הכנה משופרת ושימור פרוסות עכבר היפוקמפוס להקלטה יציבה מאוד ושחזור של הגברה לטווח ארוך

מאמר זה מציג מתודולוגיה שלמה להכין ולשמור במבחנה פרוסות בהיפוקמפוס חריפות מעכברים בוגרים. פרוטוקול זה מאפשר הקלטה של ​​הגברה לטווח ארוך לטווח ארוך מאוד יציב (LTP) ליותר מ 8 שעות עם שיעור הצלחה של 95%.

הגברה לטווח ארוך (LTP) הוא סוג של פלסטיות הסינפטית מתאפיין בעלייה בכח הסינפטי והאמינה להיות מעורבים בקידוד זיכרון. LTP שהושרו באזור CA1 של פרוסות בהיפוקמפוס חריפות, נחקר בהרחבה. עם זאת את המנגנונים המולקולריים שבבסיס שלב התחזוקה של תופעה זו עדיין הם הבינו היטב. זה יכול להיות גם בגלל תנאי הניסוי השונים המשמשים במעבדות שונות. ואכן, שלב התחזוקה של-LTP הוא מאוד תלוי בפרמטרים חיצוניים כמו חמצון, טמפרטורה ולחות. זה גם תלוי בפרמטרים פנימיים, כמו נטייה של מטוס החיתוך וכדאיות פרוסה לאחר נתיחה.

אופטימיזציה של כל הפרמטרים הללו מאפשרת אינדוקציה של potentiation מאוד לשחזור ומאוד יציב לטווח ארוך. מתודולוגיה זו מציעה את האפשרות להמשיך לחקור את המנגנונים המולקולריים מעורבים בגידול היציבבחוזק סינפטי בפרוסות בהיפוקמפוס. זה גם מדגיש את החשיבות של תנאי ניסוי במבחנה בחקירה של תופעות neurophysiological.

כיום, יש הבנה מוגבלת של איך זכרונות מאוחסנים מורכבים ונזכרו ברמת המעגל העצבית. עם זאת, השערה מאחדת של זכרון אחסון זמינה ומקובל באופן כללי: זכרונות מאוחסנים כשינויים בעוצמת קשרים סינפטיים בין תאי עצב במערכת העצבים המרכזית. בכוחות עצמו, מחקר על פלסטיות הסינפטית יש נהנה במידה רבה משתי תגליות פריצת דרך. (1) בניסוי זרע, בליס ^ו1 Lomo, תוך שימוש בהרדמה הארנב בשלמותה, מצאו כי מסירה של תדר גבוה קצר (1 שניות, 100 הרץ) גירוי לנתיב perforant של ההיפוקמפוס שנגרמה לטווח ארוך (כמה שעות) להגדיל בקשרים סינפטיים בנושא. תופעה מרתקת זו נקראה "הגברה לטווח ארוך" או LTP על ידי דאגלס וגודארד בשנת 1975 ^2. (2) בהמשך, נמצא כי תופעה דומה יכולה להיות מופעלת בפרוסות מוח (0.4 מ"מ) באופן מלאכותי נשמר בחיים במבחנה . LTP הנחקר ביותר נצפה במבחנה על ידי מתן אחד או כמה tetani לחבילה של אקסונים (ביטחונות שפר כביכול) בעת הקלטת הפוטנציאל עורר בנוירונים פירמידליים של מה שמכונה אזור CA1 הסינפטי מעורר שדה שנוצר. המנגנונים של האינדוקציה LTP שהתגלו במידה רבה. בעיקרון, ^{2 +} Ca זרם דרך קולטני NMDA מפעיל אנזימים עם שתי תוצאות: זירחון של קולטני AMPA (אשר מגדיל את היעילות שלהם) ושילוב של קולטני AMPA נוסף בקרום postsynaptic ^3. לעומת זאת, את המנגנונים של שלב התחזוקה של-LTP הם ידועים ברובו, בעיקר משום שהוא בניסוי הרבה יותר קשה לשמור על נתח בריא במשך שעות רבות יותר מאשר ל30 עד 60 דקות.

הרבה מחקרים הוקדשו להבנת מנגנוני LTP ותאוריות מעניינות כבר הרחיב במהלך השנים ^4-11. אבל האו"םtil עכשיו, את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המדויק גידול היציב בחוזק סינפטי לא הובהרו. זה יכול להיות גם בגלל הקושי לשחזר תוצאות קודמות במעבדות שונות תוך שימוש בטכניקות שונות להכנה והתחזוקה של פרוסות בהיפוקמפוס. בנייר המתודולוגיה שלהם, Sajikumar et al. ^-12 הדגיש את החשיבות של תנאי ניסוי להכנת פרוסות בהיפוקמפוס חולדה וההקלטה של LTP היציב. בסרטון הזה אנו מציגים את כל שלבי אופטימיזציה שפותחו במעבדה שלנו במשך השנים כדי להיות מסוגל להקליט LTP יציב מאוד בפרוסות בהיפוקמפוס עכבר.

