Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo

En este trabajo se presenta una metodología completa para preparar y conservar In vitro Cortes de hipocampo agudos de ratones adultos. Este protocolo permite la grabación de la potenciación a largo plazo duradera muy estable (LTP) durante más de 8 horas con una tasa de éxito del 95%.

Potenciación a largo plazo (LTP) es un tipo de plasticidad sináptica que se caracteriza por un aumento en la fuerza sináptica y cree que está involucrado en la codificación de la memoria. LTP suscitó en la región CA1 de cortes de hipocampo agudos se ha estudiado ampliamente. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la fase de mantenimiento de este fenómeno son aún poco conocidos. Esto podría deberse en parte a las diversas condiciones experimentales utilizadas por diferentes laboratorios. En efecto, la fase de mantenimiento de la LTP es fuertemente dependiente de los parámetros externos, como la oxigenación, temperatura y humedad. También depende de los parámetros internos como orientación del plano de corte en lonchas y viabilidad rodaja después de la disección.

La optimización de todos estos parámetros permite la inducción de una potenciación muy reproducible y muy estable a largo plazo. Esta metodología ofrece la posibilidad de explorar más a fondo los mecanismos moleculares implicados en el aumento estableen la fuerza sináptica en rebanadas de hipocampo. También destaca la importancia de las condiciones experimentales de investigación in vitro de los fenómenos neurofisiológicos.

Hoy en día, hay una comprensión limitada de cómo se almacenan y recuperan en el plano del circuito neuronal recuerdos complejos. Sin embargo, una hipótesis unificadora de almacenamiento de memoria está disponible y ampliamente aceptado: memorias se almacenan como los cambios en la fuerza de las conexiones sinápticas entre neuronas en el sistema nervioso central. Por su parte, la investigación sobre la plasticidad sináptica se ha beneficiado en gran medida a partir de dos grandes descubrimientos. (1) En un experimento seminal, Bliss y Lomo ^1, usando el conejo anestesiado intacta, encontraron que la entrega de un breve de alta frecuencia (1 seg, 100 Hz) la estimulación de la vía perforante del hipocampo causó una larga duración (varias horas) el aumento de las conexiones sinápticas relacionadas. Este fascinante fenómeno se llama "potenciación a largo plazo" o LTP por Douglas y Goddard en 1975 ^2. (2) Posteriormente, se encontró que un fenómeno similar podría ser activado en rodajas de cerebro (0,4 mm) mantenida artificialmente en activo in vitro . La LTP más ampliamente estudiado se observó in vitro mediante la entrega de uno o varios tetani a un haz de axones (los llamados colaterales de Schaffer) durante la grabación del campo de potencial sináptico excitatorio resultante evocado en las neuronas piramidales de la llamada región CA1. Los mecanismos de inducción de LTP en gran medida han sido revelados. Básicamente, un influjo de ^{Ca2 +} a través de los receptores de NMDA activa las enzimas con dos consecuencias: una fosforilación de los receptores AMPA (lo que aumenta su eficiencia) y una incorporación de los receptores AMPA supletorias en la membrana postsináptica ^3. Por el contrario, los mecanismos de la fase de mantenimiento de la LTP son en gran parte desconocidos, en particular debido a que es experimentalmente mucho más difícil mantener una rebanada saludable para muchas horas de durante 30 a 60 min.

Una gran cantidad de estudios se han dedicado a la comprensión de los mecanismos de LTP y teorías interesantes han sido elaborados durante los años ^4-11. Pero sinhasta ahora, los mecanismos moleculares precisos que subyacen en el aumento estable en la fuerza sináptica no se han dilucidado. Esto podría deberse en parte a la dificultad de reproducir los resultados anteriores en distintos laboratorios, utilizando diferentes técnicas para la preparación y el mantenimiento de los cortes de hipocampo. En su documento sobre la metodología, Sajikumar et. Al ¹² hizo hincapié en la importancia de las condiciones experimentales para la preparación de rodajas de hipocampo de rata y el registro de LTP estable. En este video se presenta todos los pasos de optimización desarrollados en nuestro laboratorio en los últimos años para poder grabar una LTP muy estable en rodajas de hipocampo de ratón.

