distillata H ₂ O.
3. Mescolare energicamente. Quando tutto è sciolto, aggiungere CARBOGEN attraverso un gorgogliatore acquario e il tubo attaccato al serbatoio (95% O _2, 5% di CO _2). Attendere qualche minuto e aggiungere cloruro di calcio quando il pH è fissato a 7,4 con l'azione del tampone bicarbonato.
4. Tenere 600 ml in un piatto di vetro rettangolare refrigerato e raffreddare a 4 ° C con ghiaccio intorno al piatto. Questo supporto saranno utilizzati per la dissezione dell'ippocampo.
5. Filtra i restanti 1.400 ml e conservare in una beuta.

2. Preparazione del Rig elettrofisiologici e cervello Slice Recording Camera

Il circuito di perfusione è fatto di due pompe peristaltiche, uno di pompaggio del liquido fresco da un serbatoio di riserva e l'altro fluido utilizzato pompaggio da tsi registra da camera per un bidone. Fluido fresco viene aggiunto ad un sistema di perfusione casereccio dove viene ri-ossigenato e riscaldato prima di raggiungere la camera di registrazione di interfaccia per gravità (Figura 1A). La camera di registrazione di interfaccia è stato progettato da FST (Belle Strumenti Scienza, Vancouver, Canada, figura 1b). Fette di tessuto sono posti su filtro di rete tessuta applicato all'anello ben rimovibile e può essere costantemente mantenuta in condizioni di interfaccia regolando l'altezza di aspirazione ben dell'ago. Un tubo di plastica fatta in casa bloccata alla sua estremità e forati lateralmente (0,5 mm) è fissato l'ago di aspirazione per aumentare la stabilità livello nella camera. La testina di registrazione è montata su un bagno d'acqua contenente una pietra dispersione gas che aiuta a mantenere un ambiente umido facendo passare aria umida attraverso i porti deflessione della testa di registrazione (per diminuire la formazione di goccioline d'acqua). Bagno e media temperatura sono controllati dal continuo variando il livello di secolo corrente continuaruvida una gomma siliconica-embedded elemento riscaldatore nel bagno d'acqua. Termistori nel bagno d'acqua e pozzi di registrazione consentono la temperatura della camera per impostare e monitorare con precisione in questi siti.

Il sistema di riscaldamento della camera è completata da un sistema di riscaldamento globale controllando la temperatura dell'intero impianto. Il software sviluppato dai ricercatori dell'Università di Edimburgo ( www.etcsystem.com ) monitora e equalizza la temperatura dell'aria ossigenata, la fetta cervello, gli elettrodi e l'impianto di perforazione restante fornire un ambiente stabile per registrazioni a lungo termine (Figura 1C) . La temperatura usato per topo fettine ippocampali è di 28 ° C.

1. Risciacquare tutto il circuito di perfusione con H ₂ O distillata per almeno 20 min e avviare i sistemi di riscaldamento.
2. Avviare il gorgogliare CARBOGEN nel circuito. Carbogen arriva nei fatti in casa-tubi perfusione attraverso fcandele ilter e nel bagno d'acqua al di sotto della camera di registrazione. La portata nel bagno d'acqua è controllata da un flussometro. Se la portata è troppo lento, il tessuto potrebbe diventare ipossico. Viceversa, se la portata è troppo alta, il gas potrebbe non essere sufficientemente riscaldata e idratata conseguente essiccamento del tessuto. Elevata portata di gas potrebbe aumentare la probabilità di spruzzi d'acqua sul tessuto dal bagno d'acqua sottostante che porta a shock osmotico. Ciò può essere evitato aggiungendo pezzetti di maglia di nylon (100 pm) all'uscita dei porti deflessione.
3. Svuotare il circuito e riempire con ACSF filtrata.
4. Mettere l'anello che sosterrà la fetta nella camera di tenuta. Un filtro a rete tessuto con aperture di maglia che vanno 500-750 micron è allungata e collegata all'anello con colla epossidica resina a due componenti. Il filtro a rete tessuto è fatto di 87% poliammide e 13% elastan (collant 15 den). Colla deve essere applicata con attenzione per evitare la formazione di rilievi sulla superficie del ring.
5. Rimuovere con attenzione tutte le bolle d'aria dal circuito.
6. Regolare il livello di ACSF nella camera di registrazione con la vite dell'ago di aspirazione. La velocità delle pompe peristaltiche viene regolata a 1 ml / min per la pompa di aspirazione e di 5 ml / min per la pompa di scarico.