אופטימיזציה זו נעשתה מפרוטוקולים שפותחו ושימש בהצלחה על ידי מעבדות אחרות שלומדות מנגנוני LTP בעכברי ¹³ ו ¹¹ חולדות. זה מאפשר לחוקרים מנוסים כדי לגרום ולהקליט LTP טווח ארוך מאוד בעכברים בוגרים עם שיעור גבוה של הצלחה. עמ 'בסיס hysiological של LTP המושרה נבדק בקפידה והפגין ^14. בנייר מתודולוגיה זו, אנו מראים כי כל שינוי של תנאי ניסוי, כמו טמפרטורה או חמצון יכול להיות השפעה עמוקה על תחזוקת LTP בעוד הליך הנתיחה יכול לשנות רגישות עמוקה פרוסות. כמו כן, יש להדגיש כי השליטה המדויקת של כל הפרמטרים הללו דורשת הכשרה של מספר חודשים לתלמידים מתחילים.

נהלי כל החיה בוצעו על פי מכון הלאומי לתקנות בריאות לטיפול ושימוש בבעלי החיים במחקר ובהסכמה של ועדת האתיקה המקומית.

1. הכנת נוזל השדרה Cerebro-מלאכותי

אותה התקשורת משמשת לנתח, לחתוך וperfuse פרוסות (1 מ"ל / דקה) במהלך תקופת מנוחה ואת קלטות אלקטרו. מדיה זו מורכבת מ124 מ"מ NaCl, 4.4 מ"מ KCl, 26 מ"מ NaHCO _3, 1 מ"מ אא ₂ PO _4, 2.5 מ"מ CaCl _2, 1.3 מ"מ MgSO ₄ ו-D-גלוקוז 10 מ"מ.

1. לשקול את המרכיבים השונים ל2 ליטר של ACSF מלבד MgSO ₄ שהוא כבר בפתרון (ז 1). באמצעות פתרון סטנדרטי מאפשר להיות בטוח בריכוז של Mg ^{2 +} המדויק משום MgSO ₄ באבקה הוא hygroscopic מאוד. Ca ^{2 +:} Mg ^{2 +} יחס מאוד משפיע על אינדוקציה ותחזוקת LTP¹⁴ וכך הפרופורציות שלהם חייבות תמיד להיות מכובדות.
2. מכניס את כל המרכיבים מלבד CaCl ₂ בכוס סיים גליל ולהביא ל2 L עם מזוקק H ₂ O.
3. מערבבים במרץ. כשהכל נמס, להוסיף carbogen דרך bubbler אקווריום וצינור המחובר למכל (95% O _2, 5% CO _2). חכה כמה דקות ולהוסיף סידן כלוריד, כאשר ה-pH קבוע ב7.4 על ידי הפעולה של החיץ ביקרבונט.
4. שמור על 600 מ"ל בצלחת זכוכית מלבנית בקירור ולהתקרר עד 4 מעלות צלזיוס עם קרח סביב הצלחת. תקשורת זו תשמש לנתיחה היפוקמפוס.
5. סנן 1,400 מ"ל שנותר ולשמור בבקבוק Erlenmeyer.

2. הכנת מתקן אלקטרו וחדר הקלטת פרוסת המוח

מעגל זלוף בנוי מ -2 משאבות peristaltic, אחד שאיבת נוזל טרי מטנק מילואים ואת הנוזל המשמש השאיבה השנייה מלאהוא מקליט חדר לסל. נוזל טרי מתווסף למערכת זלוף תוצרת הבית שבו הוא מחומצן מחדש, וחיממה לפני שהגיע לחדר הקלטת הממשק על ידי כוח הכבידה (איור 1 א). חדר הקלטת הממשק תוכנן על ידי FST (כלים מדע פיין, וונקובר, קנדה, איור 1). פרוסות רקמה מונחות על מסנן נקי ארוג המצורף לטבעת גם להסרה ויכול להישמר בתנאי ממשק ברציפות על ידי התאמת הגובה של היניקה גם מחט. צינור פלסטיק תוצרת הבית וחסם בסופו של הדבר המחורר רוחבי (0.5 מ"מ) שלו הוא קבוע למחט השאיבה כדי להגביר את היציבות ברמה בתא. ראש ההקלטה הוא רכוב על אמבט מים המכיל אבן פיזור גז אשר מסייעת לשמור על סביבה לחה על ידי עובר דרך נמלי אוויר לח סטייה בראש ההקלטה (כדי להקטין את היווצרות טיפת מים). אמבט החום בינוני ונשלטים על ידי משתנה ברציפות ברמה של ה זרם DCמחוספס גומי סיליקון, מוטבע של גוף חימום באמבט המים. תרמיסטורים באמבט המים ובארות הקלטה לאפשר טמפרטורת החדר כדי להיות מוגדרות ומדויקת במעקב באתרים אלה.

