פיתחנו זרימת עבודה מהירה של שבעה ימים כדי לבדוק כיצד תאי גידול מגיבים לתרופות בשימוש בעוברי דג הזברה. בהיותנו קרובים לאונקולוגיה של ילדים, יש לנו גישה לדגימות סרטן נדירות, והתחלנו עם לוקמיה קודמת של תאי B, אך אנו מאמצים כעת את הפרוטוקול עבור גידולים מוצקים בילדים כדי לראות אם הבדיקה תעבוד גם במסגרת קלינית. אנו יכולים לגדל בהצלחה תאי לוקמיה שמקורם בחולים בעוברי דג זברה, מה שהופך אותם למודל פרה-קליני נהדר.
עם זאת, פרמקוקינטיקה יכולה להיות מסובכת, מכיוון שחלק מהתרופות מתקשות לחצות מחסומים ביולוגיים, ולכן אנו מקפידים לבדוק את החדירה לפני שאנו מתחילים בניסויים. הגישה שלנו ייחודית מכיוון שהיא חוסמת התמיינות מולדת של תאי מערכת החיסון, מה שעוזר לתאי השתל של לוקמיה לשרוד טוב יותר. בנוסף, אנו משתמשים בזרימה ציטומטרית כדי למדוד את הכדאיות וההתפשטות של תא בודד בתאי השתל בבריכות של 10 דגים מארחים.
זה מאפשר לנו לקבל נתוני תגובה מדויקים מאוד לתרופות וכוח סטטיסטי גדול. כדי להתחיל, ממיסים 1% אגרוז ב 100 מיליליטר של מדיום E3 במיקרוגל. לצלחת ההשתלה, שפכו כ -20 מיליליטר מהמדיום לצלחת פטרי של 10 סנטימטרים, ומלאו אותה באמצע הדרך.
סובבו בעדינות את הצלחת כדי להפיץ את הנוזל באופן שווה. עבור לוחות הזרקת מורפולינו, הנח את תבנית ההזרקה על האגרוז הנוזלי בשתי צלחות פטרי, כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות. הטו את המכסים כדי לכסות את הכלים והשאירו אותם בטמפרטורת החדר עד שהאגרוז מתמצק.
לאחר שהאגרוז התמצק, אחסן את הצלחות הפוכות בארבע מעלות צלזיוס בשקית ניילון אטומה. לאחר מכן, צור את המחטים מנימים של 10 סנטימטר באמצעות מושך מחט. נתק את קצות המחטים כדי להשיג קוטר משוער של 10 מיקרומטר.
כדי להזריק את המורפולינו, העבירו קבוצות של 100 ביצי דג זברה מופרות עם מינימום נוזלים לצלחת ההזרקה שהוכנה בעבר. יישר את העוברים בזהירות בחריצי הצלחת. הזריק ננו-ליטר אחד של תערובת של 50 מיקרו-מולרית של מורפולינים spi1 ו-csf3r לתוך התא או לשק החלמון ממש מתחת לתא במהלך שלב התא האחד.
דגרו על הביצים המוזרקות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום השלישי, כדי להתחיל דה-כוריון, באמצעות פיפטת פסטר, הסר מהצלחת עוברים מתים שאינם מראים פעימות לב או תנועה, נראים אטומים או בעלי צורות לא סדירות. בעזרת שני מלקחיים מדויקים, צבטו את הכוריון כדי להחזיק אותו במקומו.
צבט ליד קצה המלקחיים תוך אבטחת העובר עם סט שני של מלקחיים. משוך בזהירות את הכוריון כדי לשחרר את העובר. דגירה על עוברים שעברו דה-כוריון ב-28 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
כדי להתחיל, הכינו שתי צלחות פטרי בגודל 10 ס"מ במילוי מדיום E3 בתוספת סטרפטומיצין פניצילין או E3/P/S. מניחים את הכלים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לחימום מראש. לאחר תיוג תאים פלואורסצנטיים עם CellTrace Violet, או CTV, צנטריפוגה את תאי BCP-ALL.
לאחר מכן הוסף PBS כדי להשיג את ריכוז התאים הרצוי ולשמור אותו על קרח. טען ארבעה מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך מחט ההשתלה באמצעות קצה מיקרו-טוען. הוסף טריקאין לצלחת פטרי עם מדיום E3/P/S ועוברי דגים כדי להשיג ריכוז סופי של ארבעה גרם לליטר להרדמת העוברים לפחות שתי דקות לפני ההזרקה.
לאחר מכן, העבירו 15 עד 20 עוברים שעברו דה-כוריון על צלחת הזרקה מצופה אגרוז והסירו עודפי נוזלים כדי למנוע החלקה של העוברים. מסדרים את העוברים על צלחת ההזרקה. החדרת המחט בזווית של 45 מעלות מהכיוון הדורסו-קאודלי, הזרקת כ-1,000 תאי BCP-ALL חיוביים ל-CTV לחלל קרום הלב.