Esta optimización se ha realizado a partir de protocolos desarrollados y utilizado con éxito por otros laboratorios que estudian los mecanismos de LTP en ratones y ratas ^{13 11.} Se permite a los investigadores experimentados para inducir y grabar un LTP duración muy larga en ratones adultos con una alta tasa de éxito. El physiological base de la LTP inducida fue comprobado cuidadosamente y demostró ^14. En este documento sobre la metodología, se muestra que las modificaciones de las condiciones experimentales, como la temperatura o la oxigenación pueden tener un profundo impacto en el mantenimiento LTP, mientras que el procedimiento de disección puede modificar profundamente rebanadas excitabilidad. También debe hacerse hincapié en que el control preciso de todos estos parámetros requiere una formación de varios meses para los estudiantes novatos.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de los reglamentos para el cuidado y uso de animales en la investigación y con el acuerdo del comité de ética local.

1. Preparación artificial de fluido cerebro-espinal

Los mismos medios de comunicación se utiliza para diseccionar, cortar y perfundir rebanadas (1 ml / min) durante el período de reposo y los registros electrofisiológicos. Este medio está compuesto de 124 mM de NaCl, 4,4 mM de KCl, 26 mM de _NaHCO3, 1 mM NaH ₂ PO _4, 2,5 mM de _CaCl2, 1,3 mM _MgSO4 y 10 mM de D-glucosa.

1. Pesar los diferentes componentes para 2 l de _MgSO4 ACSF excepto que ya está en solución (1 M). Usando una solución estándar permite estar seguro de la concentración exacta de Mg ^{2 +} porque _MgSO4 en polvo es altamente higroscópico. Ca ^{2 +:} Mg ^{+ 2} ratio influye mucho en la inducción y mantenimiento de LTP¹⁴ y por lo tanto sus proporciones deben ser siempre respetados.
2. Poner todos los componentes, excepto _CaCl2 en un vaso aforado y llevar a 2 L con agua destilada H ₂ O.
3. Agitar vigorosamente. Cuando todo esté disuelto, añadir carbógeno través de un burbujeador de acuario y tubo conectado al depósito (95% O _2, 5% de CO _2). Espere unos minutos y añadir cloruro de calcio cuando el pH se fija en 7,4 por la acción de tampón de bicarbonato.
4. Mantenga 600 ml en un plato de cristal rectangular refrigerado y enfriar a 4 ° C con hielo alrededor del plato. Estos medios serán utilizados para la disección hipocampo.
5. Filtrar el 1400 ml restantes y mantenerse en un erlenmeyer.

2. Preparación del Rig electrofisiológico y el corte de cerebro Cámara de grabación

El circuito de perfusión es de 2 bombas peristálticas, uno bombear fluido fresco de un tanque de reserva y el otro de bombeo de fluidos utilizados en tque la grabación cámara a un bin. Se añade fluido fresco a un sistema de perfusión hecha en casa donde se reoxigene y se calentó antes de llegar a la cámara de grabación de interfaz por gravedad (Figura 1A). La cámara de grabación de interfaz fue diseñada por FST (Herramientas de Bellas ciencia, Vancouver, Canadá, Figura 1B). Rodajas de tejido se colocan en el filtro de red tejida unidos a un anillo bien extraíble y se puede mantener continuamente bajo condiciones de interfaz mediante el ajuste de la altura de la aguja de aspiración así. Un tubo de plástico de fabricación casera bloqueado en su extremo y perforada lateralmente (0,5 mm) se fija a la aguja de aspiración para aumentar la estabilidad de nivel en la cámara. El cabezal de impresión está montado sobre un baño de agua que contiene una piedra de dispersión de gas que ayuda a mantener un ambiente húmedo haciendo pasar aire húmedo a través de los puertos de deflexión en el cabezal de impresión (para disminuir la formación de gotitas de agua). Baño y media temperatura son controlados por la variación continua del nivel de DC th actualáspero una silicona de goma incorporado elemento calentador en el baño de agua. Termistores en el baño de agua y pozos de registro permiten la temperatura de la cámara para ajustar y controlar con precisión en estos sitios.

