长时程增强一个非常稳定的和可重复的记录和保存海马鼠标片制备工艺的改进

本文提出了一种完整的方法来准备和保存在体外急性成年小鼠海马脑片。该协议允许非常稳定持久的长时程增强（LTP）的记录超过8小时，95％的成功率。

长时程增强（LTP）是一种类型的神经元突触可塑性，其特征在于由突触强度的增加，被认为参与记忆编码。 LTP诱导急性海马切片的CA1区中已被广泛研究。然而，维护阶段这种现象背后的分子机制仍然知之甚少。这可能是部分原因是由于不同的实验室所使用的各种实验条件。事实上，对LTP的维持阶段是强烈地依赖于充氧，温度和湿度等外部参数。它也是依赖于内部参数，如解剖后切片平面和切片活力的方向。

所有这些参数的优化使一个高度可再现性和非常稳定的长时程增强的诱导。这种方法提供了可能的分子机制，进一步探索参与稳定增长海马脑片突触强度。这也凸显了在体外研究的神经生理现象的实验条件的重要性。

如今，有多么复杂的存储和调用记忆在神经回路水平的了解有限。然而，记忆存储是一个统一的假设和广泛接受的记忆存储在中枢神经系统的神经元之间的突触连接强度的变化。就其本身而言，对突触可塑性的研究已经在很大程度上得益于两个突破性的发现。 （1）在一个开创性的实验，极乐和Lomo ^1，使用完整的麻醉兔，结果发现提供一个短暂的高频率（1秒，100赫兹）刺激海马穿路径造成一个长期持久的（几个小时）增加相关的突触连接。这迷人的现象被称为“长时程增强”或LTP由道格拉斯和戈达德在1975年^2。 （2）随后，我们发现了类似的现象可能会触发在脑切片（0.4毫米）的人为保持的活体外 。研究得最广泛的LTP是通过提供一个或多个破伤风记录产生的场兴奋性突触电位在所谓的CA1区锥体细胞诱发的成捆的轴突（所谓的谢弗络），而在体外观察到。诱导LTP的机制在很大程度上被显露出来。基本上，Ca ^{2 +}的涌入通过NMDA受体激活酶有两个后果：AMPA受体的磷酸化（提高效率）和加入额外的AMPA受体在突触后膜^3。 LTP的维持阶段的机制，与此相反，在很大程度上是未知的，特别是因为它是实验更难以维持健康的许多小时，比30至60分钟切片。

大量的研究，一直致力于为LTP机制的理解和有趣的理论已经阐述多年来^4-11。但联合国直到现在，精确的分子突触强度的稳定增长机制尚未阐明。这可能是部分原因是由于难以再现先前结果在不同实验室使用不同的技术来制备和海马切片的维护。在他们的方法纸，Sajikumar 等¹²强调的实验条件下对大鼠海马脑片的制备和记录LTP稳定的重要性。在这段视频中，我们介绍了多年来在我们的实验室开发的，能够记录一个非常稳定的小鼠海马脑片LTP的优化步骤。

这种优化已经开发并成功使用小鼠^13只大鼠和¹¹其他实验室研究LTP机制的协议。它允许有经验的研究人员，以诱导和记录一个很长的持久LTP具有很高的成功率，在成年小鼠。在p诱导LTP hysiological基础进行了仔细的检查，并展示了^14。在这种方法中纸，我们展示的任何修改的实验条件下，可以产生深远的影响，如温度或氧LTP维护解剖过程，同时可以深入修改切片兴奋。还必须强调的是，所有这些参数的精确控制需要几个月的培训新手同学。

按照与国立卫生法规的护理和使用动物的研究，并与当地伦理委员会的协议，所有动物的程序进行。

1。人工脑脊髓液的制备

同一介质，则用于解剖，切割和灌注片（1毫升/分钟），在休息期间和电生理记录。这种介质组成的124 mM氯化钠，氯化钾4.4毫米，26毫米的NaHCO _3，1毫米的NaH ₂ PO _4，1.3毫米，2.5毫米_的 CaCl _2，用MgSO ₄和10mM D-葡萄糖。