מערכת החימום של החדר הושלמה על ידי מערכת חימום הגלובלית שליטה על הטמפרטורה של כל המתקן. התוכנה שפותחה על ידי חוקרים באוניברסיטת אדינבורו (www.etcsystem.com) מנטרת ומשווה את הטמפרטורה של האוויר מחומצן, פרוסת המוח, את האלקטרודות ואסדה נותרת מספקת סביבה יציבה להקלטות ארוכות טווח (איור 1 ג) . הטמפרטורה המשמשת לפרוסות בהיפוקמפוס עכבר היא 28 ° C.

1. יש לשטוף את כל מעגל זלוף עם מזוקק H ₂ O למשך התקופה מינימאלית של 20 דקות ולהתחיל את מערכות החימום.
2. התחל המבעבע carbogen במעגל. Carbogen מגיע בתוצרת בית הצינורות המרוססות דרך Fנרות ilter ובאמבט המים מתחת לתא ההקלטה. קצב הזרימה באמבט המים נשלט על ידי מד זרימה. אם קצב הזרימה הוא איטי מדי, רקמה יכולה להיות חוסר חמצן. לעומת זאת, אם קצב הזרימה גבוה מדי, הגז לא יכול להיות מספיק מחומם ולחות שמוביל לייבוש של הרקמות. גם קצב זרימת גז גבוה יכול להגדיל את הסיכוי של מים ריסוס מעל הרקמה מאמבט המים מתחת מוביל להלם האוסמוטי. זה ניתן למנוע על ידי הוספת פיסות של רשת ניילון (100 מיקרומטר) בנקודת היציאה מיציאות הסטייה.
3. מסננים את המעגל ולהתמלא בACSF המסונן.
4. שים את הטבעת אשר תתמוך פרוסה בתא המעצר. מסנן רשת ארוג עם פתחי רשת הנעים בין 500 עד 750 מיקרומטר הוא נמתח ומחובר לטבעת בדבק אפוקסי שרף בת שני חלקים. מסנן הרשת הארוג עשוי מפוליאמיד 87% וelastane 13% (15 דן תחתונים). הדבק חייב להיות מיושם בזהירות, כדי למנוע היווצרות של תבליטים על פני השטח של ריןגרם.
5. להסיר את כל בועות האוויר בזהירות מהמעגל.
6. התאם את הרמה של ACSF בחדר ההקלטה עם הבורג של מחט השאיבה. המהירות של משאבות peristaltic מותאמת למ"ל / דקה 1 לכניסת המשאבה ועד 5 מ"ל / דקה ליציאת המשאבה.

מערכת זלוף מושם על שולחן רטט עמיד נוקשה ומוקף בכלוב פאראדיי.

3. הכנת האזור לנתיחה

מכשירי ניתוח: אזמל עם להב # 11, מספריים קטנים רגילים לנתח, מספריים האביב, מלקחיים מעוקלים, שניים היידמן spatulae וכפית.

חומר משלים: גיליוטינה, underpad, מסוק רקמות McIlwain בסכין גילוח, נייר סינון, פיפטה פסטר זכוכית עם פטמת גומי, פלסטיק 2 פסטר pipettes שאחד מהם עם פה רחב, צלחת פטרי, צילינדר מתכתי של קוטר 7 מ"מ (איור 2 א).

בצלחת הניתוחים מלאות הקר ACSF (מוכן בשלב 1), לטבול את המכסה בקירור מזכוכית צלחת מכתים, עטופה בנייר סינון. להסיר בועות אוויר וחמצן ACSF זהירות דרך bubbler אקווריום (איור 2 א).
1. להניח את מכשירים כדי שימוש. הוסף שלוש שכבות של נייר סינון בצלחת מסוק הרקמות וסכין גילוח חדש לנקות עם מים מזוקקים ואתר (איור 2). סכין הגילוח חייב להיות אופקי, כאשר הוא נוגע בנייר. כוח הלהב מותאם למחצית מהערך מקסימאלי ומהירות כלשליש מערך מקסימאלי.
2. בתשומת לב לבדוק אם הכל מוכן (מכשירים, טמפרטורה ...), כי לא יהיה לך זמן אחר כך.
3. שאל מישהו לרסס את הנתיחה עם טפטפת פסטר מלא ACSF הקר.
4. להרדים את העכבר עם ה-IP נמבוטל (100 מ"ג / ק"ג) לפני עריפת הראש. יכולה לשמש גם הרדמה Halothane. יש לנו לעומת שתי שיטות וobtaלעצמה אותן תוצאות. עריפת הראש חייב להיות מבוצע בהרדמה, אבל יכול לשמש גם נקע בצוואר רחם. עם זאת נקע בצוואר רחם צריך תרגול טוב מאוד כדי להימנע מסבל של בעלי חיים.
5. לנתח בunderpad מהר ככל האפשר תחת מקלחת קרה ACSF מתמשכת.

