Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

The authors have nothing to disclose.

בעוד בניתוח סיליקון יכול לתת תובנה מצוינת קהילות החיידקים שנמצאות בתוך דגימות סביבתיות, זה קריטי, כי הסיווגים טקסונומיות הפגינו להתבצע בשיתוף עם בקרות רלוונטיות וכי בעומק של רצף מתאים הושג על מנת ללכוד את כולו אוכלוסיית 51 נוכחית. עם כל ניתוח חישובית, ישנם מסלולים רבים כדי להשיג מטרה דומה. השיטות שבהם השתמשנו במחקר זה הם דוגמאות של שיטות מתאימות וישירה, כי כבר הפגיש להשיג מגוון של ניתוחים על Microbiome תחמיץ. מגוון ומספר גדל והולך של כלי ביואינפורמטיקה וטכניקות זמינים לנתח נתונים metagenomic, למשל Phylosift 8 ו MetaPhlAn2 52, ואלה יש להעריך לפני החקירה עבור הרלוונטיות שלהם המדגם req ניתוחuired 53. שיטות ניתוח metagenomic מוגבלים על ידי מסדי נתונים עבור זמין עבור סיווג, עומק רצף ואיכות רצף. עיבוד bioinformatic הפגין כאן בוצע על מחשב מקומי, גבוה Powered; אולם מערכות מבוססות ענן זמינים אף הם. שירותי ענן מבוסס אלה מאפשרים להשכרה של כוח מחשוב הדרושים מבלי השקעת העלות הגבוהה של עבודה מקומית חזקה מתאימה. יישום הפוטנציאל של שיטה זו יהיה להעריך תחמיץ לפני השימוש בו בחקלאות, כדי לוודא ששום חיידקים מזיקים נוכחים ולכן למנוע מהם להיכנס לשרשרת המזון.