1. 称取的不同组成部分，在2 L的ACSF MgSO ₄干燥_，这是已在溶液（1M）除外。使用标准的解决方案，可以肯定的准确浓度的Mg ^{2 +，}因为_硫酸镁粉是高吸湿性。的Ca ^{2 +：Mg 2 +的}比例大大影响LTP的诱导和维持^14岁 ，因此他们的比例必须始终得到尊重。
2. 把_氯化钙在玻璃以外的所有元件量筒带来2升蒸馏水H ₂ O
3. 大力搅拌。当一切都溶解后，加卡波通过水族馆鼓泡管连接到所述容器（95％O _{2，5％CO 2）。}等待几分钟添加氯化钙，当pH值固定在7.4的碳酸氢盐缓冲液的作用。
4. 长方形玻璃盘在冷藏，并保持600毫升，冷却至4℃，周围的冰盘。这的媒体将用于海马解剖。
5. 过滤其它1400毫升的，并保持在一个锥形烧瓶中。

2。制备电钻机和脑切片录音室

灌注电路由2个蠕动泵，一个泵送新鲜的流体从储备罐和其他用泵送流体从吨他在录音室的垃圾桶。新鲜的流体被添加到重新充氧并温热才到达的接口的录音室，通过重力（ 图1A）的自制的灌注系统。接口录音室的设计是由FST（精细的科学工具，温哥华，加拿大， 图1B）。组织切片被放置在连接到一个可移动的以及环，并且可以连续地保持在接口条件下通过调节在抽吸的高度以及针机织网式过滤器。自制挡在其端和横向穿孔（0.5毫米）的塑料管吸针固定室水平稳定提高。在记录头安装在一个水浴含有气体分散石头这有助于保持潮湿的环境中，通过潮湿的空气中，通过在记录头中的偏转端口（减少水滴的形成）。巴斯和介质温度控制连续变化的水平直流电流日粗糙的硅橡胶嵌入在水浴加热器元件。的水浴中，并记录井的热敏电阻在允许的腔室温度设置和精确监测站点。

的腔室的加热系统是一个全球性的加热系统的温度控制整个钻机完成。开发的软件由爱丁堡大学（ www.etcsystem.com ）的研究人员在监控和均衡的含氧空气的温度，脑片，电极，其余钻机提供一个稳定的环境，长期的录音（ 图1C） 。用于小鼠海马脑片的温度是28°C

1. 最少20分钟，用蒸馏水H ₂ O冲洗灌注电路，启动加热系统。
2. 启动卡波在电路中的鼓泡。 CARBOGEN到达自制灌注管到fILTER蜡烛和在水浴低于录音室。水浴中的流速控制由流量计。如果流速太慢，则可能会成为缺氧组织的。反之，如果流速太高，气体可能不会有足够的加热的和滋润的，导致组织的干燥。高的气体的流速也可以增加从水浴中水喷洒在组织下面，导致渗透压冲击的机会。这可以防止通过增加比特尼龙网（100微米）的出口处的偏转端口。
3. 沥干电路和填补过滤学联。
4. 放环将支持片控股室。甲织网式过滤器具有范围从500到750微米的网孔被拉长，并连接到该环由两部分组成的树脂环氧树脂胶。无纺布滤净87％锦纶13％氨纶（内裤15旦）。胶，必须小心，以避免形成浮雕的打印在表面克。
5. 仔细清除所有气泡从电路。
6. 调节电平，在与螺钉的录音室的吸入针ACSF。蠕动泵的速度调整为1毫升/分钟的入口泵出口泵以5毫升/分钟。

灌注系统被放置在一个刚性的耐振表，周围环绕着一个法拉第笼。

3。准备解剖区

手术器械：手术刀＃11刀片，小型标准解剖剪刀，弹簧剪刀，弯钳，两个海德曼铲刀和勺子。

补充材料：铡刀，焊，McIlwain组织斩波器，用刀片，滤纸，玻璃巴斯德吸管与橡胶奶头，2个塑料巴斯德移液管，用广口，陪替氏培养皿中，一个金属圆筒直径7毫米（ 图2A）。