4. הסרת המוח

1. בעוד מחזיק עדיין את הראש עם האצבע והאגודל של יד אחת על פרצופו, עושה חתך עם המספריים לנתח לאורך אמצע חלקו העליון של הראש מתחיל בקצה גיליוטינה לחתוך ולרוץ rostrally לעצם הקדמי .
2. חותך את שריר עורית בכל צד של הראש כדי לחשוף באופן מלא את לוחות הגולגולת ולהסיר את השרירים בצד הזנב של הראש.
3. עם המספריים לנתח, לחתוך את שריר temporalis בכל צד, יחד צלחת temporalis, ואז לחתוך את הצלחות הקדמיות באמצע, transversally. ואז, לעשות חתך קטן על העצם העורפי, בין שתיים plAtes.
4. לכל צד, לחתוך בבסיס הזנב של הצלחות העורפיות.
5. לחתוך לאורך תפר sagittal עם מספריים האביב.
6. עם מלקחיים, להסיר את החצאים גולגולת על ידי הפצה אותם אחד מהשני.
7. עם האזמל, לחתוך transversally רק לאחר הנורה חוש הריח וממש לפני המוח הקטן ואז לצלול לתוך מוח חילוץ צלחת הניתוחים עם ACSF הקר.

5. Dissection היפוקמפוס

1. ברגע שמוח immerged בצלחת הניתוחים, לנתק את שתי ההמיספרות אחד מהשני עם אזמל הוכנס באמצע.
2. הנתיחה של ההיפוקמפוס מתבצעת עם spatulae תחת שליטה חזותית במיקרוסקופ ניתוחי משקפת (X25, איור 2 א). בחצי כדור אחד, התפשט בזהירות את המבנים כדי לראות את החדר לרוחב. הסר את גזע המוח וdiencephalon. הדבר נעשה על ידי החלת spatulae בקליפת המוח הקדמית בצד אחד ועל diencephalon עלצד שני. תשמור על עצמך שלא לגעת בהיפוקמפוס עם spatulae ולא למתוח אותו במהלך חתך רקמה.
3. סבר fornix אז בעדינות לדחוף את ההיפוקמפוס מתוך הקליפה (להתגלגל משם), על ידי החדרת מרית בחדר.
4. כאשר ההיפוקמפוס מופק, להסיר רקמות עודפת קליפת המוח וכלי דם שנותרו.

6. חיתוך של הפרוסות

1. עם פה רחב פיפטה פסטר פלסטיק, להעביר את ההיפוקמפוס בכפית עם המשטח כלפי מעלה Alvear שלה (צד קמור).
2. הסר את הנוזלים עודפים עם פלסטיק סטנדרטי פיפטה פסטר.
3. עצה עד הכף אנכית כמעט נוגעת בנייר הסינון של המסוק (איור 2) ושחרר את ההיפוקמפוס מהכפית, במהירות על ידי נגיעה בנייר הסינון ולאחר מכן לעבור בחזרה את הכף.
4. להתמצא בהיפוקמפוס ופורסים אותו לtransversally 400 מיקרומטר עם המסוק (ראה איור 2 ג לכיוון של hippocamמוגלה ביחס לסכין הגילוח). לפעול במהירות אפשרית.
5. הסר את נייר הסינון עם ההיפוקמפוס הפרוס ולעטוף אותו סביב גליל המתכת קטן כדי להפיץ את הפרוסות. ואז, ללא תשלום את הפרוסות עם תרסיסים של ACSF באמצעות פלסטיק סטנדרטי פיפטה פסטר ולאסוף אותם בצלחת פטרי מלאה ACSF הקר.

7. דגירה של פרוסות בממשק

1. בחר פרוסות עם פלסטיק סטנדרטי פיפטה פסטר ולמקם אותם במהירות בתא ההקלטה. פרוסות להתאושש מטראומת הנתיחה ישירות בחדר ההקלטה, בממשק ב28 ° C.
2. פרוסה תהיה ככל הנראה כיור. להוריד את רמת הנוזל כדי להגיע לרמת פרוסה, ולאחר מכן להעלות אותו כדי להפוך אותו לצוף.
3. הפעל את הפרוסה בתנוחה הנכונה תוך הפחתת הרמה. פרוסות הן תמיד חוקיים באותה הדרך כדי להקל על המיצוב של אלקטרודות (2 מגרה ואחד אלקטרודות הקלטה) באזור CA1.
4. עצור כאשרהנוזל הוא בממשק. "מניסקוס" של תקשורת סביב הפרוסה מעיד על רמה מספקת של אמצעי תקשורת. המסנן הנקי חייב להיות רווי בתקשורת, אבל לא שקוע לחלוטין.
5. שמור על החדר מכוסה בניירות לסנן להציב מעל המכסה המחורר.
6. תן מנוחה לפרוסה לפחות 1.5 שעות ב28 ° C.