Il sistema di perfusione è posto su un tavolo resistente alle vibrazioni rigido e circondato da una gabbia di Faraday.

3. Preparazione della Zona Dissection

Strumenti chirurgici: un bisturi con lama # 11, piccole forbici standard di dissezione, forbici a molla, pinze curve, due Heidemann spatole e un cucchiaio.

Materiale supplementare: una ghigliottina, un underpad, un chopper tessuto McIlwain con una lama di rasoio, carta da filtro, una pipetta Pasteur di vetro con una tettarella di gomma, plastica 2 pipette Pasteur di cui uno con una bocca larga, una capsula di Petri, un cilindro metallico di 7 mm di diametro (Figura 2A).

1. Nel piatto dissezione pieno di freddo ACSF (preparata nella fase 1), immergere un coperchio in vetro refrigerata da un piatto di colorazione, avvolto in carta da filtro. Rimuovere con attenzione le bolle d'aria e ossigenare il ACSF attraverso un acquario gorgogliatore (Figura 2A).
2. Disporre di strumenti in ordine di utilizzo. Aggiungere tre strati di carta filtro sulla piastra chopper tessuto e una nuova lama di rasoio pulito con acqua distillata ed etere (Figura 2B). La lama deve essere orizzontale quando tocca la carta. Forza della lama viene regolata a metà del valore massimo e la velocità a circa un terzo del valore massimo.
3. Verificare attentamente se tutto è pronto (strumenti, temperatura ...), perché non avrete tempo dopo.
4. Chiedere a qualcuno di spruzzare la dissezione con una pipetta Pasteur pieno di ACSF freddo.
5. Anestetizzare il mouse con IP Nembutal (100 mg / kg) prima di decapitazione. Alotano può anche essere usato. Abbiamo confrontato entrambi i metodi e obtained stessi risultati. Decapitazione deve essere eseguita in anestesia dislocazione cervicale ma può anche essere usato. Tuttavia dislocazione cervicale necessita di una pratica molto buona per evitare la sofferenza degli animali.
6. Sezionare il underpad il più rapidamente possibile sotto doccia fredda continua ACSF.

4. Rimozione Cervello

1. Mentre si tiene ancora la testa con il dito indice e il pollice di una mano sul muso, fare un'incisione con le forbici dissezione lungo la metà della parte superiore della testa a partire dal bordo del taglio ghigliottina e funzionante rostralmente all'osso frontale .
2. Tagliare attraverso il muscolo cutaneo su ciascun lato della testa per esporre completamente le piastre cranio e rimuovere i muscoli a lato caudale della testa.
3. Con le forbici dissezione, tagliare il muscolo temporale su ogni lato, lungo la piastra temporale, quindi tagliare le piastre frontali in mezzo, trasversalmente. Poi, fare un piccolo taglio sull'osso occipitale, tra i due plAtes.
4. Per ogni lato, tagliato alla base caudale delle piastre occipitali.
5. Tagliare lungo la sutura sagittale con le forbici a molla.
6. Con una pinza, togliere le due metà del cranio, diffondendo loro distanti.
7. Con il bisturi, tagliare trasversalmente appena dopo il bulbo olfattivo e poco prima del cervelletto poi precipitare il cervello estratto nel piatto dissezione con freddo ACSF.