在填充用冷的人工脑脊液（在步骤1中制备）的解剖盘，冷冻玻璃盖从染色菜，包在滤纸浸入。小心地取出气泡和氧化学联的通过一个水族馆起泡（ 图2A）。
1. 布局工具的使用顺序。添加3层滤纸斩波器板和在纸巾上一个新的刀片，清洗用蒸馏水和乙醚（ 图2B）。接触纸张时，刀片必须是水平的。剑锋调整的最大价值和速度最大值约三分之一到一半。
2. 用心检查，如果一切准备就绪（乐器，温度...），因为你没有足够的时间之后。
3. 请同学们用巴斯德吸管充满冷学联的喷解剖。
4. 麻醉鼠标斩首前与的戊巴比妥IP（100毫克/千克）。也可以用异氟烷麻醉。我们比较了这两种方法，要想获取独立非执行董事相同的结果。断头必须在麻醉下进行，但也可以用颈椎脱位。然而，颈椎脱位，需要一个非常好的做法，以避免动物的痛苦。
5. 解剖上焊下尽可能快冷学联连续淋浴。

4。脑去除

1. 按住枪口上，用食指和一只手的拇指头，做一个切口，解剖剪刀沿着中间的顶部开始的头铡切的边缘和运行头侧额骨。
2. 切透皮肤的每一侧的头部充分暴露颅骨板和删除头部上面的尾侧的肌肉的肌肉。
3. 解剖剪刀，切断颞肌，每侧沿颞板，然后切额叶板夹在中间，横向。然后，做一个小切口枕骨上，两者之间的排位阿泰。
4. 的每一侧，切枕部板上面的尾鳍基。
5. 切沿矢状缝与春风似剪刀。
6. 随着镊子，取出头骨半散布他们远离对方。
7. 用手术刀，切开后横向只是嗅球和小脑前然后投身提取的大脑解剖盘用冷学联。

5。海马解剖

1. 一旦大脑被浸泡在解剖盘，切断两半球互相用手术刀插在中间。
2. 海马解剖用铲刀进行视觉控制下，通过双目手术显微镜（X25， 图2A）。在一个半球，仔细涂抹结构看侧脑室。取出脑干和间脑。这是通过应用在一侧额叶皮质上的铲刀上的间脑另一边。小心不要触摸海马铲刀和不舒展期间组织切片。
3. 断绝穹窿，然后轻轻一推海马皮层（滚开），插入脑室锅铲。
4. 当海马提取，去除多余的皮层组织和剩余血管。

6。切割片

1. 随着广口塑料巴斯德吸管，勺子海马转移其的阿尔韦亚尔表面向上（凸侧）。
2. 一个标准的塑料巴斯德吸管取出多余的液体。
3. 提示勺子几乎垂直接触滤纸的菜刀（ 图2B）和落海马勺子，迅速 ​​接触滤纸，然后搬回勺子。
4. 定向海 ​​马切片横向到400微米的菜刀（ 见图2C取向海马相对于刀片的脓）。尽快行动。
5. 取出滤纸切片海马和它周围的金属圆柱体包裹，一点点蔓延切片。然后，片使用一个标准的塑料的巴斯德吸管和收集他们在培养皿中充满冷学联，学联喷雾剂。

7。孵化片接口

1. 选择一个标准的塑料巴斯德吸管片，并迅速将它们放置在录音室。片恢复解剖创伤直接在录音室，在28°C接口
2. 切片将最有可能下沉。降低流体水平达到限幅电平，然后抬起它，使它浮。
3. 将切片在正确的位置，同时降低的水平。切片总是以同样的方式，以方便定位的电极（2刺激和一个记录电极）在CA1区取向。
4. 时停止该流体是在接口。 A“弯月”媒体围绕切片表明有足够的媒体。净过滤器必须与媒体饱和，但不会完全被淹没。
5. 保持腔室与穿孔的盖子放置在滤纸覆盖。
6. 让切片休息至少1.5小时，在28°C。

