Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung

Dieser Beitrag stellt eine komplette Methode für die Vorbereitung und die Erhaltung In vitro Akuten Schnitten des Hippocampus von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufnahme von sehr stabilen langlebigen Langzeit-Potenzierung (LTP) für mehr als 8 Stunden mit einer Erfolgsquote von 95%.

Langzeitpotenzierung (LTP) ist eine Art der synaptischen Plastizität durch eine Erhöhung der synaptischen Stärke aus und vermutlich in Gedächtniscodierung einbezogen werden. LTP ausgelöst in der CA1-Region des akuten Schnitten des Hippocampus ist eingehend untersucht worden. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Erhaltungsphase für dieses Phänomen sind noch weitgehend unverstanden. Dies könnte teilweise auf den verschiedenen experimentellen Bedingungen durch verschiedene Laboratorien. Tatsächlich ist der Erhaltungsphase der LTP stark von äußeren Parametern wie Sauerstoffversorgung, Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Es hängt auch von internen Parametern wie Orientierung der Schnittebene und Scheibe Lebensfähigkeit nach der Sektion.

Die Optimierung all dieser Parameter ermöglicht die Induktion einer sehr reproduzierbar und sehr stabile Langzeit-Potenzierung. Diese Methode bietet die Möglichkeit, weiter zu erforschen die molekularen Mechanismen in der stabilen Anstieg beteiligtder synaptischen Stärke in Hippocampus. Es unterstreicht auch die Bedeutung der experimentellen Bedingungen in in vitro Untersuchung der neurophysiologischen Phänomene.

Heutzutage gibt es nur begrenzte Verständnis davon, wie komplex Erinnerungen gespeichert und abgerufen am neuronalen Schaltkreis-Niveau. Allerdings ist eine einheitliche Hypothese von Speicher verfügbar und breit akzeptiert: Erinnerungen werden als Änderungen in der Stärke der synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen im zentralen Nervensystem gespeichert. Auf seiner eigenen, hat die Forschung auf die synaptische Plastizität im Wesentlichen aus zwei bahnbrechende Entdeckungen profitiert. (1) In ein bahnbrechendes Experiment, Bliss und Lomo ^1, mit dem intakten narkotisierten Kaninchen, festgestellt, dass die Lieferung von einer kurzen Hochfrequenz-(1 sec, 100 Hz) Stimulation des perforant Pfad des Hippocampus eine dauerhafte (mehrere verursacht Stunden) erhöhen in den zugehörigen synaptischen Verbindungen. Dieses faszinierende Phänomen wurde "Langzeit-Potenzierung" oder LTP von Douglas und Goddard als in 1975 ^2. (2) später, wurde festgestellt, dass ein ähnliches Phänomen in Gehirnscheiben ausgelöst werden konnte (0,4 mm) künstlich aufrechterhalten in vitro lebendig . Die am häufigsten untersuchten LTP wurde in vitro durch die Bereitstellung einer oder mehrerer tetani, um ein Bündel von Axonen (die sogenannten Schaffer-Kollateralen) bei der Aufnahme das resultierende Feld erregenden synaptischen Potential in den Pyramidenzellen der sogenannten CA1-Region hervorgerufen beobachtet. Die Mechanismen der LTP Induktion weitgehend aufgedeckt worden. Grundsätzlich aktiviert ein Ca ^{2 +-Einstrom} durch den NMDA-Rezeptoren Enzyme mit zwei Folgen: eine Phosphorylierung von AMPA-Rezeptoren (die steigert so deren Effizienz) und eine Aufnahme von zusätzlichen AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran ^3. Im Gegensatz dazu sind die Mechanismen der Erhaltungsphase der LTP weitgehend unbekannt, vor allem weil es experimentell sehr viel schwieriger, eine Scheibe gesund für viele Stunden als für 30 bis 60 min zu halten ist.

Viele Studien haben zum Verständnis der Mechanismen LTP und interessante Theorien gewidmet haben über die Jahre ^4-11 ausgearbeitet. Aber unbis jetzt, haben die genauen molekularen Mechanismen der stabilen Anstieg der synaptischen Stärke nicht geklärt. Dies kann zum Teil auf die Schwierigkeit mit vorherigen Messungen in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Techniken zur Herstellung reproduzieren und die Aufrechterhaltung des Hippocampus. In ihrer Methodik Papier betonte Sajikumar et al. ¹² die Bedeutung von experimentellen Bedingungen für die Herstellung von Ratte Hippocampus und der Aufnahme stabil LTP. In diesem Video stellen wir Ihnen alle Optimierungsschritte in unserem Labor im Laufe der Jahre entwickelt, um der Lage sein, eine sehr stabile LTP in Maus Hippocampus aufzeichnen.