5. Dissezione ippocampale

1. Una volta che il cervello è immerso nel piatto dissezione, recidere i due emisferi uno dall'altro con un bisturi inserito nella metà.
2. La dissezione di ippocampo viene eseguita con spatole sotto controllo visivo attraverso un microscopio binoculare chirurgico (X25, Figura 2A). Su un emisfero, accuratamente diffondere le strutture di vedere il ventricolo laterale. Rimuovere il tronco cerebrale e diencefalo. Questo viene fatto applicando il spatole sulla corteccia frontale su un lato e sul diencefalo suldall'altro lato. Fare attenzione a non toccare l'ippocampo con spatole e per non allungare durante il sezionamento dei tessuti.
3. Sever del fornice quindi spingere delicatamente l'ippocampo fuori della corteccia (rotolare via), con l'inserimento di una spatola nel ventricolo.
4. Quando l'ippocampo viene estratta, rimuovere il tessuto in eccesso e corteccia rimanenti vasi sanguigni.

6. Tagliare delle fette

1. Con una bocca di plastica pipetta Pasteur, trasferire l'ippocampo in un cucchiaio, con le sue Alvear verso l'alto di superficie (lato convesso).
2. Rimuovere il liquido in eccesso con uno standard di plastica pipetta Pasteur.
3. Suggerimento il cucchiaio verticalmente quasi a toccare la carta da filtro del chopper (Figura 2B) e scendere l'ippocampo dal cucchiaio, dal rapido toccando la carta da filtro quindi spostare indietro il cucchiaio.
4. Orientare l'ippocampo e tagliatelo a fette trasversalmente a 400 micron con l'elicottero (vedi Figura 2C per l'orientamento dell'ippocampopus relativi alla lama di rasoio). Agire il più rapidamente possibile.
5. Rimuovere la carta da filtro con l'ippocampo a fette e avvolgerla intorno al cilindro metallico per diffondere le fette un po '. Poi, libera le fette con spruzzi di ACSF utilizzando una plastica standard di pipetta Pasteur e raccoglierli in una capsula di Petri riempita con ACSF freddo.

7. L'incubazione delle fette di interfaccia

1. Selezionare fette con uno standard di plastica pipetta Pasteur e rapidamente metterli nella camera di registrazione. Fette riprendersi dal trauma dissezione direttamente nella camera di registrazione, in un'interfaccia a 28 ° C.
2. La fetta molto probabilmente lavandino. Abbassare il livello del liquido di raggiungere il livello di sezione, e poi sollevarlo per farlo galleggiare.
3. Ruotare la fetta nella posizione corretta mentre abbassando il livello. Fette sono sempre orientati nello stesso modo per facilitare il posizionamento di elettrodi (2 stimolante e uno elettrodi di registrazione) nella regione CA1.
4. Fermarsi quandoil fluido è in interfaccia. A "menisco" dei media intorno alla fetta è indicativo di un livello sufficiente di supporti. Il filtro di rete deve essere saturo di media, ma non completamente sommerso.
5. Tenere la camera coperta con carta da filtro posto sopra il coperchio forato.
6. Lasciare riposare la fetta per almeno 1,5 ore a 28 ° C.

8. Registrazione delle risposte sinaptiche

1. Registrazione di elettrodo: vetro capillari sono tirati da ottenere una resistenza punta di 2-5 MW quando è riempita di ACSF. Un piccolo pezzo di carta da filtro è disposto intorno alla punta dell'elettrodo e cera ossea è applicato all'estremità da ridurre la condensazione. Elettrodi stimolanti: platino-iridio elettrodi bipolari a grappolo con un diametro di 12,5 micron sono acquistati da FHC (USA). Con una cura, ciascun elettrodo può essere usato almeno 30 volte (Figura 1B).
2. Posizionare gli elettrodi nella radiatum strato della regione CA1, tutti gli elettrodi rivestitiup (Figura 3A). Elettrodi vengono abbassati 75 a 150 micron sotto la superficie della fetta con Narishige micromanipolatori. I due elettrodi di stimolazione sono posti a stimolare due fasci distinti di Schaffer collaterali. Quando gli elettrodi vengono abbassati sulla fetta, carte da filtro sono accuratamente messi tutti intorno a chiudere la camera.
3. Stimolazione bifasica (0,08 msec durata dell'impulso per mezza onda) viene eseguita a tensione costante con uno stimolatore Grass collegato a unità di isolamento SIU-V. Massima risposta è controllato aumentando l'intensità dello stimolo da 2 V a 12 V. massimo EPSPs di campo sono amplificati 1.000 volte con un amplificatore WPI ISO-80 e filtrati a 10 Hz e 10 kHz. Il segnale viene poi inviato ad un PC tramite uno strumento nazionale di un convertitore A / D. Stimolazione, l'acquisizione e l'analisi dei dati vengono eseguite utilizzando il programma WinLTP ( www.winltp.com ). EPSPs di campo sono registrate al 40% dell'ampiezza massima ottenuta in un ingresso-outmettere curva. Per ogni sezione, le piste fEPSP sono normalizzati contro la pendenza media del 30 min precede LTP induzione.
4. LTP è innescato applicando un singolo treno di stimolazione (100 Hz) alla concentrazione di prova su una via mentre il secondo percorso serve da controllo.