8。突触反应的记录

1. 记录电极：玻璃毛细管拉到尖取得2-5MΩ电阻时充满了学联。一小片滤纸周围放置的电极的前端和骨蜡是适用于肢体以减少结露。刺激电极：铂 - 铱的的双极群集电极与12.5微米直径的FHC（美国）购买。有了适当的照顾，每个电极可使用至少30倍（ 图1B）。
2. CA1区辐射层中放置电极，电极排队（ 图3A）。降低电极成茂显微操作器中的切片的表面下75〜150微米。两个刺激电极置于刺激两种截然不同的束谢弗抵押品。当电极降低到切片，小心地放在滤纸各地关闭室。
3. 双相刺激（0.08毫秒脉冲持续时间每半波）进行恒定电压连接到SIU-V隔离单位与基层刺激。最大的反应是通过增加刺激强度从2 V最大12五场EPSPS一个WPI ISO-80放大器，放大1000倍，在10 Hz和10 kHz滤波检查。通过国家仪器A / D转换的信号，然后发送到PC。使用WinLTP程序（ www.winltp.com ）进行刺激，数据采集和分析。得到的最大振幅的40％的场兴奋性突触后的记录，可在输入把曲线。对于每一个切片，fEPSP的斜坡LTP诱导前30分钟对平均坡度超过归。
4. LTP是通过施加刺激（100赫兹）的一个单一的列车在测试强度的一个通路，而第二通路作为控制触发。

9。清洁的安装

1. 冲洗所有的电路，用3％的过氧化氢 ​​（H ₂ O _2）溶液至少10分钟，然后沥干。电路将被小心地用蒸馏水​​冲洗在任何实验开始前。其他实验室只用蒸馏水进行清洗，但我们注意到深色残余物的沉积，管道系统中，仅使用水时，H ₂ O ₂的使用不是绝对必需的。
2. 更换水水浴中下方的录音室。
3. 浴的刺激电极提示酒精5分钟。

此方法已被用来分析性能的持久的成年C57BL/6J小鼠（SAS JANVIER，法国^）14在急性海马脑片长时程增强诱导。令人惊讶的是，实验条件的改善已导致了一种新的方式寻找在LTP。我们发现，持久的突触强度的增加并不需要新的蛋白质合成。

在这里，我们将展示，诱导LTP取决于片上的生存能力和兴奋。当夹层的海马速度太慢或太有害，切片兴奋性增加，可观察到多突触反应LTP诱导后（ 图3B）。在这种情况下，LTP诱导更有效的增强作用，不能维持。

我们想强调的事实，即使在片显然是健康的，技术条件有很大的影响诱导LTP的持续时间由一个单一的火车的刺激。在以前的出版物中，我们的组，可以转化为一个长期持久的一个很短的，持久的LTP，通过修改的片¹⁵的恢复条件。多年来的日常实践中，我们观察到，在我们的技术中，连续的改善导致LTP的产生由一个单一的列车在标准条件下的持续时间逐步增加。事实上，在2005年作出的录音表现出短暂的LTP，3小时内（ 图3C，实心圆）基线。已修改的降低夹层程序的组织拉伸，能够得到一个LTP持续6小时^16（ 图3C，实心正方形）。最后，界面中的氧和温度控制的改进，结合电极的标准化已经导致一个LTP稳定超过8小时（ 图3C，空心圆）。三组之间的差异是显着的（一个瓦特AY单因素方差分析，F（2,20）= 49.5，P <0.001）。

此外，任何变形温度或氧化诱导的突触反应（ 图4）的增加或减少。控制这些参数被检查者总是使用两个刺激电极。谢弗抵押品束诱导LTP，而另一束作为内部控制突触强度稳定性。

图1。电生理的钻机和脑切片录音室。 （B）（A）灌注电路与自制重力灌注系统alimented蠕动泵，隔离刺激单位（每两个电极），手术显微镜和录音室。刺激和接口录音室记录电极。滤纸已从盖环配套的切片。（C）控制单元与刺激，示波器，A / D转换器，温度控制软件和WinLTP软件。