Diese Optimierung wurde von Protokollen entwickelt und erfolgreich eingesetzt von anderen Laboratorien, die LTP-Mechanismen Studie an Mäusen und Ratten ^{13 11} vorgenommen. Es ermöglicht erfahrenen Forscher zu induzieren und aufzeichnen eine sehr lang anhaltende LTP in erwachsenen Mäusen mit einer hohen Erfolgsquote. Die physiological Grundlage der induzierten LTP wurde sorgfältig geprüft und nachgewiesen ^14. In dieser Methodik Papier zeigen wir, dass alle Änderungen der experimentellen Bedingungen, wie Temperatur oder Sauerstoffsättigung kann eine tief greifende Auswirkungen auf die LTP Wartung haben während der Dissektion Verfahren stark verändern können Scheiben Erregbarkeit. Es muss auch betont werden, dass die präzise Steuerung all dieser Parameter eine Ausbildung von mehreren Monaten für unerfahrene Studenten benötigt werden.

Alle tierischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Tieren in der Forschung und mit der Zustimmung der lokalen Ethikkommission durchgeführt.

1. Herstellung künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit

Die gleichen Medien verwendet wird, zu sezieren, geschnitten und perfundieren Scheiben (1 ml / min) während der Ruhezeit und der elektrophysiologischen Ableitungen. Diese Medien werden von 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 26 mM NaHCO _3, 1 mM NaH ₂ PO _4, 2,5 mM CaCl _2, 1,3 mM MgSO ₄ und 10 mM D-Glucose.

1. Wägen Sie die verschiedenen Komponenten für 2 L von ACSF außer MgSO _4, das bereits in Lösung (1 M). Mit einem Standard-Lösung ermöglicht es, sicher sein, die genaue Konzentration der Mg ^{2 +,} weil MgSO ₄ in Pulver ist stark hygroskopisch. Ca ^{2 +:} Mg ^{2 +-Verhältnis} stark beeinflusst LTP Induktion und Aufrechterhaltung¹⁴ und damit die Proportionen müssen immer beachtet werden.
2. Setzen Sie alle Komponenten außer CaCl ₂ in einem Glas Messzylinder und bringen bis 2 L mit destilliertem H ₂ O.
3. Kräftig rühren. Wenn alles gelöst ist, fügen carbogen durch ein Aquarium Bubbler und Schlauch an den Tank (95% O _2, 5% CO _2). Warten Sie ein paar Minuten, und fügen Calciumchlorid bei pH 7.4 wird durch die Wirkung von Bicarbonat-Puffer fixiert.
4. Halten Sie 600 ml in einem gekühlten rechteckigen Glasschale und abkühlen auf 4 ° C mit Eis rund um den Teller. Diese Medien werden für Hippocampus Präparation verwendet werden.
5. Filtern Sie die verbleibenden 1.400 ml und halten in einem Erlenmeyerkolben.

2. Vorbereitung der elektrophysiologischen Rig und das Gehirn Scheibe Recording Kammer

Die Perfusion Schaltung von 2 Schlauchpumpen, eine Pumpen frische Flüssigkeit aus einem Reservetank und das andere Pumpen verwendet Fluid von t gemachter Aufnahme Kammer zu einer bin. Frische Fluid einem hausgemachten Perfusion System, wo es wieder mit Sauerstoff erwärmt und vor dem Erreichen der Schnittstelle Aufnahme Kammer durch die Schwerkraft (Abbildung 1A) aufgenommen. Die Schnittstelle Aufnahme Kammer wurde von FST (Fine Science Tools, Vancouver, Kanada, 1B) ausgelegt. Gewebeschnitte Gewebeeinlagen Netzfilter an einem abnehmbaren Ring und kann auch kontinuierlich unter Bedingungen Schnittstelle werden durch Höhenverstellung der Saug-und Nadel gehalten wurde. Eine hausgemachte Kunststoffrohr an seinem Ende und perforierte seitlich (0,5 mm) blockiert wird dem Saugnadel auf Pegelfestigkeit in der Kammer zu erhöhen befestigt. Die Aufnahme Kopf über einem Wasserbad mit einer Gasdispersion Stein, pflegen eine feuchte Umgebung, indem feuchte Luft durch Ablenkung Häfen in der Schreibkopf (bis wasserspreitende verringern) hilft montiert. Bath und mittlere Temperatur werden durch kontinuierliches Variieren der Höhe des Gleichstroms th gesteuertgrobe Ein Silikonkautschuk eingebettet Heizelement im Wasserbad. Thermistoren im Wasserbad und die Aufnahme Brunnen ermöglichen Temperatur in der Kammer zu setzen und werden genau überwacht an diesen Stätten.

Die Heizung der Kammer wird durch ein globales Heizungsanlage Steuern der Temperatur der gesamten Anlage abgeschlossen. Die Software, die von Forschern an der University of Edinburgh (entwickelt www.etcsystem.com ) überwacht und gleicht die Temperatur der Luft Sauerstoff, das Gehirn Scheibe, die Elektroden und die restlichen rig eine stabile Umgebung für Langzeit-Aufzeichnungen (1C) . Die Temperatur für Maus Hippocampus verwendet ist 28 ° C.