Metagenomics הוא הניתוח הישיר של DNA מטוהר מן הקהילות ביולוגיות נמצאות בתוך דגימות סביבתיות 1 ו שמש במקור כדי לזהות חיידקי unculturable נמצאים במשקעים 2. Metagenomics כבר בשימוש נרחב במשך מספר יישומים, כגון זיהוי Microbiome האדם 3, לסיווג אוכלוסיות חיידקים בתוך האוקיינוס 4 ואפילו לניתוח של קהילות חיידקים המתפתחים על מכונות קפה 5. המבוא של טכנולוגיות רצף הדור הבא הביא תפוקת רצף גדולה ופלט. כתוצאה מכך, רצפי DNA הפכו יותר חסכוניים 6 ואת העומק של רצף שניתן לבצע גדלה מאוד, מה שמאפשר metagenomics להפוך כלי רב עצמה, אנליטי. &quot;Front-end&quot; שיפורים בהיבט המעשי, המולקולרי של רצף metagenomic הניעו את הצמיחה של בכלי ביואינפורמטיקה סיליקון זמין עבור הסיווג הטקסונומי 7-9, ביאור תפקודי 10,11 וייצוג חזותי 12,13 של נתוני רצף DNA. מספר הגדל וההולך של זמין, רצף פרוקריוטים ו האיקריוטים 14 הגנום מאפשר דיוק נוסף בסיווג קהילות חיידקים, אשר מבוצעות תמיד מול מסד נתוני התייחסות &quot;עורפי&quot; של הגנום רצף 15. שתי גישות עיקריות ניתן לאמץ לניתוח metagenomic. השיטה המקובלת יותר היא ניתוח של הגן 16S rRNA קידוד באזור של הגנום של חיידקים. 16S rRNA הוא שמור ביותר בין המינים פרוקריוטים אבל מפגין תשעה אזורים היפר-משתנה (V1 - V9) אשר ניתן לנצל לצורך זיהוי מינים 16. המבוא של רצף ארוך יותר (≤ 300 נ&quot;ב סוף לזווג) מותר לניתוח רצפי DNA פורש שני אזורים-משתנה יתר, בפרטV3 - באזור V4 17. התקדמות בטכנולוגיות רצף אחרות, כגון אוקספורד nanopore 18 PacBIO 19, מתירה את גן 16S rRNA כולו להיות רצף בסמיכות. בעוד 16S ספריות מבוססות rDNA לספק גישה ממוקדת, לשם זיהוי מינים ולאפשר זיהוי של דנ&quot;א מספר נמוך עותק המתרחש באופן טבעי בתוך דגימות מטוהרות, ספריות רצף רובה לאפשר זיהוי של מינים שעלולים להכיל אזורי DNA כי הם או לא amplifiable ידי 16S רצפי פריימר סמן rRNA בשימוש, או בגלל ההבדלים בין רצף התבנית ואת רצף הגברה פריימר גדולים מדי 20,21. יתר על כן, למרות polymerases DNA יש איכות גבוהה של שכפול ה- DNA, שגיאות בסיס בכל זאת יכולה להתרחש במהלך הגברת PCR ושגיאות המשולבות אלה עלולות לגרום סיווג שגוי של שמקורם מינים 22. הטיות הגברת PCR של seq התבניתמשפיעה יכולה להתרחש גם; רצפים של DNA עם תוכן GC גבוה יכולים להיות בתת-ייצוג בברכת amplicon הסופי 23 ובדומה שינויי בסיס טבעיים, כגון גליקול תימין, יכול לעצור polymerases DNA גורם כשלי ההגברה של DNA רצפי 24. לעומת זאת, ספריית DNA רצף אקדח היא ספריית DNA כי הוכנה באמצעות כל ה- DNA מטוהר כי כבר שחולץ ממדגם ובהמשך מקוטע לתוך אורכי שרשרת דנ&quot;א קצר לפני הכנה על רצף. סיווג טקסונומי של רצפי DNA שנוצר על ידי רצף הרובה הוא יותר כמדויק בהשוואה רצף amplicon 16S rRNA 25, למרות העלות הכספית הנדרשת כדי להגיע לעומק רצף אמין הוא גדול יותר מזה של רצף amplicon 26. היתרון העיקרי של metagenomics רצף אקדח הוא שאזורי רצף של הגנום השונה במדגם זמינים וסיקור גן פעם הם היוסווג 27 טקסונומית. נתוני רצף metagenomic מנותחים על ידי מגוון גדל והולך של כלי bioinformatic. כלים אלה מסוגלים לבצע מגוון רחב של יישומים, למשל, ניתוח בקרת איכות של הנתונים רצף גלם 28, חופפים של סוף לזווג קורא 29, דה נובו הרכבה של רצף מקריא contigs ופיגומים 30,31, הסיווג הטקסונומי וויזואליזציה של רצף הקורא התאסף רצפי 7,12,32,33 ואת הביאור התפקודי של רצפים התאספו 34,35. תחמיץ, המיוצר על ידי חקלאים בכל רחבי העולם מדגנים מותססים כמו תירס (Zea Mays), משמש ברובה כמו לבהמות. תחמיץ מטופל עם sp לקטובצילוס חיידק. כדי לסייע תסיסה 36 אך עד כה, יש ידע מוגבל של אוכלוסיות חיידקים אחרים שנמצאו תחמיץ. fermentatioתהליך n יכול להוביל מיקרו אורגניזמים בלתי-רצויים ומזיקים פוטנציאל להיות נפוץ בתוך תחמיץ 37. בנוסף שמרים ועובש, חיידקים הם סתגלניים במיוחד לסביבת אנאירובי תוסס תחמיץ ומזוהים בתדירות גבוהה יותר עם מחלות בעלי חיים ולא השפלה של התחמיץ 38. חיידקים חומצה בוטירית ניתן להוסיף בטעות מאדמת נשאר בעת מילוי בממגורות תחמיץ והם מסוגלים להמיר את חומצת חלב, תוצר של עיכול אנאירובי, חומצה בוטירית, ובכך להגדיל את רמת החומציות של תחמיץ 39. העלייה זו pH יכולה להוביל להתגברות חיידקים מקולקלים לא יוכל בדרך כלל כדי לקיים את צמיחה בתנאי תסיסת תחמיץ אופטימלי 38. Spp Clostridium. , Spp ליסטריה. ו spp Bacillus. הם מדאיג במיוחד, במיוחד תחמיץ עבור להאכיל בקר לחלב, כפי נבגי החיידקים ששרדו את gastrבדרכי ointestinal 40 יכולות להיכנס-שרשרת מזון, להוביל קלקול מזון, במקרים נדירים, כדי חי למותם של בני אדם 37,39,41-44. יתר על כן, בעוד שקשה להעריך את ההשפעה הכלכלית המדויקת של טיפול וטרינרים ואובדן בעלי חיים הנגרם על ידי קלקול תחמיץ, היא עשויה להיות מזיק חווה אם התפרצות הייתה להתרחש. ההשערה היא כי באמצעות גישת metagenomic אנחנו יכולים לסווג אוכלוסיות החיידקים שנמצאות בדגימות תחמיץ ויתר על כן לזהות קהילות חיידקים הקשורים קלקול תחמיץ כי היו, בתורו, יש פוטנציאל השפעה מזיקה על בעלי החיים, המאפשר פעולה מתקנת כדי להיות נלקח לפני התחמיץ הוא לשמש כמקור מזון.