El sistema de calefacción de la cámara se completa con un sistema de calentamiento global de control de la temperatura de todo el equipo de perforación. El software desarrollado por investigadores de la Universidad de Edimburgo ( www.etcsystem.com ) supervisa e iguala la temperatura del aire oxigenado, la porción del cerebro, los electrodos y la plataforma queda proporcionando un ambiente estable para grabaciones de larga duración (Figura 1C) . La temperatura usada para cortes de hipocampo de ratón es 28 ° C.

1. Enjuague todo el circuito de perfusión con _H2O destilada durante un mínimo de 20 minutos y empezar los sistemas de calefacción.
2. Iniciar el burbujeo carbógeno en el circuito. Carbogen llega a los caseros a través de tubos de perfusión fvelas Ilter y en el baño de agua por debajo de la cámara de registro. La velocidad de flujo en el baño de agua está controlada por un medidor de flujo. Si el caudal es demasiado lento, el tejido podría llegar a ser hipóxico. A la inversa, si la tasa de flujo es demasiado alta, el gas podría no ser suficientemente calentada y humectada que conduce a secado del tejido. Tasa de flujo de gas de alta también podría aumentar la posibilidad de pulverización de agua sobre el tejido del baño de agua por debajo que conduce a choque osmótico. Esto se puede evitar mediante la adición de bits de malla de nylon (100 micras) en la salida de los puertos de deflexión.
3. Vaciar el circuito y se llenan de ACSF filtrada.
4. Coloque el anillo que apoyará el corte en la cámara de retención. Un filtro de red tejida con aberturas de malla que van de 500 a 750 micras se estira y unido al anillo con dos partes de resina epoxi pegamento. El filtro de red tejida está hecha de 87% poliamida y 13% elastano (Panty 15 den). Pegamento se debe aplicar cuidadosamente para evitar la formación de relieves en la superficie del ring.
5. Retire con cuidado todas las burbujas de aire del circuito.
6. Ajuste el nivel de ACSF en la cámara de registro con el tornillo de la aguja de aspiración. La velocidad de las bombas peristálticas se ajusta a 1 ml / min para la entrada de la bomba y a 5 ml / min para la salida de la bomba.

El sistema de perfusión se coloca sobre una mesa de vibración-resistente y rígido rodeado por una jaula de Faraday.

3. Preparación de la zona de disección

Los instrumentos quirúrgicos: un bisturí con una hoja # 11, unas tijeras pequeñas estándar disección, tijeras, pinzas de resorte curvas, dos Heidemann espátulas y una cuchara.

Material complementario: una guillotina, una almohadilla inferior, un cortador de tejidos McIlwain con una hoja de afeitar, papel de filtro, una pipeta Pasteur de vidrio con una tetina de goma, 2 Pipetas Pasteur plástico uno de los cuales con una boca ancha, una placa de Petri, un cilindro metálico de 7 mm de diámetro (Figura 2A).

1. En el plato de disección llena de frío ACSF (preparado en el paso 1), sumerjo una tapa de vidrio refrigerada de una placa de tinción, envuelto en papel de filtro. Retire con cuidado las burbujas de aire y oxigenar la ACSF a través de un burbujeador de acuario (Figura 2A).
2. Diseñar instrumentos con el fin de uso. Añadir tres capas de papel de filtro en la placa de cortador de tejidos y una nueva hoja de afeitar limpia con agua destilada y éter (Figura 2B). La cuchilla debe ser horizontal cuando toca el papel. Fuerza de la cuchilla se ajusta a la mitad del valor máximo y la velocidad a aproximadamente un tercio del valor máximo.
3. Atentamente comprobar si todo está listo (instrumentos, temperatura ...) porque no tendrá tiempo después.
4. Pídale a alguien que rociar la disección con una pipeta Pasteur llena de ACSF frío.
5. Anestesiar el ratón con IP Nembutal (100 mg / kg) antes de la decapitación. Anestesia con halotano también se puede utilizar. Hemos comparado los dos métodos y obtaINED mismos resultados. Decapitación debe realizarse bajo anestesia pero dislocación cervical también puede ser utilizado. Sin embargo dislocación cervical necesita una muy buena práctica para evitar el sufrimiento de los animales.
6. Disección de la underpad lo antes posible bajo la ducha continua ACSF frío.