9. Pulizia del Setup

1. Sciacquare tutto il circuito con una soluzione al 3% di acqua ossigenata (H ₂ O ₂₎ per almeno 10 minuti, poi scolare. Il circuito sarà accuratamente risciacquati con acqua distillata prima di iniziare qualsiasi esperimento. L'uso di H ₂ O ₂ non è assolutamente necessaria come altri laboratori utilizzano solo acqua distillata per pulizia ma abbiamo notato la deposizione di residui scuri nel sistema di tubazioni utilizzando solo acqua.
2. Sostituire l'acqua nel bagno d'acqua sotto la camera di registrazione.
3. Bath gli elettrodi stimolanti suggerimenti in alcool per 5 min.

Questa metodologia è stata utilizzata per analizzare le proprietà di potenziamento a lunga durata a lungo termine indotta in fettine ippocampali acute da adulti topi C57BL/6J (JANVIER SAS, Francia) ^14. Sorprendentemente, il miglioramento delle condizioni sperimentali ha portato ad un nuovo modo di guardare alla LTP. Abbiamo dimostrato che la crescita di lunga durata in forza sinaptica non ha richiesto la sintesi di nuove proteine.

Qui, dimostriamo che l'induzione LTP dipende fette vitalità e l'eccitabilità. Quando dissezione dell'ippocampo era troppo lento o troppo dannoso, fette eccitabilità aumentata e risposte polisinaptici potrebbe essere osservata dopo LTP induzione (Figura 3B). In questo caso, l'induzione LTP era molto meno efficace e potenziamento non è stata mantenuta.

Vorremmo sottolineare il fatto che, anche in fette, condizioni tecniche apparentemente sani hanno una grande influenza sulla durata della LTP indotta da una singolatreno di stimolazione. In precedenti pubblicazioni, il nostro gruppo ha dimostrato che un LTP breve durata può essere trasformata in una duratura modificando le condizioni di recupero della fetta ^15. In anni di pratica quotidiana, abbiamo osservato che successivi miglioramenti nostra tecnica hanno portato ad un progressivo aumento della durata della LTP indotta da un unico treno in condizioni standard. Infatti, le registrazioni effettuate nel 2005 hanno mostrato un LTP di breve durata che risale ai valori basali entro 3 ore (Figura 3C, cerchi pieni). Modificazioni nella procedura di dissezione riducendo il tessuto stiramento hanno permesso di ottenere un LTP sostenuta per 6 hr ¹⁶ (Figura 3C, quadrati pieni). E, infine, il miglioramento della ossigenazione interfaccia ed il controllo della temperatura, combinato con elettrodo standardizzazione hanno portato ad un LTP stabile per più di 8 ore (Figura 3C, cerchi aperti). La differenza tra i tre gruppi è significativa (uno-way ANOVA, F (2,20) = 49,5, P <0.001).