8. הקלטה של ​​תגובות הסינפטי

1. האלקטרודה הקלטה: זכוכית נימים הם משכו להשיג התנגדות קצה 2-5 MΩ כאשר התמלא ACSF. חתיכה קטנה של נייר סינון ממוקמת סביב הקצה של האלקטרודה ושעוות עצם מיושמת בגפיים להפחית עיבוי. אלקטרודות גירוי: אלקטרודות מצרר דו קוטבי פלטינה אירידיום בקוטר 12.5 מיקרומטר נרכשות מFHC (ארה"ב). עם טיפול נכון, ניתן להשתמש בכל אלקטרודה לפחות 30 פעמים (איור 1).
2. מקם את האלקטרודות בradiatum השכבה של אזור CA1, כל אלקטרודות מצופותעד (איור 3 א). האלקטרודות הורידו 75-150 מיקרומטר מתחת לפני השטח של פרוסה עם micromanipulators Narishige. שתי אלקטרודות גירוי ממוקמות לעורר שתי חבילות שונות של בטוחות שפר. כאשר האלקטרודות הורידו על גבי פרוסה, ניירות סינון מונחים בזהירות בכל רחבי כדי לסגור את החדר.
3. גירוי biphasic (דופק משך 0.08 אלפיות שני לכל חצי גל) מבוצע במתח מתמיד עם ממריץ גראס מחובר ליחידות בידוד סיו-V. תגובה מקסימלי נבדקת על ידי הגדלת עוצמת גירוי מ 2 V למקסימום EPSPs 12 V. השדה הוא מוגבר 1,000 פעמים עם מגבר WPI ISO-80 ומסוננת ב10 הרץ ו10 קילוהרץ. האות לאחר מכן נשלחת למחשב דרך ממיר D / כלי לאומי. גירוי, רכישה וניתוח הנתונים בוצעו באמצעות תכנית WinLTP (www.winltp.com). EPSPs השדה נרשם ב 40% ממשרעת המרבית מתקבלת בקלט מתוךלשים את העקומה. לכל פרוסה, מדרונות fEPSP מתנרמלים נגד השיפוע הממוצע מעל 30 דקות שקדמו אינדוקציה LTP.
4. LTP מופעל על ידי יישום רכבת אחת של גירוי (100 הרץ) בכוח מבחן על מסלול אחד ואילו המסלול השני משמש כביקורת.

9. ניקוי של ההגדרה

1. יש לשטוף את כל המעגל עם פתרון 3% מי חמצן (H ₂ O ₂₎ לפחות 10 דקות, ולאחר מכן ניקוז. המעגל יעבור שטיפה עם מים מזוקקים בזהירות לפני תחילת כל ניסוי. השימוש של H ₂ O ₂ אינו ממש נדרש כמעבדות אחרות להשתמש רק במים מזוקקים לניקוי, אבל יש לנו לב בתצהיר של שאריות כהות במערכת צינורות בעת שימוש במים בלבד.
2. להחליף את המים באמבט המים מתחת לתא ההקלטה.
3. אמבט את הטיפים מגרה אלקטרודות באלכוהול במשך 5 דקות.

מתודולוגיה זו נעשתה שימוש כדי לנתח את המאפיינים של הגברה לטווח ארוך לטווח ארוך הנגרם בפרוסות בהיפוקמפוס חריפות מעכברים בוגרים (C57BL/6J Janvier SAS, צרפת) ^14. באופן מפתיע, שיפור של תנאי הניסוי הוביל לדרך חדשה להסתכל על LTP. אנחנו הראיתי כי עלייה ארוכת טווח בחוזק סינפטי לא דורשת סינתזה של חלבונים חדשים.

כאן, אנו מראים כי האינדוקציה LTP תלויה בכדאיות ורגישות פרוסות. גדלה כאשר הנתיחה של ההיפוקמפוס הייתה איטית מדי או מזיקה מדי, התרגשות פרוסות ותגובות polysynaptic יכולים להיבחן לאחר גיוס LTP (איור 3). במקרה זה, האינדוקציה LTP הייתה הרבה פחות יעיל וpotentiation לא נשמר.

ברצוננו להדגיש את העובדה שגם בפרוסות יש תנאים בריאים לכאורה, טכניים השפעה רבה על משך הזמן של LTP הנגרמת על ידי אחתרכבת של גירוי. בפרסומים קודמים, הקבוצה שלנו הראתה כי LTP קצר טווח ניתן להפוך אחד לטווח ארוך על ידי שינוי תנאי ההתאוששות של הפרוסה ^15. במהלך שנים של תרגול יומי, אנו ציינו כי שיפורים רצופים בטכניקה שלנו הובילו לעלייה הדרגתית במשך LTP הנגרם על ידי רכבת יחידה בתנאים סטנדרטיים. ואכן, הקלטות שנעשו בשנת 2005 הראו LTP קצר טווח חוזר לנקודת התחלה במרחק של 3 שעות (איור 3 ג, עיגולים מלאים). שינויים בהליך נתיחת הפחתת רקמת מתיחה הפכו אותו ניתן להשיג LTP נגרם ל6 שעות ¹⁶ (איור 3 ג, ריבועים מלאים). ולבסוף, שיפורים בממשק החמצון ובקרת הטמפרטורה, בשילוב עם סטנדרטיזציה האלקטרודה הובילו לLTP יציב במשך יותר מ 8 שעות (איור 3 ג, עיגולים פתוחים). ההבדל בין שלוש הקבוצות הוא משמעותי (אחד wאיי ANOVA, F (2,20) = 49,5, P <0.001).