4. La extracción del cerebro

1. Mientras mantiene todavía la cabeza con el dedo índice y el pulgar de una mano en la boca del cañón, hacer una incisión con las tijeras de disección a lo largo de la mitad de la parte superior de la cabeza de partida en el borde del corte de guillotina y funcionando rostral al hueso frontal .
2. Cortar a través del músculo cutáneo en cada lado de la cabeza para exponer completamente las placas de cráneo y eliminar los músculos en el lado caudal de la cabeza.
3. Con las tijeras de disección, corte el músculo temporal en cada lado, a lo largo de la placa temporal, a continuación, cortar las placas frontales en el medio, transversalmente. A continuación, hacer un pequeño corte en el hueso occipital, entre los dos plates.
4. Para cada lado, cortado en la base caudal de las placas occipitales.
5. Corte a lo largo de la sutura sagital con unas tijeras de primavera.
6. Con unas pinzas, retire las mitades de cráneo, mediante la difusión de lejos el uno del otro.
7. Con el bisturí, cortado transversalmente justo después de que el bulbo olfatorio y justo antes de que el cerebelo entonces sumergirse el cerebro extraído en el plato de disección con ACSF frío.

5. Disección del hipocampo

1. Una vez que el cerebro está sumergido en el plato de disección, cortar los dos hemisferios de uno al otro con un escalpelo insertado en el centro.
2. La disección de hipocampo se realiza con espátulas bajo control visual a través de un microscopio quirúrgico binocular (X25, Figura 2A). En uno de los hemisferios, se extendió con cuidado las estructuras para ver el ventrículo lateral. Retirar el tallo cerebral y el diencéfalo. Esto se hace mediante la aplicación de la espátulas en la corteza frontal en un lado y en el diencéfalo en laotro lado. Tenga cuidado de no tocar el hipocampo con espátulas y no estirarlo durante el corte del tejido.
3. Sever el fondo de saco y luego empuje suavemente el hipocampo de la corteza (removerá), mediante la inserción de una espátula en el ventrículo.
4. Cuando se extrae el hipocampo, eliminar el exceso de tejido de la corteza y el resto de los vasos sanguíneos.

6. El corte de las rebanadas

1. Con un plástico de boca ancha pipeta Pasteur, transferir el hipocampo en una cuchara con su superficie hacia arriba Alvear (lado convexo).
2. Retire el exceso de líquido con una pipeta Pasteur de plástico estándar.
3. Incline la cuchara verticalmente casi tocando el papel de filtro del helicóptero (Figura 2B) y dejar el hipocampo de la cuchara, tocando rápidamente el papel de filtro y retírese la cuchara.
4. Orientar el hipocampo y cortarlo transversalmente a 400 micras con el helicóptero (véase la figura 2C para la orientación del hipocampopus con respecto a la hoja de afeitar). Actuar lo más rápidamente posible.
5. Retire el papel de filtro con el hipocampo en rodajas y se envuelve alrededor del cilindro metálico para difundir las rodajas un poco. Entonces, sin los cortes con chorros de ACSF utilizando un plástico pipeta Pasteur y su recopilación en una placa de Petri llena de ACSF fría estándar.

7. La incubación de las rebanadas de la interfaz de

1. Seleccionar rebanadas con un plástico pipeta Pasteur estándar y rápidamente colocarlos en la cámara de registro. Rebanadas recuperarse del trauma disección directamente en la cámara de registro, en la interfaz a 28 ° C.
2. El corte lo más probable fregadero. Baje el nivel de líquido para alcanzar el nivel de macro, y luego elevarlo a hacerlo flotar.
3. Gire el corte en la posición correcta mientras que la reducción del nivel. Las rebanadas son siempre orientado en la misma forma para facilitar la colocación de los electrodos (2 estimulante y uno electrodos de registro) en la región CA1.
4. Deténgase cuandoel fluido es en la interfaz. Un "menisco" de los medios de comunicación alrededor de la rebanada es indicativo de un nivel suficiente de medios de comunicación. El filtro de red debe estar saturado con los medios de comunicación, pero no completamente sumergido.
5. Mantenga la cámara cubierta con papel de filtro colocado sobre la tapa perforada.
6. Dejar reposar la rebanada durante al menos 1,5 horas a 28 ° C.