1. Spülen Sie alle Perfusionskreislauf mit destilliertem H ₂ O für mindestens 20 min und starten Sie die Heizungsanlagen.
2. Starten Sie den carbogen sprudelnden in der Schaltung. Carbogen kommt in den hausgemachten Perfusion Rohre durch filter Kerzen und im Wasserbad unter der Aufnahme Kammer. Die Strömungsgeschwindigkeit im Wasserbad wird durch einen Durchflussmesser gesteuert wird. Ist der Durchfluss ist zu langsam, konnte Gewebe werden hypoxischen. Umgekehrt, wenn die Strömung zu hoch ist, kann das Gas nicht ausreichend erwärmt und befeuchtet, was zu Trocknen des Gewebes. Hohe Gasdurchflussrate könnte auch die Chance erhöhen, Wasser Sprühen über das Gewebe aus dem Wasserbad unten führt zu osmotischen Schock. Dies kann durch Hinzufügen von Bits feinmaschiges (100 um) am Ausgang der Auslenkung Anschlüsse verhindert werden.
3. Kreislauf entleeren und füllen Sie mit gefiltertem ACSF.
4. Setzen Sie den Ring, der die Scheibe in der Abstehkammer unterstützen wird. Ein gewebtes Netz Filter mit Maschenweite im Bereich von 500 bis 750 um gedehnt und an dem Ring mit zwei Teil-Harz-Komponenten-Kleber. Das gewebte Netz Filter besteht aus 87% Polyamid und 13% Elasthan (Höschen 15 den) gemacht. Kleber sorgfältig angewendet werden, um die Bildung von Reliefs an der Oberfläche des rin vermeideng.
5. Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen aus dem Kreislauf.
6. Stellen Sie den Pegel ACSF in der Aufnahme Kammer mit der Schraube des Saugnadel. Die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpen auf 1 ml / min für die Zulaufpumpe und 5 ml / min für die Ablaufpumpe eingestellt.

Der Perfusionsdruck wird auf einem starren rüttelfest Tisch gelegt und von einem Faraday-Käfig.

3. Vorbereitung der Präparation Gebiet

Chirurgische Instrumente: ein Skalpell mit einem # 11 Klinge, kleine Standard Präparierscheren, Feder Schere, gebogenen Pinzette, zwei Heidemann Spatel und ein Löffel.

Zusätzliches Material: eine Guillotine, eine Unterlage, eine McIlwain Gewebe Chopper mit einer Rasierklinge, Filterpapier, ein Glas Pasteurpipette mit einem Gummi-Sauger, Pipetten 2 Kunststoff-Pasteur von denen einer mit einem breiten Mund, eine Petrischale, einem metallischen Zylinder 7 mm Durchmesser (2A).

1. In dem Sezieren Schüssel mit kaltem ACSF (hergestellt in Schritt 1) ​​gefüllt, tauchen ein gekühltes Glas Deckel aus einer Färbung Gericht, in Filterpapier gewickelt. Entfernen Sie vorsichtig Luftblasen und Sauerstoff die ACSF durch ein Aquarium Bubbler (Abbildung 2A).
2. Legen Sie Instrumente in der Reihenfolge der Verwendung. In drei Lagen Filterpapier auf das Gewebe Chopper Platte und einer neuen Rasierklinge mit destilliertem Wasser und Ether (2B) gereinigt. Die Rasierklinge muss waagerecht sein, wenn sie das Papier berührt. Auflagedruck auf den halben Maximalwert und Geschwindigkeit auf etwa ein Drittel des maximalen Wert eingestellt.
3. Aufmerksam überprüfen, ob alles bereit ist (Instrumente, Temperatur ...), weil Sie nicht haben, Zeit danach.
4. Bitten Sie jemanden, der Dissektion mit einer Pasteurpipette mit kaltem ACSF gefüllt sprühen.
5. Anesthetize die Maus mit Nembutal IP (100 mg / kg) vor Enthauptung. Halothananästhesie können ebenfalls verwendet werden. Wir haben beide Methoden verglichen und obtainiert gleichen Ergebnisse. Enthauptung muss unter Vollnarkose durchgeführt werden, aber Genickbruch können ebenfalls verwendet werden. Allerdings Genickbruch braucht eine sehr gute Übung, um das Leiden der Tiere zu vermeiden.
6. Präparieren Sie auf der Unterlage so schnell wie möglich unter kaltem ACSF kontinuierlichen Dusche.