Inoltre, qualsiasi modifica di temperatura o ossigenazione indotto un aumento o una diminuzione della risposta sinaptica (Figura 4). Il controllo di questi parametri è stata verificata utilizzando sempre due elettrodi stimolanti. LTP è stata indotta in un fascio di Schaffer collaterali mentre un altro fascio è stato utilizzato come controllo interno di stabilità forza sinaptica.

Figura 1. Rig elettrofisiologici e di camera di registrazione fetta cervello. (A) circuito di perfusione con fatta in casa sistema di perfusione gravità alimentata da una pompa peristaltica, unità di stimolazione isolate (due per ogni elettrodo), microscopio operatorio e la camera di registrazione. (B) camera di registrazione di interfaccia con stimolanti eelettrodi di registrazione. Filtra i documenti sono stati rimossi dal coperchio per vedere l'anello di sostegno della fetta. (C) Unità di controllo con due stimolatori, oscilloscopio, convertitore A / D, il software di controllo della temperatura e il software WinLTP.

Figura 2. Strumenti e materiali utilizzati per la ippocampo affettare. (A) piatto dissezione contenente ACSF refrigerato e microscopio chirurgico. Scalpel montato con una lama # 11, piccole forbici standard di dissezione, forbici a molla, pinze curve, due Heidemann spatole, cucchiaio, 2 pipette Pasteur di plastica di cui una con una bocca larga, piastra di Petri, cilindro metallico di 7 mm di diametro e anello che supporta la fetta nella camera di registrazione. (B) McIlwain chopper tessuto. (C) Disegno e fotografia of dell'ippocampo sinistra in posizione per il taglio. L'orientamento della lama di rasoio è indicato dalla linea tratteggiata rossa. Scala del reticolo:. 1 millimetro Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Induzione di LTP in fettine di ippocampo. (A) Sketch che mostra i due ingressi sinaptici indipendenti S1 e S2 per la stessa popolazione neuronale. In ogni fetta, due elettrodi stimolanti (S1 e S2) sono state messe in atto. Pathway S1 è stato utilizzato per indurre LTP, mentre pathway S2 ha agito come controllo. (B) Esempio fEPSP tracce da singoli esperimenti in una fetta perfettamente sano (sinistra) e in una fetta presenta un elevato livello di eccitabilità (a destra). Essi sono stati registrati solo bef minerale di induzione LTP (tracce rosse) e un'ora dopo induzione LTP (linee blu),. Quando le fette non sono perfettamente sano (a destra), le risposte polisinaptici sono osservati e fEPSP pendenza potenziamento è ridotto. (C) Confronto dei relativi tempi di versante fEPSP dopo LTP indotta da un singolo treno di stimolazione ad alta frequenza (100 Hz, 1 sec) registrato nel 2005, 2010 e 2011 nel nostro laboratorio. I primi esperimenti sono stati registrati nel 2005 (cerchi pieni, n = 11). Registrazioni successive (Villers, et al. 2010) hanno beneficiato di una procedura di dissezione migliorato (quadrati pieni, n = 6). Risultati attuali derivano dalla ottimizzazione di interfaccia di ossigenazione e di controllo della temperatura con elettrodo di standardizzazione (cerchi vuoti, n = 6). Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 4. Variazione di pendenza fEPSP in funzione della temperatura e della portata di ossigeno. (A) La crescente flusso di ossigeno nel bagno di acqua sotto della camera di registrazione ,15-0,25 L / min (curva blu) induce una diminuzione della pendenza fEPSP del 20% (curva rosa). (B) Aumentando la temperatura 28-29 ° C (curva verde) induce un aumento di oltre il 50% in fEPSP pendenza (curva rosa). Clicca qui per ingrandire la figura .

Abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio un protocollo risultante dalla combinazione dei metodi sviluppati e utilizzati da altri laboratori aventi un grande esperienza in registrazioni LTP ^11,17. Questo protocollo è atto ad adulto ippocampo mouse e può essere utilizzato in animali di qualsiasi età e qualsiasi sfondo genotipo. Esso permette anche l'analisi LTP in topi transgenici sviluppare malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer ^18,19.