8. Grabación de las respuestas sinápticas

1. Grabación de electrodo: capilares de vidrio se retiró para obtener una resistencia a punta de 2-5 mW cuando se llena de ACSF. Un pequeño trozo de papel de filtro se coloca alrededor de la punta del electrodo y la cera de hueso se aplica en la extremidad para reducir la condensación. Electrodos de estimulación: platino iridio electrodos bipolares de racimo con un diámetro de 12,5 micras se compran a FHC (EE.UU.). Con el cuidado adecuado, cada electrodo se puede utilizar al menos 30 veces (Figura 1B).
2. La posición de los electrodos en el stratum radiatum de la región CA1, todos los electrodos alineadosarriba (Figura 3A). Los electrodos se bajaron 75 a 150 micras debajo de la superficie de la rebanada con micromanipuladores Narishige. Los dos electrodos de estimulación se colocan para estimular dos paquetes distintos de Schaffer colaterales. Cuando los electrodos se bajan en el sector, filtros de papel son cuidadosamente colocados a su alrededor para cerrar la cámara.
3. La estimulación bifásica (0,08 mseg duración del pulso por medio de la onda) se lleva a cabo a un voltaje constante con un estimulador Grass conectado a unidades de aislamiento SIU-V. La respuesta máxima se comprueba mediante el aumento de la intensidad del estímulo de 2 V a un máximo de 12 V. EPSP de campo son amplificados 1000 veces con un amplificador de WPI ISO-80 y se filtraron a 10 Hz y 10 kHz. La señal se envía entonces a un PC a través de un Instrumento Nacional convertidor A / D. Estimulación, adquisición y análisis de datos se realizaron con el programa WinLTP ( www.winltp.com ). EPSP de campo se registran al 40% de la amplitud máxima obtenida en una entrada Salidaponer curva. Para cada sector, las laderas fEPSP se normalizaron en contra de la pendiente media en el min 30 anterior LTP inducción.
4. LTP se activa mediante la aplicación de un solo tren de estimulación (100 Hz) a la fuerza de prueba en una vía, mientras que la segunda vía sirve como un control.

9. La limpieza de la instalación

1. Enjuague todo el circuito con una solución al 3% de peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂₎ por lo menos durante 10 min, luego de drenaje. El circuito se enjuaga cuidadosamente con agua destilada antes de comenzar cualquier experimento. El uso de H ₂ O ₂ no es absolutamente necesario que otros laboratorios utilizan únicamente agua destilada para limpiar, pero hemos notado la deposición de residuos oscuros en el sistema de tuberías cuando se utiliza sólo agua.
2. Cambie el agua en el baño de agua por debajo de la cámara de registro.
3. Baño de los electrodos de estimulación consejos en alcohol durante 5 min.

Esta metodología se ha utilizado para analizar las propiedades de larga duración potenciación a largo plazo inducida en cortes de hipocampo agudos de C57Bl/6J ratones adultos (JANVIER SAS, Francia) ^14. Sorprendentemente, la mejora de las condiciones experimentales ha dado lugar a una nueva forma de ver la LTP. Hemos demostrado que aumentan la larga duración en la fuerza sináptica no requiere la síntesis de nuevas proteínas.

Aquí, mostramos que la inducción de LTP depende rebanadas viabilidad y excitabilidad. Cuando la disección del hipocampo era demasiado lento o demasiado perjudiciales, rodajas de excitabilidad aumentada y respuestas polisinápticos se puede observar después de la inducción de LTP (Figura 3B). En este caso, la inducción de LTP fue mucho menos eficaz y potenciación no se mantuvo.

Nos gustaría hacer hincapié en el hecho de que, incluso en rodajas condiciones aparentemente sanos, técnicos tienen una gran influencia en la duración de la LTP inducida por una solatren de estimulación. En publicaciones anteriores, nuestro grupo demostró que un LTP de corta duración se puede transformar en un uno de larga duración mediante la modificación de las condiciones de recuperación de la rebanada ^15. Durante años de práctica diaria, se observó que las mejoras sucesivas en nuestra técnica han dado lugar a un aumento progresivo de la duración de la LTP inducida por un solo tren en condiciones estándar. De hecho, las grabaciones realizadas en 2005 mostraron una LTP de corta duración que se remonta a la línea de base a menos de 3 horas (Figura 3C, círculos rellenos). Las modificaciones en el procedimiento de la reducción de la disección del tejido estiramiento han hecho posible la obtención de un LTP sostenido durante 6 hr ¹⁶ (Figura 3C, cuadrados rellenos). Y, por último, la mejora de la oxigenación y la interfaz de control de la temperatura, en combinación con la normalización electrodo han dado lugar a un LTP estable durante más de 8 horas (Figura 3C, círculos abiertos). La diferencia entre los tres grupos es significativa (uno-way ANOVA, F (2,20) = 49,5, p <0,001).