4. Gehirn Removal

1. Halten Sie immer noch den Kopf mit dem Zeigefinger und dem Daumen einer Hand auf die Schnauze, einen Einschnitt mit den Präparierscheren entlang der Mitte der Oberseite des Kopfes beginnend am Rand der Guillotine und läuft rostral zum Stirnbein .
2. Durchtrennen Hautmuskel auf jeder Seite des Kopfes vollständig aussetzen Schädel Platten und entfernen Sie die Muskeln an der kaudalen Seite des Kopfes.
3. Mit den Präparierscheren, schneiden Sie den M. temporalis auf jeder Seite, entlang der temporalis Platte, dann schneiden Sie die frontalen Platten in der Mitte, quer. Dann machen Sie einen kleinen Schnitt am Hinterhauptbein, zwischen den beiden plAtes.
4. Für jede Seite, am kaudalen Basis der okzipitalen Platten geschnitten.
5. Schneiden Sie entlang der Sagittalnaht mit Feder Schere.
6. Mit Pinzette, entfernen Sie die Schädel Hälften, indem sie diese voneinander entfernt.
7. Mit dem Skalpell geschnitten quer kurz nach dem Riechkolben und kurz bevor das Kleinhirn dann stürzen die extrahierte Gehirn in das Sezieren Schüssel mit kaltem ACSF.

5. Hippocampal Dissection

1. Sobald das Gehirn im Sezieren Gericht eingetaucht ist, trennen die beiden Hemisphären voneinander mit einem Skalpell in der Mitte eingesetzt.
2. Die Präparation des Hippocampus mit Spatulae unter Sichtkontrolle durch ein Fernglas Operationsmikroskop (X25, 2A) durchgeführt. Auf der einen Hemisphäre, sorgfältig verteilt, die Strukturen, um die lateralen Ventrikel zu sehen. Entfernen Sie den Hirnstamm und Zwischenhirn. Dies wird durch die Anwendung der Spatulae auf dem frontalen Kortex auf der einen Seite und auf der Zwischenhirn auf das getananderen Seite. Achten Sie darauf, nicht zu berühren den Hippocampus mit dem Spatel und nicht strecken sie während Gewebe Schnitte.
3. Trenne die Fornix dann vorsichtig den Hippocampus aus dem Kortex (wegrollen), indem Sie einen Spachtel in die Herzkammer.
4. Wenn der Hippocampus extrahiert wird, entfernen überschüssiges Gewebe und Kortex verbleibenden Blutgefäße.

6. Schneiden der Scheiben

1. Mit einem breiten Mund Kunststoff Pasteurpipette übertragen den Hippocampus in einem Löffel mit seinen alvear Oberfläche nach oben (konvexe Seite).
2. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Standard-Kunststoff-Pasteurpipette.
3. Tipp den Löffel senkrecht fast berühren das Filterpapier des Choppers (2B) und Drop-off den Hippocampus vom Löffel, durch schnelles Berühren des Filterpapier bewegen Sie dann wieder den Löffel.
4. Richten Sie den Hippocampus und schneiden Sie es quer bis 400 um mit dem Chopper (siehe Abbildung 2C für Ausrichtung des HippocampusEiter gegenüber der Rasierklinge). Gesetz so schnell wie möglich.
5. Entfernen Sie das Filterpapier mit den in Scheiben geschnittenen Hippocampus und wickeln Sie es um den Metallzylinder zu verbreiten die Scheiben ein wenig. Dann geben sie die Scheiben mit Sprays von ACSF mit einem Standard-Kunststoff-Pasteurpipette und sammeln sie in einer Petrischale mit kaltem ACSF gefüllt.

7. Inkubation von Slices im Interface

1. Wählen Scheiben mit einem Standard-Kunststoff-Pasteurpipette und schnell legen Sie sie in der Aufnahme Kammer. Scheiben von der Dissektion Trauma direkt in der Aufnahme Kammer erholen, in der Schnittstelle bei 28 ° C
2. Die Scheibe wird höchstwahrscheinlich Waschbecken. Senken Sie den Füllstand, die Slice-Level zu erreichen, und dann heben Sie es, um es zu schweben.
3. Drehen Sie die Scheibe in der richtigen Position, während das Absenken. Slices sind immer in der gleichen Weise, um die Positionierung der Elektroden (2 anregenden und eine Aufnahme-Elektroden) in der CA1-Region zu erleichtern orientiert.
4. Stoppen Sie, wenndie Flüssigkeit ist in-Schnittstelle. A "Meniskus" der Medien auf der Scheibe ist, das einen ausreichenden Grad von Medien. Die Netto-Filter muss mit Medien gesättigt, aber nicht vollständig untergetaucht.
5. Halten Sie die Kammer mit Filterpapier über den perforierten Deckel platziert abgedeckt.
6. Lassen Sie die Scheibe Rest für mindestens 1,5 h bei 28 ° C.

