Este método pode ser usado para detectar Salmonella a partir de amostras de alimentos e identificar o patógeno ao nível da cepa através da impressão digital genética. A principal vantagem desta técnica é que ela combina a detecção e subtipação de Salmonella em um único fluxo de trabalho e encurta substancialmente o tempo de retorno da amostra de alimentos contaminadas por Salmonella à impressão digital do patógeno. Para começar, coloque aseptamente uma amostra de 25 gramas de alimento dentro de um saco de liquidificador de laboratório estéril com um filtro embutido ou prepare opcionalmente um cotonete ambiental, asepticamente umedecendo uma esponja com caldo de enriquecimento, arrastando-a através de uma superfície pré-determinada e colocando-a dentro de um saco de liquidificador.
Usando um liquidificador de laboratório, misture completamente cada amostra com 225 mililitros de caldo de enriquecimento rv. Em seguida, incubar a mistura a 42 graus Celsius por quatro a 21 horas. Depois disso, colete uma subsamima de 50 mililitros de caldo de enriquecimento do lado filtrado da bolsa.
Em seguida, centrifufique a subsample em 100 vezes g por 10 minutos. Transfira cuidadosamente o supernasal para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros e centrífuga de 3.000 a 6.000 vezes por 10 minutos. Descarte o supernatante e lave a pelota em cinco mililitros de BPW.
Resuspend a pelota em cinco mililitros de BPW. Primeiro, descongele o tampão de amostra e o tampão de reação do kit MDA no gelo. Coloque um mililitro de células resuspended em BPW e 20 microliters de contas anti-Salmonella em um tubo de microcentrifuge.
Coloque o tubo de microcentrifuagem em uma batedeira giratória por 30 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, coloque o tubo em uma posição magnética por três minutos. Inverta o rack magnético várias vezes para concentrar as contas em uma pelota.
Mantendo o tubo no rack magnético, aspire e descarte o supernaspeso. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem ao tubo. Remova o suporte do tubo do rack e inverta o suporte do tubo várias vezes para remover qualquer bactéria não especificamente vinculante do complexo.
Após a terceira lavagem, aspire o supernasal do tubo e descarte-o. Em seguida, remova o tubo do rack magnético e centrifuá-lo por um segundo. Em seguida, coloque o tubo no rack magnético por três minutos antes de remover qualquer tampão de lavagem residual.
Resuspende os complexos de salmonela em nove microlitadores de tampão de amostra e incubar o tubo a 95 graus Celsius por três minutos. Depois de resfriar os complexos no gelo, adicione nove microliters de tampão de reação e um microliter de mistura de enzimas. Incubar o tubo em um cicloviário térmico de acordo com o protocolo de texto e resfriar o tubo no gelo.
Em seguida, use um instrumento fluoroespectrômetro para medir a concentração de DNA e a pureza da amostra. Armazene os produtos finais a 20 graus Celsius negativos para experimentos futuros. Prepare 18 microliters de mistura PCR por amostra de acordo com o protocolo de texto.
Em seguida, misture o produto MDA, em pipetando suavemente para cima e para baixo. Adicione dois microliters da suspensão do produto MDA à mistura PCR. Usando um protocolo PCR otimizado em tempo real, execute o PCR em tempo real de acordo com o protocolo de texto.
Adicione soluções tampão e reagentes ao produto MDA conforme especificado no protocolo de texto e transfira os 40 microliters resultantes do produto MDA preparado para sequenciamento para uma nova placa e adicione 20 microliters de contas de purificação pcr a cada poço. Em seguida, incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, lave as contas com 80% de etanol e seque-as por 12 minutos.
Resuspenque as contas secas em 53 microliters de tampão de resuspensão e incuba as contas por dois minutos em temperatura ambiente. Finalmente, bibliotecas diluídos e de piscina de acordo com as instruções do fabricante. Neste protocolo, a avaliação da quantidade direcionada do DNA salmonela foi realizada por PCR em tempo real.
Os resultados representativos de duas marcas de peito de frango contaminado por Salmonella variaram de 701,54 a 945,86 nanogramas por microliter indicando que o DNA da amostra foi efetivamente amplificado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de lavar e manusear contas IMS cuidadosamente, manter reagentes e produtos MDA livres de contaminantes e manter um capô limpo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de segurança alimentar e saúde pública explorarem o rastreamento rápido e de alta resolução de contaminantes salmonelas em amostras de alimentos, ambientes de produtos e cadeias de suprimentos.
Não se esqueça que trabalhar com patógenos transmitidos por alimentos pode ser extremamente perigoso e precauções como usar equipamentos de proteção individual e seguir boas práticas laboratoriais devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