Por otra parte, cualquier modificación de la temperatura o la oxigenación inducida por un aumento o una disminución de la respuesta sináptica (Figura 4). El control de estos parámetros siempre se comprobó mediante el uso de dos electrodos de estimulación. LTP fue inducida en un haz de colaterales de Schaffer mientras que otro paquete se utilizó como control interno de la estabilidad de la fuerza sináptica.

Figura 1. Rig electrofisiológico y cámara de grabación de cortes de cerebro. (A) del circuito de perfusión con sistema de perfusión de la gravedad a medida casa alimentaba mediante una bomba peristáltica, unidades de estimulación aislados (dos por electrodo), microscopio quirúrgico y cámara de registro. (B) cámara de registro de interfaz con la estimulación yelectrodos de registro. Los papeles de filtro se han retirado de la tapa para ver el anillo de soporte de la rebanada. (C) Unidad de control con 2 estimuladores, osciloscopio, un convertidor A / D, software de control de la temperatura y de software WinLTP.

Figura 2. Herramientas y materiales utilizados para cortar el hipocampo. (A) plato de disección que contiene ACSF refrigerado y microscopio quirúrgico. Bisturí montado con un # 11 cuchillas, tijeras pequeñas estándar de disección, tijeras, pinzas de resorte curvas, dos Heidemann espátulas, cucharas, 2 Pipetas Pasteur plástico uno de los cuales con una boca ancha, caja de Petri, el cilindro metálico de 7 mm de diámetro y un anillo que soporta el corte en la cámara de grabación. (B) cortador de tejidos McIlwain. (C) dibujo y la fotografía of el hipocampo izquierdo en la posición de corte. La orientación de la cuchilla de afeitar se indica mediante la línea discontinua de color rojo. Escala de la retícula:. 1 mm Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 3. La inducción de LTP en rebanadas de hipocampo. (A) croquis que muestra las dos entradas sinápticas independientes S1 y S2 de la misma población neuronal. En cada sector, dos electrodos de estimulación (S1 y S2), se pusieron en marcha. Vía S1 se utiliza para inducir la LTP, mientras que la vía S2 actuó como control. (B) muestra trazas fEPSP de los experimentos individuales en una rebanada perfectamente sano (a la izquierda) y en una rebanada presentar un alto nivel de excitabilidad (a la derecha). Fueron grabadas sólo bef mineral de la inducción de LTP (trazas de color rojo) y una hora después de la inducción de LTP (huellas azules). Cuando no están perfectamente sano (a la derecha), se observan respuestas polisinápticos rodajas y potenciación pendiente fEPSP se reduce. (C) Comparación de los cursos de tiempo de la pendiente de fEPSP después de LTP inducida por un solo tren de estimulación de alta frecuencia (100 Hz, 1 s) registrado en 2005, 2010 y 2011 en nuestro laboratorio. Los primeros experimentos se registraron en 2005 (círculos rellenos, n = 11). Grabaciones posteriores (Villers, et al. 2010) se beneficiaron de un procedimiento de mejora de la disección (cuadrados rellenos, n = 6). Los resultados actuales se derivan de la optimización de la oxigenación y la interfaz de control de temperatura, junto con la estandarización de electrodos (círculos blancos, n = 6). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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La Figura 4. Variación de la pendiente fEPSP como una función de la temperatura y la tasa de flujo de oxígeno. (A) El aumento de caudal de oxígeno en el baño de agua por debajo de la cámara de grabación de 0,15 a 0,25 l / min (curva azul) induce una disminución en la pendiente de fEPSP 20% (curva de color rosa). (B) El aumento de la temperatura de 28 a 29 ° C (curva verde) induce un aumento de más del 50% en fEPSP pendiente (curva rosa). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Hemos desarrollado en nuestro laboratorio un protocolo resultante de la combinación de los métodos desarrollados y utilizados por otros laboratorios que tienen una gran experiencia en la LTP grabaciones ^11,17. Este protocolo está adaptado para adultos hipocampo del ratón y se puede utilizar en animales de cualquier edad y de cualquier genotipo fondo. También permite el análisis de LTP en ratones transgénicos en desarrollo las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer ^18,19.