יתר על כן, כל שינוי של טמפרטורה או חמצון הנגרם עלייה או ירידה של תגובת סינפטי (איור 4). השליטה על הפרמטרים אלה נבדק על ידי השימוש בשתי אלקטרודות תמיד מגרה. LTP היה מושרה בצרור אחד ביטחונות שפר ואילו צרור נוסף שימש כבקרה פנימית של יציבות חוזק סינפטי.

איור 1. אסדת אלקטרו וחדר הקלטת פרוסת מוח. (ב) תא הקלטת ממשק () מעגל זלוף עם מערכת זלוף הכבידה תוצרת בית alimented ידי משאבת peristaltic, יחידות גירוי בודדות (שתיים לאלקטרודה), מיקרוסקופ הניתוחי וחדר הקלטה. עם הגירוי ואלקטרודות הקלטה. ניירות סינון הוסרו מהמכסה לראות את הטבעת התומכת את הפרוסה. (ג) יחידת בקרה עם 2 גירוי, אוסצילוסקופ, ממיר D /, תוכנת בקרת טמפרטורה ותוכנות WinLTP.

איור 2. כלים וחומרים המשמשים ליפוקמפוס חיתוך. () צלחת לנתיחה המכילה ACSF הקירור ומיקרוסקופ כירורגי. אזמל רכוב עם להב # 11, מספריים קטנים רגילים לנתח, מספריים האביב, מלקחיים מעוקלים, שתיים היידמן spatulae, כף, 2 הפלסטיק פסטר pipettes שאחד מהם עם פה רחב, צלחת פטרי, גליל מתכתי בקוטר של 7 מ"מ וטבעת התומך את הפרוסה בתא ההקלטה. (ב ') מסוק רקמות McIlwain. (ג) ציור והצילום OF ההיפוקמפוס השמאלי בעמדה לחיתוך. הכיוון של סכין הגילוח מצויינים על ידי הקו המקווקו האדום. סולם של reticle:. מ"מ 1 לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. אינדוקציה של LTP בפרוסות בהיפוקמפוס. () סקיצה מראה שתי הכניסות סינפטיים העצמאיות S1 ו S2 לאותה האוכלוסייה עצבית. בכל פרוסה, שתי אלקטרודות גירוי (S1 ו S2) היו לשים במקום. מסלול S1 היה בשימוש כדי לגרום LTP, ואילו מסלול S2 שימש כבקרה. (ב) עקבות fEPSP לדוגמה מניסויים בודדים בפרוסה בריאה לחלוטין (משמאל) ובפרוסה מציגות רמה גבוהה של רגישות (מימין). הם נרשמו רק הנץ עפרות האינדוקציה LTP (עקבות אדומות) ושעה אחת אחרי גיוס LTP (עקבות כחולות). כשפרוסות אינן בריאה לחלוטין (מימין), תגובות polysynaptic הם נצפו וההגברה למדרון fEPSP מצטמצמת. (ג) השוואה בין הקורסים בזמן של מדרון fEPSP לאחר LTP הנגרם על ידי רכבת יחידה של גירוי בתדר גבוה (100 הרץ, 1 שניות) נרשם בשנת 2005, 2010 ו -2011 במעבדה שלנו. ניסויים ראשונים נרשמו בשנת 2005 (עיגולים מלאים, N = 11). הקלטות שלאחר מכן (Villers, et al. 2010) נהנו מהליך נתיחה משופר (ריבועים מלאים, n = 6). עולות מתוצאות הנוכחיות אופטימיזציה של חמצון ממשק ובקרת טמפרטורה יחד עם סטנדרטיזציה האלקטרודה (עיגולים פתוחים, n = 6). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

/ Files/ftp_upload/50483/50483fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50483/50483fig4.jpg "/>
איור 4. וריאציה של מדרון fEPSP כפונקציה של טמפרטורה וקצב זרימת חמצן. () קצב זרימת חמצן הגדלת באמבט מים מתחת לתא ההקלטה 0.15-0.25 ליטר / דקה (עקומה כחולה) גורם לירידה במדרון fEPSP של 20% (עקומה הוורודה). (ב ') על ידי העלאת הטמפרטורה 28-29 מעלות C (עקומה ירוקה) גורם ליותר מ -50% עלייה במדרון fEPSP (עקומה הוורודה). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

פיתחנו במעבדה שלנו וכתוצאה מפרוטוקול השילוב של שיטות שפותחו והופעל על ידי מעבדות אחרות בעלי מומחיות גדולה בLTP הקלטות ^11,17. פרוטוקול זה מותאם ליפוקמפוס עכבר המבוגר, וניתן להשתמש בבעלי חיים, בכל גיל ובכל גנוטיפ רקע. זה גם מאפשר ניתוח של LTP בעכברים מהונדסים לפתח מחלות ניווניות כמו אלצהיימר ^18,19.