图2。用于海马切片的工具和材料。 （一）解剖的菜含有冷藏学联和手术显微镜。手术刀安装＃11刀片，小型标准解剖剪刀，弹簧剪刀，弯钳，两个海德曼铲刀，勺，2个塑料巴斯德移液器其中一个培养皿中，用一个宽口，金属气缸直径7毫米，环支持切片在录音室Mcllwain曾说组织菜刀（B）（C）绘图和照片Øf为左侧海马的位置进行切割。红色虚线所示的刀片的方向。规模光罩：1毫米。 点击这里查看大图 。

图3。海马脑片LTP的诱导。 （A）简图S1和S2相同的神经元群的两个独立的突触输入。在每个切片，两个刺激电极（S1和S2）落实到位。 S1通路诱导LTP，而S2通路的控制作为（B）从个别实验样品fEPSP的痕迹在一个完全健康的切片（左）和切片中的呈现出高的兴奋性水平（右）。他们记录只是BEF矿石LTP的诱导LTP（蓝色痕迹），一个小时后（红色的痕迹）。切片时不完全健康（右），突触的反应观察fEPSP的斜率降低。程增强（C）fEPSP的坡课程的时间比较LTP的诱导后由一个单一的火车高频刺激（100赫兹，1秒）录制于2005年，2010年和2011年在我们的实验室。录得2005年第一实验（实心圆，N = 11）。其后录音（维莱， 等2010）受益于改进的解剖过程（填充的方块中，n = 6）。出现目前的结果，随着电极的标准化（空心圆中，n = 6）的接口的氧合和温度控制的优化。 点击这里查看大图 。

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图4。 fEPSP的斜率的函数，温度和氧气流量的变化。 （一）增加氧流量水浴中下方的录音室，从0.15至0.25升/分钟（蓝色曲线）诱导fEPSP的斜率减少20％（粉红色曲线），（B）增加温度从28至29° C（绿色曲线）诱导fEPSP的斜率（粉红色曲线）增加50％以上。 点击这里查看大图 。

我们在我们的实验室已经开发相结合的方法开发和使用的其他实验室有一个大的专业知识在LTP录音^11,17的协议。此协议适合于成年小鼠海马，并可以用在任何年龄段的任何背景基因型的动物。它还允许在转基因小鼠的神经退行性疾病如阿尔茨海默病^18,19分析LTP。

利用大鼠海马脑片这个协议必须适应。例如，大多数的大鼠进行研究，使用温度为32°C，而不是28°C。马西斯等^[20]提出了另一种方法编制老化小鼠或大鼠海马脑片。

材料与方法

C57BL/6J小鼠从JANVIER SAS（法国），但相同的结果来得到的C57BL/6J小鼠，从查尔法国ES河。

海马迅速隔离，同时冷学联组织被淹没在减少细胞损伤。这将减少兴奋性毒性，但被称为诱导突触扩散^21,22可以掩盖进一步结构性突触可塑性。

然后，我们使用了一个组织vibratome的切片，而不是菜刀。特别适合组织斩波器的像小鼠海马组织切片小块。在纸巾上的斩波器，海马总是以同样的方式定向阿尔杰等人的步骤^，23。他们放置阿尔韦亚尔表面上的条纹，可见的斜照明，平行于刀片。这种方法提供了海马脑片的背侧部分从横向轴线（参见图2C）的角度为15°的切割。接着，条带被操纵以最小的直接接触。

外部参数的严格控制，以获得可重复的结果。双极集群刺激电极（FTC），而不是使用自制的电极，以提高可重复性感应，看到诱导LTP的幅度实际上取决于电极质量。

从爱丁堡大学¹¹ ETC系统保持一个常数，箱内温度均匀的整个实验的钻机和CARBOGEN消耗的稳定有流量计。接口电平控制视觉与双目手术显微镜的帮助下，用蠕动泵抽吸系统保持非常稳定。