La utilización de este protocolo de cortes de hipocampo de rata podría requerir algunas adaptaciones. Por ejemplo, la mayoría de los estudios realizados en ratas usar una temperatura de 32 ° C en lugar de 28 ° C. . Mathis et al ²⁰ propuso otro método para la preparación de cortes de hipocampo de ratones o ratas de edad avanzada.

Material y métodos

Ratones C57BL/6J provienen de JANVIER SAS (Francia), pero mismos resultados se obtienen con ratones C57BL/6J de Charl es el río Francia.

El hipocampo se aísla rápidamente, mientras que se sumerge el tejido en ACSF frío para reducir el daño celular. Esto permite una reducción de la excitotoxicidad, pero se sabe que inducen la proliferación de sinapsis ^21,22 que puede enmascarar aún más la plasticidad sináptica estructural.

Luego usamos un cortador de tejidos para el corte en lugar de vibratome. Un cortador de tejidos está particularmente bien adaptado para el seccionamiento de pequeñas piezas de tejido como el hipocampo del ratón. En el cortador de tejidos, el hipocampo es siempre orientado en la misma manera de acuerdo con el procedimiento de Alger et al. ^23. Se colocan las estrías en la superficie alvear, visible con iluminación oblicua, paralela a la hoja de afeitar. Este método proporciona rodajas de hipocampo de la parte dorsal de corte con un ángulo de 15 ° desde el eje transversal (véase la figura 2C). Posteriormente, las rebanadas son manipulados con un mínimo de contacto directo.

Parámetros externos se controlan cuidadosamente para obtener resultados reproducibles. Bipolar racimo electrodos de estimulación (FTC) se utilizan en lugar de los electrodos de fabricación casera con el fin de aumentar la reproducibilidad en la inducción, ya que la amplitud de la inducción de LTP en realidad depende de la calidad de los electrodos.

Sistema de ETC de la Universidad de Edimburgo ¹¹ mantiene una temperatura constante y uniforme en el interior de todo el equipo de perforación experimental y el consumo de carbógeno se estabiliza con un medidor de flujo. Nivel de interfaz se controla visualmente con la ayuda de un microscopio quirúrgico binocular y se mantiene muy estable con un sistema de aspiración de la bomba peristáltica.

Resultados

Este protocolo todoows la inducción de LTP un muy estable que sigue dependiendo de las condiciones externas tales como la temperatura y oxigenación. Hemos demostrado anteriormente que la LTP inducida en estas condiciones era dependiente de los receptores de NMDA, α-CaMKII autofosforilación y la activación de la PI3-quinasa que son las vías moleculares clásicos que participan en la LTP ^14. Por el contrario, hemos sido incapaces de reproducir la dependencia de la fase de mantenimiento de la LTP en la síntesis de nuevas proteínas. La capacidad de los inhibidores de síntesis de proteínas, y de anisomicina, en particular, para prevenir el desarrollo de la fase tardía de la L-LTP cuando se aplicaron alrededor de la inducción se ha informado en varias ocasiones ^4,25. Esto ha llevado a la hipótesis común de que la estabilización de la plasticidad sináptica durante más de alrededor de 2-3 horas requiere la activación por el estímulo LTP-inductivo de una síntesis transitoria de nuevas proteínas ^26. Sin embargo, experimentos recientes han sugerido que las cosas eran más complicadas ^{27 -}32. LTP inducida en nuestras condiciones experimentales se mantiene incluso en presencia de inhibidores de la síntesis de proteínas lo que sugiere que otros mecanismos que nueva síntesis de proteínas podrían estar involucrados en la fase duradera de la LTP.