L'utilizzo di questo protocollo di fettine di ippocampo di ratto potrebbe richiedere alcuni adattamenti. Ad esempio, la maggior parte degli studi condotti su ratti utilizzare una temperatura di 32 ° C invece di 28 ° C. Mathis et al. ²⁰ proposto un altro metodo per la preparazione di fettine ippocampali da topi o ratti invecchiamento.

Materiali e metodi

Topi C57BL/6J provengono da JANVIER SAS (Francia) ma stessi risultati si ottengono con topi C57BL/6J da Charl es Fiume Francia.

L'ippocampo è rapidamente isolato, mentre il tessuto viene immerso nel freddo ACSF per ridurre i danni delle cellule. Ciò permette una riduzione eccitotossicità ma è noto per indurre la proliferazione ^21,22 sinapsi che può ulteriormente mascherare plasticità sinaptica strutturale.

Poi usiamo un elicottero tessuto per affettare invece di vibratome. Un chopper tessuto è particolarmente adatta alla sezionamento di piccoli pezzi di tessuto come ippocampo mouse. Sul chopper tessuto, l'ippocampo è sempre orientato allo stesso modo secondo la procedura di Alger et al. ^23. Hanno messo le striature sulla superficie alvear, visibile con illuminazione obliqua, parallela alla lama di rasoio. Questo metodo fornisce fettine di ippocampo della parte dorsale taglio con un angolo di 15 ° rispetto all'asse trasversale (Figura 2C). Successivamente, le fette sono manipolati con un minimo di contatto diretto.

Parametri esterni sono controllati con attenzione per ottenere risultati riproducibili. Bipolari a grappolo elettrodi stimolanti (FTC) sono utilizzati al posto degli elettrodi fatti in casa al fine di aumentare la riproducibilità a induzione, vedendo che l'ampiezza di LTP induzione in realtà dipende dalla qualità elettrodi.

Sistema ETC presso l'Università di Edimburgo ¹¹ mantiene una temperatura costante e uniforme all'interno dell'intero impianto sperimentale e di consumo CARBOGEN è stabilizzato con un misuratore di portata. Livello di interfaccia è controllato visivamente con l'aiuto di un microscopio binoculare chirurgico ed è mantenuto molto stabile con un sistema di aspirazione della pompa peristaltica.

Risultati

Questo protocollo tuttiOWS l'induzione di un LTP molto stabile che rimane dipendente da condizioni esterne come la temperatura e l'ossigenazione. Abbiamo precedentemente dimostrato che la LTP indotta in queste condizioni era dipendente da recettori NMDA, α-CaMKII autofosforilazione e l'attivazione di PI3-chinasi che sono i classici percorsi molecolari coinvolti nella LTP ^14. Al contrario, siamo stati in grado di riprodurre la dipendenza della fase di mantenimento di LTP sulla nuova sintesi proteica. La capacità degli inibitori di sintesi proteica e di anisomycin in particolare, per prevenire lo sviluppo della fase tardiva di L-LTP quando sono stati applicati attorno l'induzione è stata ripetutamente segnalata ^4,25. Questo ha portato all'ipotesi diffusa che stabilizzante plasticità sinaptica per più di circa 2-3 ore richiesto l'attivazione dallo stimolo LTP-induttiva di un transitorio sintesi di nuove proteine ^​​26. Tuttavia, i recenti esperimenti hanno suggerito che le cose erano più complicate ^{27 -}32. LTP indotta nelle nostre condizioni sperimentali è stato mantenuto anche in presenza di inibitori della sintesi proteica suggerendo che altri meccanismi di nuova sintesi proteine ​​potrebbero essere coinvolti nella fase di LTP duratura.

Tuttavia, sperimentazione in vitro solleva sempre la questione della rilevanza fisiologica del fenomeno osservato. Affettatura induce modificazioni nello stato di fosforilazione di proteine ​​coinvolte in forme di attività-dipendente plasticità sinaptica ³³ e alterazione dello stato metabolico del tessuto ^34. Il tasso di sintesi proteica è ridotto al 10 al 15% di quello osservato in vivo ³⁵ ed equilibrio tra mRNA e proteine ​​è disturbato ^36. Per tutte queste ragioni, dobbiamo essere cauti nell'interpretazione dei risultati.