<table><tbody><tr><td>FastDNA SPIN Kit for Soil</td><td>MP Bio</td><td>116560200</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>DNA FastPrep</td><td>MP Bio</td><td>116004500</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19806</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tubes</td><td>Agilent</td><td>401428 and 401425</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>DNA Sequencing - provided by a sequencing service</td></tr><tr><td>High Power Analysis Workstation</td><td>Various</td><td></td><td>Local or cloud based, user preferred system</td></tr></tbody></table>

metagenomic analysis of silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

<html> לפני עיבוד bioinformatic, רצף גלם קורא קוצצו ומתאמים הוסרו באמצעות Trimmomatic תוכנה 28. לאחר שלב הזמירה וסינון, מספר כניסות הופחת ל -50% של רצף הקורא (טבלה 1). ציון Phred הבסיס הממוצע היה&gt; 30 לאחר בקרת איכות (איור 2). זוגות של רצפי DNA אשר היו אזורים חופפים מוזגו באמצעות תוכנת FLASH 29 כדי ליצור אחת כבר קורא, שאינו חופף קורא נשמרו בקובץ נפרד. 45.47% קורא (105,343) בשילוב בהצלחה. בעקבות חופפים של קורא באמצעות FLASH של קורא, שברי הוארך וכתוצאה מכך עברו הסיווג הטקסונומי חיידקי באמצעות קראקן תוכנה 7 ו היו דמיינו לאחר מכן עם תוכנת כתר (איור 3). .within-page = &quot;1&quot;&gt; רוב מינים של חיידקים הנמצאים metagenome תחמיץ נמצאים בתוך 4 טווח המערכת פרוקריוטים: Firmicutes (34%), Actinobacteria (28%), פרוטאובקטריה (27%) ו Bacteroidetes (7%) . חלוקת כיתות הנוכחי בתוך טווח המערכת אלה ניתן לראות באיור 4. המין הנפוץ ביותר metagenome היה spp לקטובצילוס. (24%; Firmicutes), spp Corynebacterium. (8%; Actinobacteria), spp Propionibacterium. (3%; Actinobacteria) ו spp Prevotella. (3%; Bacteroidetes). מינים חשובים לבריאות בעלי חיים הקשורים במחלות נצפו גם; Spp Clostridium. (1%) spp Bacillus. (0.6%), spp ליסטריה. (0.2%) נחזו להיות נוכח במדגם התחמיץ. ביאור פונקציונלי בוצע על התאספו קורא. Metagenome הורכב באמצעות מאסף Spades 30 באמצעות גזוז ומסונןלזווג-end מזווג קורא ליצירת 92,284 פיגומים. על מנת לזהות cellulases, חלבונים נחזו באמצעות MG-RAST והערות באמצעות מסד אנזימים פחמימות-Active (CAZy). של 97,562 חלבוני חזה, 6357 היו מפורשים כמו אנזים בפחמימות פעילות המשוערת באחד מחמש מעמדות האנזימים שמרכיבות את מסד נתוני CAZy (איור 5). תוצאות היו דמיינו כמו דיאגרמת ון באמצעות תוכנת InteractiVenn 50 מראה את חלוקת הסברי חלבון כולל אלו המכילים יותר מאחד ביאור בכיתת אנזים CAZy. מבין אלה, נחזו 3861 לקיים פעילות hydrolase glycoside ו יאופיינו הלאה במעבדה כדי לאשר פונקציה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" /> איור 1: bioinformatic Metagenomics צינור עבור הניתוח של תחמיץ. שתי גישות עיקריות היושימוש כדי לחקור את Microbiome של תחמיץ, סיווג הטקסונומי ביאור תפקודי. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" /> איור 2: איכות רצף Per-בסיס לפני ואחרי קיצוץ מתאם הסרה. רצף שידורי בסיס עלילת איכות FASTQC מציגה את הציון הממוצע Phred פני האורך של הרצף קורא בקרת איכות לפני ואחרי. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" /> איור 3: טקסונומי Classification של Microbiome חיידקית של תחמיץ מוצק. סיווג של רצף גזוז וחופפים קורא מתוך FLASH בוצע באמצעות קראקן 7 ובהמשך מדמיין עם כתר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" /> איור 4: התפלגות מחלקה טקסונומי של 4 טווח המערכת בשכיחותו Microbiome חיידקית של תחמיץ מוצק. האחוז לכל סוג של חיידקים בתוך ארבעה טווח המערכת הנפוצה ביותר. Firmicutes: וקלוסטרידיאה.את (אדום) ואת החיידקים (כחול כהה); פרוטאובקטריה: דלתא / אפסילון (ורוד), אלפא (בצבע כחול חיוור), גמא (כתום) בטא (טורקיז); Bacteroidetes: Flavobacteriia (כחול כהה) ו Bacteroidia(ירוק חיוור); Actinobacteria: Coriobacteriia (סגול כהה) ו Actinobacteria האחר (ירוק כהה). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" /> איור 5: CAZy ביאור של Proteome החזוי של Microbiome התחמיץ המוצק. דיאגרמת ון מראה את חלוקת חמשת כיתות האנזים מהערות CAZy ב proteome החזוי של Microbiome תחמיץ מוצק. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קורא # גלם </td><td rowspan="2"> # מסונן קורא (זיווג) </td&gt; <td> # מסונן קורא </td><td rowspan="2"> # הבזיק קורא </td></tr><tr><td> (מְזוּוָג) </td><td> (מזווג) </td></tr><tr><td> 2,374,949 x2 </td><td> 231,679 x2 </td><td> 1,892,534 </td><td> 105,343 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: סיכום טבלת רצף קורא.