לאחר הזרקת 15 עד 20 העוברים, העבירו אותם לצלחת פטרי שחוממה מראש במילוי מדיום E3/P/S. דגרו הן על העוברים המושתלים והן על הבקרות שלא הושתלו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שלוש שעות. תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי, סנן את העוברים כדי לאשר את ההשתלה המוצלחת ולוודא שהחלמון שלם.
הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום E3/P/S ו-0.5% DMSO לכל באר של צלחת 96 בארות. בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית, הרם את העובר המושתל עם כמה שפחות מדיום E3. הטה את הפיפטה כדי לאפשר לעובר לשקוע לתחתית קצה הפיפטה ולשחרר אותו לבאר באמצעות כוחות נימיים.
מלאו 24 בארות של צלחת 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של תמיסת בקרת הרכב או תמיסות מרוכזות פי שניים של ונטוקלקס. שמור על העוברים בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות, כולל העוברים שלא הושתלו כביקורת. בסוף היום השלישי, הסר את צלחת 96 הבאר המכילה עוברי דג זברה מושתלים מהחממה.
סנן את הצלחת באמצעות מיקרוסקופ סטריאו כדי לזהות ולבחור עוברי דג זברה בריאים. אסוף באופן אקראי 10 עוברים מארחים מכל מצב לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ובאופן אידיאלי התוצאה היא שני צינורות לכל מצב. הסר כמה שיותר נוזלים מכל צינור.
הוסף 500 מיקרוליטר של סידן ו-HBSS ללא מגנזיום לכל צינור. פירוק מכני של העוברים ותאי השתל על ידי טריטורציה באמצעות קצה מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר, פיפטינג למעלה ולמטה כ-15 פעמים. צנטריפוגה את הצינורות ב -350 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את שברי הרקמה.
הכן צינורות FACS עם מכסה מסננת רשת עדינה של 35 מיקרומטר המכיל שני מיליליטר PBS לכל מצב. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב -500 מיקרוליטר של תערובת אנזימים ודגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כל חמש דקות באמצעות אותו קצה פיפטה לכל צינור כדי למנוע אובדן רקמות.
העבר את התאים המנותקים למכסה מסננת הרשת העדינה בגודל 35 מיקרומטר של צינורות ה-FACS. צנטריפוגה את הצינור ב -350 גרם למשך חמש דקות. בצע ניתוח ציטומטריית זרימה כדי להעריך את המספר הכולל של תאי השתל.
התחל את ניתוח הנתונים עם תאי תרבית 3dpi צבועים CTV ו-CD19. צור תרשים נקודות עם CD19 ו-CTV כדי להבטיח שהאות חופף וכדי לאשר את נוכחותם של תאי הסרטן המוכתמים כפול. לאחר מכן, צור עלילת נקודות עם FSC-A ו-SSC-A כדי להבחין בין תאים שלמים לפסולת.
לאחר מכן השתמש באוכלוסיית התאים השלמה כדי ליצור עלילה חדשה עם SSC-A ו-SSC-H כדי לזהות תאים בודדים. צור תרשים נקודות עם 7AAD ו-Annexin V באמצעות אוכלוסיית התאים הבודדים כדי להבחין בין תאים לארבע אוכלוסיות. פתח את הקובץ של דג זברה מושתל.
הפרד תאי שתל אנושיים מתאי מארח באמצעות תרשים נקודות עם CTV ו-CD19. זהה ובודד תאי שתל חיוביים כפולים CTV, CD19. העתק ויישם את אותה אסטרטגיית שער המתוארת עבור תאי תרבית 3dpi על אוכלוסיית תאי השתל.
מזג את כל אוכלוסיות התאים השליליים של Annexin V ו- 7AAD להיסטוגרמה עם ערכי CTV על ציר ה- x. חשב את הממוצע הגיאומטרי עבור כל חמש הדגימות כדי לקבוע את שיעורי ההתפשטות. נתוני ציטומטריית זרימה הראו כי לתאים בודדים טריים של BCP-ALL שהושתלו בעוברי דג הזברה הייתה כדאיות של 95.2% לאחר שלושה ימים, פי 1.5 יותר מאשר 61.9% כדאיות של תאים בתרבית צלחת.
עוצמת הקרינה של CTV הן בתנאי גוף והן במבחנה ירדה באופן דומה במשך שלושה ימים, מה שמעיד על שיעורי חלוקת תאים דומים. תאי שתל שלמים לעובר לאחר שלושה ימים כומתו בכל מאגר, מה שמעיד על השתלה עקבית.