Per definizione LTP è una lunga durata (giorni, settimane) valorizzazione rapidamente indotto di una sinapsi eccitatorie, che probabilmentesvolge un ruolo importante nella memoria a lungo termine. LTP, in vivo, può durare per diverse settimane e cambiamenti simili nella forza sinaptica verificarsi durante l'apprendimento ^37,38. Inoltre, la maggior parte del tempo, quando LTP lungo termine è impedito dalle mutazioni, memoria a lungo termine è compromessa ^39.

Più problematico è il parallelo tra memoria a breve termine e potenziamento di breve durata a lungo termine. Il primo problema è che la durata di ogni fenomeno è sconosciuta. Memoria a breve termine è stato studiato 1 ora a 1 giorno dopo la procedura di apprendimento, mentre LTP a breve termine dovrebbe durare meno di 5 ore. La seconda domanda è se la memoria a breve termine (o di breve durata LTP) è solo un passo in avanti memoria a lungo termine (LTP o lunga durata) o un'entità separata con meccanismi molecolari distinti ^40. In terzo luogo, non sappiamo se LTP a breve termine è indotta da uno stimolo debole che è a corto di causare LTP di lunga durata o se è indotta dallo stesso stimolo, ma unappears solo quando i meccanismi alla base di LTP duraturo sicuro.

La stabilità duratura del LTP nelle nostre condizioni sperimentali, potrebbe essere visto come un breve termine LTP equivalente alla memoria a breve termine di durata compresa tra 10 ore e 24 ore. In questa forma di plasticità sinaptica, la sintesi proteica, che è altamente ridotta in fette, non è necessario e LTP può essere indotta da un singolo treno di stimolazione. Questo aumento duraturo nella forza sinaptica potrebbe essere dovuto ad un aumento stabile nel numero di recettori AMPA nella membrana post-sinaptica senza spine rimodellamento.

Secondo questa ipotesi, la sintesi proteica potrebbe essere necessaria per l'allargamento colonna vertebrale e modificazioni strutturali delle sinapsi portano alla memoria a lungo termine della durata di diverse settimane. In questo caso, la fase diminuente di LTP poteva essere osservato solo 24 ore dopo l'induzione. Purtroppo, fino ad ora, fette acuta possono essere mantenuti in vita solo durante circa 16 ore.

Questa ipotesi potrebbe essere testato utilizzando Tc1 modello murino di sindrome di Down. Morice et al. ⁴¹ hanno dimostrato che, in questi topi, LTP a breve termine in memoria di vivo e di breve termine sono alterate mentre plasticità sinaptica a lungo termine e la memoria sono conservate.

Disparità tra i vari studi eseguiti in laboratori diversi potrebbero essere dovuti alla durata di LTP di breve durata a causa variazione nell'attività enzimatica, nello stato metabolico delle fette o nel tasso di degradazione proteica ^42. Sintesi proteica può essere visto come un processo di rifornimento permissiva coinvolge riposizionare di enzimi che sono stati utilizzati dal processo di apprendimento, o di altri elementi cellulari costitutivi ^43.

Questi risultati sottolineano l'importanza di condizioni sperimentali sulla stabilità LTP. Un LTP indipendente stabile di sintesi proteica potrebbe contribuire a studiare il ruolo di lunga durata post-Traduczionali modificazioni delle proteine ​​sinaptiche e dei meccanismi sottostanti stabile aumento del numero di recettori AMPA nella membrana post-sinaptica nonostante recettori turnover.

Questo video mostra un protocollo dettagliato, che dovrebbe auspicabilmente contribuire ad ottenere risultati riproducibili in laboratori diversi.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamo Bernard Foucart per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo belga per la Ricerca Scientifica (FRS-FNRS) e dal Fondo regina Elisabetta per la ricerca medica. Agnès Villers è assegnista di ricerca presso il Fondo belga per la Ricerca Scientifica.