Watch this Scientific Journal Video about Metagenomic Analysis of Silage at JoVE.com

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

18.0K Views.  University of Exeter. Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Video: Metagenomic Analysis of Silage

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Environment

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Nanopore רצפי DNA לניתוח Metagenomic אדמה

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil and gas. This process revolutionized the U.S. energy industry, as it gives access to resources that were previously unobtainable and now produces two-thirds of the total natural gas in the United States. Although fracking has had a positive impact on the U.S. economy, several studies have highlighted its detrimental environmental effects. Of particular concern is the effect of fracking on headwater streams, which are especially important due to their disproportionately large impact on the health of the entire watershed. The bacteria within those streams can be used as indicators of stream health, as the bacteria present and their abundance in a disturbed stream would be expected to differ from those in an otherwise comparable but undisturbed stream. Therefore, this protocol aims to use the bacterial community to determine if streams have been impacted by fracking. To this end, sediment, and water samples, from streams near fracking (potentially impacted) and upstream or in a different watershed of fracking activity (unimpacted) must be collected. Those samples are then subjected to nucleic acid extraction, library preparation, and sequencing to investigate microbial community composition. Correlational analysis and machine learning models can subsequently be employed to identify which features are explanative of variation in the community, as well as identification of predictive biomarkers for fracking&#39;s impact. These methods can reveal a variety of differences in the microbial communities among headwater streams, based on the proximity to fracking, and serve as a foundation for future investigations on the environmental impact of fracking activities.

Here, we present a protocol to investigate the impacts of hydraulic fracturing on nearby streams by analyzing their water and sediment microbial communities.

הערכת ההשפעה של שבירה הידראולית על נחלים באמצעות חתימות מולקולריות מיקרוביאליות

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

Derivatization and Separation of Barley Flour Metabolites into Four Fractions

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe and quantify the impacts of drought on grain and other agricultural products. The identified metabolites may allow for the identification of the biochemical response that allows the plant to tolerate stressful environments. The methodology presented herein allowed for the total metabolomic analysis of barley flour using gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). 
Barley flour metabolite extracts were fractionated into four fractions based on polarity. To allow for analysis by GC/MS, metabolites were derivatized to increase volatility and metabolite separation: fatty acids esters were derivatized into fatty acid methyl esters; sugars were oximated into their straight chain form; and metabolites with hydroxyl groups were converted to their corresponding silyl ethers. The derivatized samples were injected into the GC/MS and the generated mass spectra were used for metabolite identification by comparing the generated spectra to the National Institute of Standards and Technology (NIST) Tandem Mass Spectra library. The method described here can also be used to examine the total metabolome for other plants, furthering our understanding of the biochemical responses of stressed plants.

A method for metabolomic analysis of barley is presented. The method entails fractionation and derivatization of metabolites and analysis thereof by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Metabolomic analysis can be used to determine the effect of intercropping and drought stress on the grain.

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biology

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video