8. Aufnahme der synaptischen Antworten

1. Aufnahme-Elektrode: Glaskapillaren gezogen werden, um eine Spitze von 2-5 MOhm Widerstand zu erhalten, wenn sie mit ACSF gefüllt. Ein kleines Stück Filterpapier wird auf der Spitze der Elektrode angeordnet und Knochenwachs wird an dem Ende, um Kondensation zu verringern aufgebracht. Stimulierenden Elektroden: Platin-Iridium-Cluster bipolaren Elektroden mit einer 12,5 Mikrometer Durchmesser von FHC (USA) erworben. Mit der richtigen Pflege kann jede Elektrode mindestens 30 mal (Abbildung 1B) verwendet werden.
2. Positionieren Sie die Elektroden in das Stratum radiatum der CA1-Region, gesäumt alle Elektrodenbis (3A). Elektroden 75 bis 150 um unter der Oberfläche der Scheibe mit Narishige Mikromanipulatoren abgesenkt. Die beiden stimulierenden Elektroden gesetzt werden, um zwei unterschiedliche Bündel von Schaffer Kollateralen stimulieren. Wenn die Elektroden auf die Scheibe abgesenkt werden Filterpapier sorgfältig rundum, um die Kammer zu schließen platziert.
3. Zweiphasige Stimulation (0,08 ms Pulsdauer pro Halbwelle) wird bei konstanter Spannung mit einem Grass-Stimulator verbunden SIU-V Isolierung Einheiten durchgeführt. Maximal Reaktion durch Erhöhung Reizstärke von 2 V bis maximal 12 V Feld EPSPs 1000 mal mit einer WPI ISO-Verstärker 80 verstärkt und gefiltert bei 10 Hz und 10 kHz überprüft. Das Signal wird dann an einen PC durch ein National Instrument A / D-Wandler gesendet. Stimulation, Datenerfassung und Analyse werden unter Verwendung des WinLTP Programm ( www.winltp.com ). Feld EPSPs bei 40% der maximalen Amplitude erhalten in einem Eingangs-out aufgezeichnetKurve setzen. Für jede Scheibe, werden die fEPSP Pisten gegen die mittlere Steigung über die 30 min vor LTP Induktion normalisiert.
4. LTP durch Anlegen einer einzigen Folge von Stimulationsimpulsen (100 Hz) auf Prüfkraft auf einen Weg, während die zweite Bahn dient als Kontrolle ausgelöst.

9. Reinigung des Setup

1. Spülen all die Schaltung mit einer 3% igen Lösung von Wasserstoffperoxid (H ₂ O ₂₎ für mindestens 10 min, dann abtropfen. Die Schaltung wird sorgfältig mit destilliertem Wasser werden vor Beginn eines jeden Versuchs gespült. Die Verwendung von H ₂ O ₂ ist nicht zwingend erforderlich, da andere Labore nur destilliertes Wasser verwenden für die Reinigung, aber wir haben die Ablagerung von dunklen Rückstände im Schlauchsystem bemerkt, wenn nur mit Wasser.
2. Ersetzen Wasser im Wasserbad unter der Aufnahme Kammer.
3. Bath die stimulierenden Elektroden Tipps in Alkohol für 5 min.

Diese Methode wurde verwendet, um die Eigenschaften von langlebigen Langzeit-Potenzierung im Hippocampus von akuten Erwachsenen C57BL/6J-Mäusen (JANVIER SAS, Frankreich) ¹⁴ induziert analysieren. Überraschenderweise hat die Verbesserung der experimentellen Bedingungen zu einer neuen Sichtweise auf LTP geführt. Wir zeigten, dass lang anhaltende Erhöhung der synaptischen Stärke nicht verlangen, die Synthese neuer Proteine.

Hier zeigen wir, dass LTP Induktion auf Scheiben Lebensfähigkeit und Erregbarkeit abhängt. Wenn Dissektion des Hippocampus zu langsam oder zu schädlichen war, Erregbarkeit Scheiben erhöht und polysynaptischen Antworten konnte nach LTP Induktion beobachtet werden (Abbildung 3B). In diesem Fall war LTP Induktion weniger effektiv und Potenzierung wurde nicht beibehalten.

Wir möchten die Tatsache, dass auch in scheinbar gesunden Scheiben, technischen Bedingungen einen großen Einfluss haben auf die Dauer der LTP durch einen einzigen induziert betonenZug der Stimulation. In früheren Veröffentlichungen, zeigte unsere Gruppe, dass eine kurze anhaltende LTP in eine lang anhaltende kann man durch Modifikation der Erholung Bedingungen der Scheibe ¹⁵ umgewandelt werden. Über Jahre der täglichen Praxis beobachteten wir, dass aufeinander folgende Verbesserungen in unserer Technik haben zu einer fortschreitenden Zunahme der Dauer der LTP durch einen einzigen Zug in Standardbedingungen induziert geführt. Tatsächlich zeigte Aufnahmen im Jahr 2005 machte eine kurze anhaltende LTP geht zurück auf den Ausgangswert innerhalb von 3 h (3C, gefüllte Kreise). Änderungen in der Präparation Verfahren reduziert Gewebe Dehnung haben es möglich gemacht, eine LTP 6 h ¹⁶ (3C, gefüllte Quadrate) aufrecht zu erhalten. Schließlich wurden Verbesserungen in der Schnittstelle Oxygenierung und der Temperaturregler mit Meßkettenanpassung kombiniert, um eine stabile LTP für mehr als 8 Stunden (3C, offene Kreise) geführt. Der Unterschied zwischen den drei Gruppen signifikant ist (nur way ANOVA, F (2,20) = 49,5, P <0,001).