ניצול של פרוטוקול זה לפרוסות בהיפוקמפוס חולדה יכול להצריך כמה עיבודים. לדוגמה, רוב המחקרים שבוצעו בחולדות להשתמש בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס, במקום 28 ° C. מאתיס et al. ^-20 הציע שיטה אחרת להכנת פרוסות בהיפוקמפוס מעכברים או חולדות מזדקנים.

חומר ושיטות

עכברי C57BL/6J מגיעים מJanvier SAS (צרפת), אך מתקבלים תוצאות זהות עם עכברי C57BL/6J מCharl es נהר צרפת.

ההיפוקמפוס הוא מבודד במהירות בזמן שהרקמה היא שקועה בACSF הקר כדי להפחית את נזק לתאים. זה מאפשר צמצום בהפעלת יתר רעיל אך ידוע לגרום סינפסה התפשטות ^21,22 אשר יכול להסוות עוד יותר פלסטיות הסינפטית מבנית.

לאחר מכן אנו משתמשים במסוק לחיתוך רקמות במקום vibratome. מסוק רקמות התאים במיוחד לחתך של חתיכות קטנות של רקמה, כמו ההיפוקמפוס עכבר. על מסוק הרקמות, ההיפוקמפוס הוא תמיד חוקיים באותה הדרך על פי הנוהל של אלגר ואח'. ^23. הם הניחו את הפסים על פני השטח Alvear, גלויות עם תאורה אלכסונית, במקביל לסכין הגילוח. שיטה זו מספקת פרוסות בהיפוקמפוס של חלק הגבי חתך עם זווית של 15 מעלות מהציר הרוחבי (ראה איור 2 ג). כתוצאה מכך, פרוסות הן מניפולציה עם מינימום של מגע ישיר.

פרמטרים חיצוניים נשלטים בקפידה כדי להשיג תוצאות לשחזור. אלקטרודות גירוי מצרר דו קוטבית (FTC) משמשות במקום אלקטרודות תוצרת בית על מנת להגדיל את שחזור באינדוקציה, רואה כי המשרעת של האינדוקציה LTP באמת תלויה באיכות האלקטרודות.

המערכת וכו 'מאוניברסיטת אדינבורו ¹¹ שומרת על טמפרטורה קבועה ואחידה בתוך כל המתקן הניסיוני וצריכת carbogen הוא התייצב עם מד זרימה. רמת ממשק נשלטת חזותי בעזרת מיקרוסקופ ניתוחי משקפת ונשמרה מאוד יציב עם מערכת שאיפת משאבת peristaltic.

תוצאות

פרוטוקול זה כלows האינדוקציה של LTP יציב מאוד אשר נשאר תלוי בתנאים חיצוניים כמו טמפרטורה וחמצון. אנחנו הוכחנו בעבר כי LTP המושרה בתנאים אלה היה תלוי בקולטניים NMDA, autophosphorylation α-CaMKII והפעלת PI3-kinase המהווים את המסלולים המולקולריים הקלסיים המעורבים בLTP ^14. לעומת זאת, לא הצליחו לשחזר את התלות של שלב התחזוקה של LTP בסינתזה של חלבונים חדשים. היכולת של מעכבי חלבון סינתזה, ושל anisomycin בפרט, כדי למנוע ההתפתחות של השלב המאוחר של L-LTP בעת שהם יושמו סביב האינדוקציה דווחה ^4,25 שוב ושוב. זה הוביל להשערה הרווחת כי ייצוב פלסטיות הסינפטית למשך זמן ארוך יותר מאשר על 2-3 שעות הנדרש על ידי מפעילה גירוי LTP-אינדוקטיבית של סינתזה של חלבונים חדשים חולפת ^26. עם זאת, ניסויים שנערך לאחרונה הראו כי דברים היו מורכבים יותר ^{27 -}32. LTP המושרה בתנאי הניסוי שלנו נשמר גם בנוכחות מעכבי סינתזת חלבון טוענים כי מנגנונים אחרים מאשר סינתזת חלבונים חדשה יכולים להיות מעורבים בשלב מתמשך של LTP.

