שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות סלמונלה מדגימות מזון ולזהות את הפתוגן לרמת המתח באמצעות טביעת אצבע גנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת זיהוי סלמונלה ו subtyping לתוך זרימת עבודה אחת ומקצר באופן משמעותי את זמן התפנית מדגימת מזון מזוהמים סלמונלה לטביעת אצבע של הפתוגן. כדי להתחיל, באופן בלתי מתאים למקם מדגם 25 גרם של מזון בתוך שקית בלנדר מעבדה סטרילית עם מסנן מובנה או אופציונלי להכין ספוגית סביבתית על ידי לחות אספטית ספוג עם מרק העשרה, גרירתו על פני משטח שנקבע מראש ומניח אותו בתוך שקית בלנדר.
בעזרת בלנדר מעבדה, מערבבים ביסודיות כל דגימה עם 225 מיליליטר של מרק העשרת קרוואנים. ואז להחגירה את התערובת ב 42 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד 21 שעות. לאחר מכן, לאסוף תת-דגימה של 50 מיליליטר של מרק העשרה מהצד המסונן של התיק.
ואז צנטריפוגה תת לפזר ב 100 פעמים g במשך 10 דקות. בזהירות להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב 3, 000 כדי 6, 000 פעמים g במשך 10 דקות. להשליך את supernatant ולשטוף את גלולה בחמישה מיליליטר של BPW.
תן את גלולה בחמישה מיליליטר של BPW. ראשית, להפשיר את חיץ הדגימה ואת חיץ התגובה של ערכת מד"א על קרח. מניחים מיליליטר אחד של תאים ב-BPW ו-20 מיקרוליטרים של בחנורי אנטי סלמונלה בצינור מיקרוצנטריפוגה.
מניחים את צינור המיקרוצנטריפוגה על מערבל מסתובב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מניחים את הצינור על מעמד מגנטי במשך שלוש דקות. להפוך את המדף המגנטי מספר פעמים כדי לרכז את חרוזים לתוך גלולה.
שמירה על הצינור על המדף המגנטי, שאף והשליך את העל-טבעי. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של חיץ לשטוף לצינור. הסר את מחזיק הצינור מהמדף והפוך את מחזיק הצינור מספר פעמים כדי להסיר חיידקים שאינם מחייבים במיוחד מהמתחם.
לאחר הכביסה השלישית, שאפו את העל-טבעי מהצינור והשליכו אותו. ואז להסיר את הצינור מן המדף המגנטי צנטריפוגה אותו לשנייה אחת. לאחר מכן מניחים את הצינור על המדף המגנטי במשך שלוש דקות לפני הסרת כל חיץ לשטוף שיורית.
תוכלו להתרסק מחדש על מתחמי הסלמונלה של חרוזים בתשעה מיקרוליטרים של חיץ דגימה ולהדגיר את הצינור ב-95 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר קירור המתחמים על הקרח, מוסיפים תשעה מיקרוליטרים של חיץ תגובה ומיקרוליטר אחד של תערובת אנזימים. דגירה הצינור במחזור תרמי על פי פרוטוקול הטקסט ו לקרר את הצינור על קרח.
לאחר מכן, השתמשו במכשיר פלואורוספקטרומטר למדידת ריכוז הדנ"א וטוהר הדגימה. לאחסן את המוצרים הסופיים ב 20 מעלות צלזיוס שלילי לניסויים עתידיים. הכן 18 מיקרוליטרים של תערובת PCR לכל מדגם בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן מערבבים את מוצר מד"א על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה. הוסיפו שני מיקרוליטרים של מתלי המוצר של מד"א לתערובת ה-PCR. באמצעות פרוטוקול PCR ממוטב בזמן אמת, הפעל את PCR בזמן אמת בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
הוסף פתרונות חיץ וריג'ינים למוצר MDA כמפורט בפרוטוקול הטקסט והעבר את 40 המיקרוליטרים המתקבלים של מוצר מד"א מוכן לצלחת חדשה והוסף 20 מיקרוליטרים של חטיפי טיהור PCR לכל באר. לאחר מכן, הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן לשטוף את חרוזים עם 80% אתנול ולייבש אותם במשך 12 דקות.
תוכלו להתריע מחדש על חרוזים מיובשים ב-53 מיקרוליטרים של חיץ ההתלות מחדש ולהדגור את החמרוזים במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, לדלל ולאגר ספריות על פי הוראות היצרן. בפרוטוקול זה, הערכת כמות ממוקדת של DNA סלמונלה בוצעה על ידי PCR בזמן אמת.
תוצאות מייצגות משני מותגים של חזה עוף מזוהם סלמונלה נע בין 701.54 ל 945.86 ננוגרם למיקרוליטר המציין כי ה-DNA מדגם היה מוגבר ביעילות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשטוף ולטפל בזהירות בחרוזי IMS, לשמור על צוותי מד"א ומוצרים נקיים ממדבקים ולשמור על מכסה המנוע נקי. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום בטיחות המזון ובריאות הציבור לחקור מעקב מהיר ברזולוציה גבוהה של מזהמי סלמונלה בדגימות מזון, סביבות מוצרים ושרשראות אספקה.
אל תשכח כי עבודה עם פתוגנים המועברים במזון יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי בעקבות שיטות מעבדה טובות תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
