שיטת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית זו מכמתת פנוטיפים של סלמונלה בתוך תאי אפיתל מעיים באופן אוטומטי, ומאפשרת לחקור סלמונלה על מספר רב של זנים ברזולוציה ניתנת להרחבה. לשיטה שלנו יש יתרון בכך שהיא כמותית, בעלת תפוקה גבוהה ואוטומטית בעת ובעונה אחת, תוך הסתמכות הן על אזור והן על ניתוח של תא בודד. ההתנהגות התוך-תאית היא מרכזית באינטראקציה בין המארח לפתוגן של חיידקים רבים.
השיטה שלנו יכולה להיות מותאמת בקלות לפתוגנים חיידקיים שאינם סלמונלה, מה שתורם להבנת הפתוגנזה שלהם. לאחר רכישת התמונות, בצע ניתוח של תא בודד על ידי פתיחת הרכישה. קובץ czi ב- ImageJ.
פצל את הערוצים על-ידי לחיצה על התמונה ובחירה באפשרות צבע, ולאחר מכן פצל ערוצים. לסגמנטציה של תאים, בחר בתמונת המישור Z בחלון הכותרת של רכישת C1. בחר את חלון כותרת הרכישה C1 ולחץ על התמונה ואחריה הכפילות.
לאחר מכן, כתוב את מספר מישור Z שנבחר. כתוב C1Zplane בתיבת הכותרת, בטל את סימון האוסף 'שכפל' ולחץ על 'אשר' כדי לשכפל את תמונת מישור Z שנבחרה בלבד. ייפתח חלון בשם C1Zplane המציג את תמונת מישור Z שנבחרה.
כעת שפר את ניגודיות התמונה של תמונת C1Zplane המתקבלת על ידי בחירה בתהליך ולחיצה על שפר ניגודיות. התאם את הפיקסלים הרוויים, סמן את 'נרמול' ולחץ על 'אשר' כדי להחיל את טכניקת שיפור הניגודיות כדי לקבל תמונת C1Zplane מנורמלת עם ניגודיות. עבור אל התהליך ולחץ על מצא מקסימה כדי לפלח את תאי האפיתל בתמונה C1Zplane מנורמלת בניגוד.
לאחר מכן, כדי לייחס נקודת מקסימום אחת בלבד לכל תא אפיתל, סמן את בחירת נקודת התצוגה המקדימה והגדר את עמידות הרעש. לקבלת התמונה המקוטעת C1Zplane, תמונה חדשה דמוית מסיכה בינארית המציגה כל חלקיק מקוטע לכל נקודת מקסימה מסומנת, סמן את המקסימום אל תכלול קצוות, בחר בחלקיקים המקוטעים כסוג פלט ולחץ על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן, צור מסיכה של תאים מקוטעים בתמונה המקוטעת C1Zplane. לחצו על 'נתח', ולאחר מכן על 'נתח חלקיקים', ואחר כך בחרו באפשרויות 'הצג מסיכות' ו'אל תכלול בקצוות'.
קבעו את מרווח הגודל ולחצו על 'אשר' כדי לקבל את המסיכה של מסיכה בינארית מקוטעת C1Zplane. לחץ על טבלת בדיקת המידע ובחר הפוך טבלת בדיקת מידע בסרגל הכלים. כדי לספות את תמונת C1Zplane המנורמלת בניגודיות, עבור אל התמונה, בחר התאם, בחר סף ובדוק את הרקע הכהה.
הגדר את הגדרת הסף האוטומטי כברירת מחדל ובחר באפשרות האדומה. התאם את ערך החיתוך המינימלי עד שהתאים יופיעו אדומים לחלוטין, וישאיר רקע כהה. לחץ על Apply (החל) כדי להמיר את תמונת C1Zplane המנורמלת בניגודיות לתמונה בינארית עם תאים בלבן והרקע בשחור.
יתר על כן, כדי לתקן את סגמנטציית התאים במסכה של מסיכה בינארית מקוטעת C1Zplane, בחר תהליך ולחץ על מחשבון התמונה. לאחר מכן, בחר את המסיכה של C1Zplane מקוטעת כתמונה אחת, בחר את הפעולה AND ברשימה הנפתחת, ובחר את C1Zplane המנורמל בניגודיות סף כתמונה שתיים. לחץ על אישור ו- ImageJ ייתן באופן אוטומטי שם לתמונת הפלט כתוצאה של מסיכה של C1Zplane מקוטע.
כדי לתייג כל תא מפולח של C1Zplane כאזור עניין, לחץ על נתח ולאחר מכן על נתח חלקיקים. התאם את הגודל כפי שהודגם קודם לכן ובחר באפשרות הצג כלום. הוסף את כל החלקיקים לכלי מנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי סימון האפשרות הוסף למנהל.
כמו כן, סמן את אל תכלול בקצוות ולחץ על אישור. שמור את נתוני ההחזר על ההשקעה כ- roi-cells-acquisitiontitle. עבור על תפריט מנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על עוד ובחירה באפשרות שמור. לאחר סיום סגמנטציית התאים, עבדו על חלון הכותרת של רכישת C2 כדי לנתח סלמונלה vacuolar.