Darüber hinaus induziert jede Änderung der Temperatur oder der Sauerstoffversorgung eine Zunahme oder eine Abnahme der synaptischen Antwort (Abbildung 4). Die Steuerung dieser Parameter wurde immer mit zwei Stimulationselektroden überprüft. LTP wurde auf einem Bündel von Schaffer Kollateralen induziert, während ein anderes Bündel als interne Kontrolle der synaptischen Stärke Stabilität verwendet wurde.

Abbildung 1. Elektrophysiologische rig und Hirnschnitt Aufnahme Kammer. (A) Perfusionskreislauf mit hausgemachten Schwerkraft Perfusion System durch eine peristaltische Pumpe, isoliert Stimulation Einheiten (zwei pro Elektrode), Operationsmikroskop und Aufnahme Kammer alimented. (B) Schnittstelle Aufnahme Kammer mit anregenden undAufnahme Elektroden. Filterpapiere wurden aus dem Deckel entfernt worden, um den Ring Unterstützung der Scheibe zu sehen. (C) Steuereinheit mit 2 Stimulatoren Oszilloskop, A / D-Wandler, Temperaturregelung Software und WinLTP Software.

Abbildung 2. Werkzeuge und Material für Hippocampus Schneiden verwendet. (A) Dissection Schale mit gekühlten ACSF und Operationsmikroskop. Skalpell montiert mit einem # 11 Klinge, kleine Standard Präparierscheren, Feder Schere, gebogenen Pinzette, zwei Heidemann Spatel, Löffel, Pipetten 2 Kunststoff-Pasteur von denen einer mit einem breiten Mund, Petrischale, metallischen Zylinder von 7 mm Durchmesser und Ring, unterstützt die Scheibe in der Aufnahme Kammer. (B) McIlwain Gewebe Chopper. (C) Zeichnung und Fotografie of die linke Hippocampus in Position zum Schneiden. Die Orientierung der Rasierklinge wird durch die rote gestrichelte Linie angedeutet. Maßstab des Fadenkreuzes:. 1 mm Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 3. Induktion von LTP in hippocampalen Schnitten. (A) Skizzieren Sie mit den beiden unabhängigen synaptischen Eingänge S1 und S2 auf den gleichen neuronalen Population. In jeder Scheibe wurden zwei stimulierenden Elektroden (S1 und S2) in Kraft gesetzt. S1 Weg wurde verwendet, um LTP induzieren, während S2 Weg diente als Kontrolle. (B) Probe fEPSP Spuren von einzelnen Versuche in einem vollkommen gesunden Scheibe (links) und in einer Scheibe eine hohe Erregbarkeit (rechts) präsentiert. Sie wurden aufgezeichnet nur bef Erz die LTP Induktion (rot Spuren) und eine Stunde nach Induktion von LTP (blau Spuren). Wenn Scheiben sind nicht vollkommen gesund (rechts), sind polysynaptischen Reaktionen beobachtet und fEPSP Hang Potenzierung reduziert wird. (C) Vergleich der zeitlichen Verläufe der fEPSP Steigung nach LTP durch einen einzigen Zug von Hochfrequenz-Stimulation (100 Hz, 1 induziert sec) aufgenommen im Jahr 2005, 2010 und 2011 in unserem Labor. Erste Versuche wurden 2005 aufgezeichnet (gefüllte Kreise, n = 11). Spätere Aufnahmen (Villers, et al. 2010) profitiert von einem verbesserten Verfahren Dissektion (gefüllte Quadrate, n = 6). Aktuelle Ergebnisse ergeben sich aus der Optimierung Schnittstelle Sauerstoffversorgung und Temperaturregelung zusammen mit Elektrode Standardisierung (offene Kreise, n = 6). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

/ Files/ftp_upload/50483/50483fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50483/50483fig4.jpg "/>
Abbildung 4. Variation von fEPSP Steigung als Funktion von Temperatur und Sauerstoff-Fluss. (A) Erhöhung der Sauerstoff-Fluss im Wasserbad unter der Aufnahme Kammer von 0,15 bis 0,25 l / min (blaue Kurve) induziert eine Abnahme in fEPSP Gefälle von 20% (rosa Kurve). (B) Erhöhung der Temperatur von 28 bis 29 ° C (grüne Kurve) induziert eine mehr als 50% Anstieg in fEPSP Steigung (rosa Kurve). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Wir haben in unserem Labor ein Protokoll aus der Kombination von Methoden entwickelt und eingesetzt von anderen Laboratorien mit einem großen Know-how in LTP Aufnahmen ^11,17 entwickelt. Dieses Protokoll wird zur adulten Maus Hippocampus angepasst und kann bei Tieren jeden Alters und jeder Genotyp Hintergrund verwendet werden. Es ermöglicht auch die Analyse von LTP in transgenen Mäusen Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit ^18,19.