结果

该协议所有OWS仍然依赖于外部条件，如温度和氧的一个非常稳定的LTP的诱导。之前我们已经证实，在这些条件下诱导的LTP是依赖于NMDA受体，α-CaMKII的自身磷酸化和PI3激酶的活化，这是经典的分子途径参与LTP ^14。相反，我们是无法重现的依赖性LTP维持阶段新的蛋白质合成。蛋白质合成抑制剂的能力，特别茴香霉素，防止L-LTP的晚期的发展，当他们被施加周围感应已经反复报道了^4,25。这导致了普遍持有的假设，长于约2-3小时，稳定突触可塑性的需要触发一个短暂的新的蛋白质的合成^26的的 LTP电感刺激。然而，最近的实验表明，事情更复杂的^{27 -}32。在我们的实验条件下诱导LTP的维持，即使在存在蛋白质合成抑制剂，表明新的蛋白质合成比其他机制可以参与对LTP的持久相。

然而， 在体外实验中总是会引发生理相关的问题，所观察到的现象。切片诱导代谢状态的组织³⁴活性依赖的突触可塑性³³和改建的形式参与蛋白质的磷酸化状态修改。蛋白质合成速率降低到10〜15％的所观察到的在体内 ³⁵的mRNA和蛋白之间的平衡受到干扰^36。出于所有这些原因，我们必须谨慎的解释结果。

定义LTP是一个迅速诱导长期持久（天，周）增强兴奋性突触，这可能在长期存储器中起着重要的作用。 LTP， 在体内 ，可以持续几个星期，类似突触强度的变化发生在学习过程中^37,38。此外，大部分的时间，当长期LTP防止突变，长期记忆受损^39。

比较麻烦的是短期记忆和持续时间短的长时程增强之间的平行。第一个问题是，每一个现象的持续时间是未知的。短期记忆已经研究的学习过程，而应该是短期的LTP持续不到5小时，1小时后1天。第二个问题是，无论是短期记忆（或短暂的LTP）仅仅是向前迈进了一步长期记忆（或长效LTP）或一个独立的实体，与不同的分子机制^40。第三，我们不知道，如果短期由弱低于造成持久的LTP的刺激，或者如果它是由同一刺激诱导LTP的诱导，但ppears只有当长效LTP机制失败。

长期持久的稳定的LTP本实验条件下可以被看作是一个短期的LTP相当于短期记忆持久10小时和24小时之间。在这种形式的突触可塑性，不需要的蛋白质的合成，这是高度还原的切片，并且可以由一个单一的列车刺激诱导LTP处理。这种长期持久的突触强度的增加可能是由于无脊椎重塑突触后膜AMPA受体的数量稳定增长。

根据这一假说，蛋白质合成所需要的脊柱扩大和结构上的修改导致长期记忆的持续数周的突触。在这种情况下，递减阶段LTP诱导后观察24小时。不幸的是，到现在为止，急性切片只能维持在约16小时活着。

这个假说可以测试通过TC1唐氏综合症小鼠模型。莫里斯等⁴¹表明，在这些小鼠中，短期LTP 在体内和短期记忆，长期突触可塑性和记忆功能受损而被保留。

在不同的实验室中进行的不同研究之间的差异可能是由于短暂的LTP由于酶活性的变化的持续时间，在切片的代谢状态，或在蛋白质的降解率为^42。蛋白质的合成，可以被看作是一个许可的资金补充过程，涉及已学习过程中所使用的酶，或其他构成电池元件^43的重新定位。

这些结果强调了实验条件对LTP稳定的重要性。一个稳定的LTP独立的可以帮助研究蛋白质合成的作用长效后traduc周志武修改突触蛋白和AMPA受体在突触后膜的受体，尽管营业额的数量稳定增长机制。

该视频演示了一个详细的协议，该协议应能有助于获得可重复的结果在不同的实验室。

没有利益冲突的声明。

我们感谢巴纳德Foucart的技术援助。这项工作是由比利时科学研究基金（FRS-FNRS）和伊丽莎白女王医学研究基金的支持。艾格尼丝维莱是研究员在比利时科学研究基金。