ראשית, עבור אל תהליך, לחץ על מחשבון תמונה, בחר את כותרת הרכישה C2 כתמונה אחת ובחר את הפעולה הפחת ברשימה הנפתחת. לאחר מכן, בחר את כותרת הרכישה C3 כתמונה שתיים, סמן את צור חלון חדש ולחץ על אישור. החל חיסור על כל ערימת Z על-ידי לחיצה על כן בחלון מחסנית תהליכים. שכפל את התוצאות של חלון הכותרת של רכישת C2 על ידי לחיצה על תפריט תמונה ובחירה באפשרות שכפל.
לאחר מכן בדוק את המחסנית הכפולה ולחץ על אישור כדי לקבל את התוצאות של רכישת C2 כותרת חלון אחד. החל טשטוש גאוס על התוצאות של חלון אחד של רכישת C2 על-ידי מעבר אל תהליך, לחיצה על המסנן ובחירה בטשטוש גאוס. השאר את ערך הסיגמא כשני או התאם אותו אישית.
לחץ על אישור והחל טשטוש גאוס על כל ערימת Z על ידי לחיצה על כן בחלון מחסנית תהליך. הפחת את התוצאות המסוננות של גאוס של כותרת רכישת C2 לתוצאות של כותרת הרכישה C2 על ידי לחיצה על תהליך ובחירה במחשבון התמונות. כעת בחר את התוצאות של כותרת רכישת C2 כתמונה אחת, בחר את הפעולה הפחת ברשימה הנפתחת, בחר את התוצאות של כותרת רכישת C2 כתמונה שתיים ולחץ על אישור. החל חיסור על כל אוסף Z על-ידי לחיצה על כן בחלון Process Stack כדי לקבל חלון שנקרא באופן אוטומטי על-ידי ImageJ כתוצאה מתוצאות של כותרת רכישת C2.
כדי להפריד סלמונלה מהרקע של תוצאות הכותרת של רכישת C2, לחצו על התמונה, בחרו 'התאמה' ולחצו על 'סף'. לאחר מכן, בדוק את הרקע הכהה והגדר את הסף האוטומטי ל- Otsu. התאם את ערך החיתוך המינימלי עד שהסלמונלה תופיע אדומה לחלוטין, ותשאיר רקע כהה.
לחץ על החל וחלון בשם המר לבינארי ייפתח. בדוק את הרקע השחור ולחץ על אישור. בחר את מישור Z האמצעי המתאים למישור המיקוד התוך-תאי של סלמונלה בתוצאות של חלון בינארי של כותרת רכישת C2. לחצו על התמונה ואחריה 'אוספים' ולאחר מכן בחרו 'קבע פרוסה'.
כעת כתוב את מספר מישור Z המועדף ולחץ על אישור. לאחר מכן, הגדר את המדידות לרישום עבור כל ROI על-ידי לחיצה על נתח ובחירה באפשרות קבע מדידה. לאחר מכן, בדוק את השטח המתאים לשטח הכולל של כל החזר על ההשקעה. כדי לרשום את שבר השטח שנכבש על-ידי פיקסלים עם סף עבור כל החזר על ההשקעה, בדוק את שבר השטח ואת ההגבלה לסף.
בדוק את תווית התצוגה כדי להוסיף תווית לכל החזר השקעה בודד עם כותרת התמונה, הערוץ, מישור Z וקואורדינטות X/Y. השתמש במישור Z הנבחר של סלמונלה תוך-תאית כדי להקליט לייבלים, שטח ואחוז שטח שנכבש על ידי סלמונלה עבור כל תא. פתח את ה- roi-cell-acquisitiontitle.
קובץ zip על-ידי לחיצה על תפריט קובץ ובחירה באפשרות פתח. לאחר מכן, לחץ על מדידה בתפריט מנהל ההחזר על ההשקעה. הפלט הוא טבלה המדווחת על המדידות שנבחרו.
לבסוף, שמור את טבלת התוצאות על ידי בחירת הקובץ ולחיצה על שמירה בשם בחלון התוצאות. הפלישה התאית, עומס הוואקולאר וההיפר-שכפול הציטוזולי של סלמונלה הודגמו בתוך תאי אפיתל. ניתוח האזור גילה יחס זיהום גבוה משמעותית בסלמונלה טיפימוריום בהשוואה לשני זני סלמונלה דרבי, והדגים את היעילות של ניתוח שטח באיתור הבדלים ביכולתם של זני סלמונלה ליישב תאי אפיתל.
זן מוטנטי שנמחק מדרבי סלמונלה sipA הציג יחס היפר-שכפול מופחת בהשוואה לסלמונלה דרבי פראי, התואם את התפקיד של sipA בגרימת שכפול יתר. לא נצפה הבדל של שכפול יתר בין סלמונלה טיפימוריום לבין סלמונלה דרבי מסוג פראי. הניתוח החד-תאי לא הראה הבדל משמעותי באחוז התאים הנגועים בזני סלמונלה דרבי בהשוואה לסלמונלה טיפימוריום.
אחרת, זני סלמונלה דרבי יצרו עומס vacuolar ממוצע נמוך משמעותית מסלמונלה טיפימוריום. לא נצפה הבדל בין סלמונלה טיפימוריום לסלמונלה דרבי פראי, בעוד סלמונלה דרבי sipA הציגה ירידה משמעותית בשכפול יתר, בהתאם לתוצאות ניתוח האזור. סלמונלה כוללת מספר סרוברים עם אלימות מגוונת.
חקירת מספר גדול של זנים בשיטה מהירה ואוטומטית זו תורמת באופן משמעותי להבנת פוטנציאל הווירוליות האמיתי של הפתוגן הזה.