Die Verwendung dieses Protokoll für die Ratte Hippocampus erforderlich machen könnten einige Anpassungen. Zum Beispiel verwenden die meisten Studien in Ratten eine Temperatur von 32 ° C statt 28 ° C Mathis et al. Vorgeschlagen ²⁰ ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Hippocampus-Schnitten von Alterung Mäusen oder Ratten.

Material und Methoden

C57BL/6J-Mäusen von JANVIER SAS (Frankreich), aber dieselben Ergebnisse kommen mit C57BL/6J-Mäusen von Charl erhalten es Fluss Frankreichs.

Der Hippocampus ist schnell isoliert, während das Gewebe in kaltem ACSF eingetaucht ist, um Zellschäden zu reduzieren. Dies ermöglicht eine Verringerung der Excitotoxizität ist aber bekannt, Synapse Proliferation ^21,22 die weiteren strukturellen synaptische Plastizität maskieren induzieren.

Dann benutzen wir ein Gewebe Chopper zum Schneiden statt Vibratom. Ein Gewebe Chopper eignet sich besonders gut zum Schneiden von kleinen Stücken von Gewebe wie Maus Hippocampus angepasst. Auf dem Gewebe Chopper ist der Hippocampus immer orientiert in der gleichen Weise nach dem Verfahren von Alger et al. ^23. Sie stellten die Rillen auf der Oberfläche alvear, sichtbar mit schrägen Beleuchtung, parallel zu der Rasierklinge. Diese Methode bietet Hippocampus des dorsalen Teil Schnitt mit einem Winkel von 15 ° von der Querachse (siehe 2C). Anschließend werden Scheiben mit einem Minimum von direktem Kontakt manipuliert.

Externe Parameter werden sorgfältig kontrolliert, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Bipolar Cluster stimulierenden Elektroden (FTC) anstelle von hausgemachten Elektroden, um die Reproduzierbarkeit der Induktion zu erhöhen, zu sehen, dass die Amplitude der LTP Induktion hängt wirklich von der Qualität Elektroden verwendet.

ETC-System von der University of Edinburgh ¹¹ sorgt für eine konstante und gleichmäßige Temperatur im gesamten Versuchsanlage und carbogen Verbrauch ist mit einem Durchflussmesser stabilisiert. Trennschicht wird visuell mit Hilfe eines binokularen Operationsmikroskop gesteuert und gehalten wird sehr stabil mit einer peristaltischen Pumpe Absaugsystem.

Ergebnisse

Dieses Protokoll alleverdankt die Induktion einer LTP sehr stabil, die abhängig von den äußeren Bedingungen wie Temperatur und Sauerstoffzufuhr bleibt. Wir haben bereits gezeigt, dass die LTP in diesen Bedingungen induziert abhängig von NMDA-Rezeptoren, α-CaMKII Autophosphorylierung und PI3-Kinase-Aktivierung, die die klassischen molekularen Signalwege in LTP ¹⁴ beteiligt sind, war. Im Gegensatz dazu waren wir nicht in der Lage, um die Abhängigkeit von der Erhaltungsphase der LTP auf neue Proteinsynthese reproduzieren. Die Fähigkeit der Protein-Synthese-Inhibitoren und von Anisomycin insbesondere die Entwicklung der späten Phase der L-LTP verhindern, wenn sie um die Induktion angewendet wurde wiederholt wurden ^4,25 berichtet. Dies hat zu der allgemein gehaltenen Annahme geführt, dass die Stabilisierung der synaptischen Plastizität für mehr als etwa 2-3 Stunden erforderte die Triggerung durch das LTP-induktiver Anregung mit durchlaufendem Synthese neuer Proteine ^​​26. Allerdings haben die jüngsten Experimente vorgeschlagen, dass die Dinge komplizierter waren ^{27 -}32. LTP in unseren experimentellen Bedingungen induziert wurde auch in Gegenwart von Proteinsyntheseinhibitoren darauf hindeutet, dass andere Mechanismen als neue Proteinsynthese in der anhaltende Phase der LTP beteiligt sein könnte, erhalten.