Sin embargo, la experimentación in vitro siempre plantea la cuestión de la relevancia fisiológica del fenómeno observado. Rebanar induce modificaciones en el estado de fosforilación de las proteínas implicadas en formas dependientes de la actividad de la plasticidad sináptica ³³ y la alteración en el estado metabólico del tejido ^34. La tasa de síntesis de proteínas se redujo a 10 a 15% de la observada in vivo ³⁵ y el equilibrio entre el ARNm y las proteínas se ve perturbado ^36. Por todas estas razones, hay que ser cauteloso en la interpretación de los resultados.

Por definición LTP es una mejora inducida rápidamente de larga duración (días, semanas) de una sinapsis excitatoria, lo que probablementedesempeña un papel importante en la memoria a largo plazo. LTP, in vivo, puede durar varias semanas y los cambios similares en fuerza sináptica producirse durante el aprendizaje ^37,38. Además, la mayoría de las veces, cuando LTP a largo plazo se evita por mutaciones, la memoria a largo plazo se ve afectada ^39.

Más problemático es el paralelo entre la memoria a corto plazo y de corta duración potenciación a largo plazo. El primer problema es que la duración de cada fenómeno es desconocida. La memoria a corto plazo se ha estudiado 1 hora 1 día después de la intervención de aprendizaje mientras que LTP corto plazo se supone que debe durar menos de 5 horas. La segunda pregunta es si la memoria a corto plazo (LTP o de corta duración) no es más que un paso adelante la memoria a largo plazo (LTP o de larga duración) o una entidad independiente con distintos mecanismos moleculares ^40. En tercer lugar, no sabemos si LTP corto plazo es inducida por un estímulo débil que no llega a causar LTP de larga duración o si es inducida por el mismo estímulo, sino unppears sólo cuando los mecanismos que subyacen a LTP duradera fallar.

La estabilidad de larga duración de la LTP en nuestras condiciones experimentales podría ser visto como un LTP corto plazo equivalente a la memoria a corto plazo, que dura entre 10 hr y 24 hr. En esta forma de plasticidad sináptica, la síntesis de proteínas, lo cual es muy reducido en rodajas, no es necesario y LTP puede ser inducida por un solo tren de estimulación. Este incremento de duración prolongada en la fuerza sináptica podría ser debido a un aumento estable en el número de receptores de AMPA en la membrana post-sináptica y sin remodelación columna vertebral.

De acuerdo con esta hipótesis, la síntesis de proteínas podría ser necesaria para la ampliación columna vertebral y las modificaciones estructurales de las sinapsis que conducen a largo plazo de memoria que dura varias semanas. En este caso, la fase de decrecimiento de la LTP sólo se pudo observar 24 h después de la inducción. Por desgracia, hasta ahora, sólo las rebanadas agudas pueden ser mantenidos con vida durante aproximadamente 16 horas.

Esta hipótesis podría ser probado usando Tc1 modelo de ratón del síndrome de Down. Morice et al. ⁴¹ han demostrado que, en estos ratones, LTP a corto plazo en memoria de vivo y de corto plazo se vean afectados, mientras que la plasticidad sináptica a largo plazo y la memoria se conservan.

Las discrepancias entre los diferentes estudios realizados en diferentes laboratorios podría ser debido a la duración de la LTP de corta duración debido a la variación en la actividad enzimática, en el estado metabólico de las rodajas o en la tasa de degradación de la proteína ^42. La síntesis de proteínas puede ser visto como un proceso de reposición permisiva que implica cambiar la posición de las enzimas que han sido utilizados por el proceso de aprendizaje, o de otros elementos constitutivos de células ^43.

Estos resultados resaltan la importancia de las condiciones experimentales en la estabilidad de LTP. A LTP independiente estable de la síntesis de proteínas podría ayudar a estudiar el papel de larga duración post-traduccionales modificaciones de las proteínas sinápticas y los mecanismos que subyacen aumento estable del número de receptores de AMPA en la membrana post-sináptica a pesar de los receptores de volumen de negocios.

Este video muestra un protocolo detallado que esperemos que ayudará a obtener resultados reproducibles en diferentes laboratorios.

No hay conflictos de interés declarado.

Damos las gracias a Bernard Foucart de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Belga para la Investigación Científica (FRS-FNRS) y por el Fondo de la Reina Elisabeth de Investigación Médica. Agnès Villers es Investigador Asociado en el Fondo Belga para la Investigación Científica.