Cette méthode peut être utilisée pour détecter Salmonella à partir d’échantillons d’aliments et identifier l’agent pathogène au niveau de la souche grâce à la prise d’empreintes génétiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine la détection et le sous-dypage de Salmonella en un seul flux de travail et réduit considérablement le délai d’exécution de l’échantillon d’aliments contaminés par Salmonella à l’empreinte digitale de l’agent pathogène. Pour commencer, placez de façon aseptique un échantillon de 25 grammes d’aliments à l’intérieur d’un sac de mélangeur de laboratoire stérile avec un filtre intégré ou préparez en option un écouvillon environnemental en humidissant aseptiquement une éponge avec du bouillon d’enrichissement, en la faisant glisser sur une surface prédéterminée et en la plaçant à l’intérieur d’un sac de mélangeur.
À l’aide d’un mélangeur de laboratoire, bien mélanger chaque échantillon avec 225 millilitres de bouillon d’enrichissement rv. Puis incuber le mélange à 42 degrés Celsius pendant quatre à 21 heures. Après cela, recueillir un sous-échantillon de 50 millilitres de bouillon d’enrichissement du côté filtré du sac.
Puis centrifuger le sous-échantillon à 100 fois g pendant 10 minutes. Transférer délicatement le supernatant dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 millilitres et une centrifugeuse à 3 000 à 6 000 fois g pendant 10 minutes. Jeter le supernatant et laver la pastille en cinq millilitres de BPW.
Resuspendez la pastille en cinq millilitres de BPW. Tout d’abord, décongeler le tampon de l’échantillon et le tampon de réaction de la trousse MDA sur la glace. Placer un millilitre de cellules résuspendues dans bpw et 20 microlitres de perles anti-Salmonella dans un tube de microcentrifugeuse.
Placer le tube de microcentrifugeuse sur un mélangeur rotatif pendant 30 minutes à température ambiante. Après cela, placez le tube sur un support magnétique pendant trois minutes. Inverser la grille magnétique plusieurs fois pour concentrer les perles dans une pastille.
Garder le tube sur la grille magnétique, aspirer et jeter le surnatant. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de lavage au tube. Retirez le support du tube de la grille et inversez le support du tube plusieurs fois pour éliminer les bactéries non spécifiquement contraignantes du complexe.
Après le troisième lavage, aspirer le surnatant du tube et le jeter. Retirez ensuite le tube de la grille magnétique et centrifugez-le pendant une seconde. Placez ensuite le tube sur la grille magnétique pendant trois minutes avant d’enlever tout tampon de lavage résiduel.
Resuspendez les complexes de Salmonella perle dans neuf microlitres de tampon d’échantillon et incubez le tube à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Après refroidissement des complexes sur la glace, ajouter neuf microlitres de tampon de réaction et un microlitre de mélange d’enzymes. Incuber le tube dans un cycleur thermique selon le protocole du texte et refroidir le tube sur la glace.
Ensuite, utilisez un instrument fluorospectromètre pour mesurer la concentration et la pureté de l’ADN de l’échantillon. Conservez les produits finaux à 20 degrés Celsius négatifs pour de futures expériences. Préparer 18 microlitres de mélange PCR par échantillon selon le protocole de texte.
Ensuite, mélangez le produit MDA en pipetting doucement de haut en bas. Ajouter deux microlitres de la suspension du produit MDA au mélange PCR. À l’aide d’un protocole PCR optimisé en temps réel, exécutez le PCR en temps réel selon le protocole texte.
Ajoutez des solutions tampons et des réaccéléments au produit MDA tel que spécifié dans le protocole de texte et transférez les 40 microlitres résultants du produit MDA préparé par séquençage à une nouvelle plaque et ajoutez 20 microlitres de perles de purification PCR à chaque puits. Ensuite, incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les perles avec 80% d’éthanol et séchez-les pendant 12 minutes.
Resuspendez les perles séchées dans 53 microlitres de tampon de resuspension et incuber les perles pendant deux minutes à température ambiante. Enfin, diluer et mettre en commun les bibliothèques selon les instructions du fabricant. Dans ce protocole, l’évaluation quantitative ciblée de l’ADN de Salmonella a été effectuée par PCR en temps réel.
Les résultats représentatifs de deux marques de poitrines de poulet contaminées par Salmonella variaient de 701,54 à 945,86 nanogrammes par microlitre, ce qui indique que l’ADN de l’échantillon a été effectivement amplifié. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de laver et de manipuler les perles IMS avec soin, garder les reagents MDA et les produits exempts de contaminants et de maintenir une hotte propre. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la salubrité des aliments et de la santé publique afin d’explorer le suivi rapide et à haute résolution des contaminants salmonella dans les échantillons d’aliments, les environnements de produits et les chaînes d’approvisionnement.
N’oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes d’origine alimentaire peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’équipement de protection individuelle et le suivi de bonnes pratiques de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