Dennoch in vitro Experimente immer stellt sich die Frage nach der physiologischen Relevanz des beobachteten Phänomens. Slicing induziert Änderungen in der Phosphorylierung von Proteinen in leistungsabhängige Formen der synaptischen Plastizität ³³ und Veränderung der metabolischen Zustand des Gewebes ³⁴ beteiligt. Die Geschwindigkeit der Proteinsynthese auf 10 bis 15%, dass in vivo ³⁵ beobachtet und das Gleichgewicht zwischen mRNA und Proteinen gestört ³⁶ reduziert. Aus all diesen Gründen müssen wir vorsichtig sein bei der Interpretation der Ergebnisse.

Per Definition ist ein schnell LTP induziert langlebig (Tage, Wochen) Erweiterung einer erregenden Synapse, die wahrscheinlichspielt eine wichtige Rolle in das Langzeitgedächtnis. LTP, in vivo, kann für mehrere Wochen und ähnliche Veränderungen der synaptischen Stärke dauern auftreten während des Lernens ^37,38. Zudem sind die meisten der Zeit, wenn langfristige LTP durch Mutationen verhindert wird, Langzeitgedächtnis ³⁹ beeinträchtigt.

Problematischer ist die Parallele zwischen Kurzzeitgedächtnis und kurz anhaltende Langzeit-Potenzierung. Das erste Problem ist, dass die Dauer eines jeden Phänomens unbekannt ist. Kurzzeitgedächtnis wurde 1 h zu 1 Tag studierte nach Lernvorgang während kurzfristige LTP soll weniger als 5 Stunden dauern. Die zweite Frage ist, ob das Kurzzeitgedächtnis (oder kurz dauernden LTP) lediglich ein Schritt nach vorn Langzeitgedächtnis (oder langanhaltende LTP) oder eine separate Einheit mit unterschiedlichen molekularen Mechanismen ^40. Drittens wissen wir nicht, ob kurzfristige LTP durch einen schwachen Reiz, der kurz verursachen langanhaltende LTP fällt oder wenn es durch den gleichen Reiz induziert induziert wird, sondern einppears nur, wenn Mechanismen langanhaltende LTP scheitern.

Die lang anhaltende Stabilität der LTP unter unseren experimentellen Bedingungen könnte als eine kurzfristige LTP entspricht Kurzzeitgedächtnis Dauer zwischen 10 Stunden und 24 Stunden angesehen werden. Bei dieser Form der synaptischen Plastizität, wird die Proteinsynthese, die hoch in Scheiben verringert wird, nicht erforderlich und LTP durch eine einzige Bahn der Stimulation induziert werden. Diese lang anhaltende Erhöhung der synaptischen Stärke könnte aufgrund einer stabilen Zunahme der Zahl von AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran ohne Wirbelsäule Umbau.

Nach dieser Hypothese könnte Proteinsynthese für Wirbelsäule Erweiterung und bauliche Veränderungen der Synapsen führt zu Langzeitgedächtnis mehrwöchigen benötigt werden. In diesem Fall könnte die dekrementelle Phase der LTP nur 24 Stunden nach der Induktion beobachtet werden. Leider bis jetzt, können akute Scheiben nur am Leben gehalten während etwa 16 Stunden werden.

Diese Hypothese kann mit Tc1 Mausmodell des Down-Syndroms getestet werden. Morice et al. ⁴¹ haben gezeigt, dass in diesen Mäusen, kurzfristige LTP in vivo und Kurzzeitgedächtnis beeinträchtigt werden während langfristige synaptische Plastizität und Gedächtnis erhalten bleiben.

Abweichungen zwischen verschiedenen Studien in verschiedenen Labors könnte auf die Dauer von kurzer Dauer LTP aufgrund von Variationen in der Enzymaktivität in der metabolischen Zustand der Scheiben oder in der Rate der Proteinabbau ^42. Proteinsynthese könnte als einer permissiven Nachschub Prozess, der Neupositionierung von Enzymen, die durch den Lernprozess verwendet wurden, oder von anderen konstitutiven Elemente Zelle ⁴³ eingesehen werden.

Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der experimentellen Bedingungen auf LTP Stabilität. Eine stabile LTP unabhängig von Proteinsynthese könnte dazu beitragen, die Rolle der dauerhafte post-Traduc studierenlen Veränderungen der synaptischen Proteinen und die zugrunde liegenden Mechanismen stabilen Anstieg der Zahl von AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran trotz Umsatz-Rezeptoren.

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll, die hoffentlich dazu beitragen sollte, um reproduzierbare Ergebnisse in verschiedenen Labors zu erhalten.

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir danken Bernard Foucart für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der belgischen Fonds für wissenschaftliche Forschung (FRS-FNRS) und von der Königin Elisabeth Fonds für medizinische Forschung unterstützt. Agnès Villers ist Research Fellow an der belgischen Fonds für wissenschaftliche Forschung.