עם זאת, בניסויי מבחנה תמיד מעלה את השאלה רלוונטיות הפיזיולוגי של התופעה הנצפית. חיתוך גורם לשינויים במדינת זירחון של חלבונים המעורבים בצורות פעילות תלויות בפלסטיות הסינפטית ³³ ושינוי במצב מטבולי של הרקמה ^34. שיעור סינתזת חלבון מצטמצם עד 10 ל -15% מזה שנצפה בvivo ³⁵ ואיזון בין ה-mRNA וחלבונים הוא מופרע ^36. מכל הסיבות האלה, אנחנו חייבים להיות זהירים בפרשנות של התוצאות.

על פי ההגדרה LTP הוא שיפור מושרה במהירות לטווח ארוך (ימים, שבועות) של הסינפסה מעוררת, שכנראהממלא תפקיד חשוב בזיכרון לטווח ארוך. LTP, in vivo, יכול להימשך מספר שבועות ושינויים דומים בחוזק הסינפטי להתרחש במהלך למידת ^37,38. בנוסף, רוב הזמן, כאשר LTP ארוך הטווח הוא למנוע על ידי מוטציות, זיכרון לטווח ארוך לירידת הערך ^39.

יותר בעייתי היא ההקבלה בין זיכרון לטווח קצר וpotentiation קצר טווח לטווח ארוך. הבעיה הראשונה היא שמשך הזמן של כל תופעה אינו ידוע. זיכרון לטווח קצר, נחקר בשעה 1 ליום 1 לאחר שנודע הליך ואילו LTP לטווח קצר אמור להימשך פחות מ -5 שעות. השאלה השנייה היא האם זיכרון לטווח קצר (או LTP קצר טווח) הוא רק צעד אחד קדימה זיכרון לטווח ארוך (או LTP ארוך טווח) או ישות נפרדת עם מנגנונים מולקולריים שונים ^40. שלישית, אנחנו לא יודעים אם LTP לטווח קצר הוא מושרה על ידי גירוי חלש שנופל קצר של גרימת LTP ארוך טווח או אם היא נגרמת על ידי אותו הגירוי אבל ppears רק כאשר מנגנוני LTP ארוך טווח להיכשל.

יציבות לטווח ארוך של LTP בתנאי הניסוי שלנו יכולה להיתפס כשווה ערך LTP קצר טווח לזיכרון לטווח קצר שנמשך בין 10 שעות ו -24 שעות. בצורה זו של פלסטיות הסינפטית זה, סינתזה של חלבון, אשר צמצמה מאוד בפרוסות, אין צורך ויכול להיגרם על ידי LTP רכבת אחת של גירוי. עלייה ארוכת טווח זה בחוזק סינפטי יכולה להיות עקב גידול יציב במספר הקולטנים AMPA בממברנה הפוסט הסינפטי ללא שיפוץ השדרה.

על פי השערה זו, סינתזת חלבון יכולה להיות נחוצה להרחבת עמוד השדרה ושינויים מבניים של הסינפסות מובילה לכמה זיכרון שנמשכים שבועות ארוכי טווח. במקרה זה, בשלב decremental של LTP יכול רק לצפות 24 שעות אחרי גיוס. למרבה הצער, עד היום, יכולות להישמר פרוסות חריפות רק בחיים במהלך כ -16 שעות.

ss = "jove_content"> השערה זו יכולה להיבדק על ידי שימוש במודל עכבר TC1 של תסמונת דאון. Morice et al. ^-41 הראו כי, בעכברים אלו, LTP לטווח קצר בזכרון vivo וקצר טווח הם לקויים ואילו פלסטיות הסינפטית לטווח ארוך וזיכרון נשמרות.

פערים בין מחקרים שונים שבוצעו במעבדות שונות יכולים להיות בגלל משך LTP קצר טווח בשל שינוי בפעילות האנזימטית, במצב מטבולי של הפרוסות או בשיעור של ⁴² פירוק חלבונים. סינתזת חלבון שאפשר לראות כתהליך חידוש מתירנית מעורבים למקם מחדש של אנזימים שהיו בשימוש על ידי תהליך הלמידה, או מאלמנטים מכוננים סלולריים אחרים ^43.

תוצאות אלו מדגישות את החשיבות של תנאי ניסוי על יציבות LTP. עצמאי LTP יציב של סינתזת חלבון יכול לעזור כדי ללמוד את התפקיד של טווח ארוך הודעה traduc-שינויים תזונתיים של חלבונים סינפטיים והמנגנונים שבבסיס יציב של גידול במספר קולטני AMPA בממברנה פוסט סינפטי למרות מחזור הקולטנים.

וידאו זה מראה פרוטוקול מפורט אחד שאמור לעזור אני מקווה להשיג תוצאות לשחזור במעבדות שונות.

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מודים ברנרד Foucart לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הבלגית למחקר מדעי (FRS-FNRS) ועל ידי קרן מלכת אליזבט למחקר רפואי. אגנס Villers הוא עמית מחקר בקרן הבלגית למחקר מדעי.