עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת בית החולים של והשליט (Liege צ'ו). אנו להכיר "הרגעים הפקות" עבור הפקת הסרטון. אנו גם להכיר סדריק פרנסואה, המטופל שהופיע בסרט.

כל השיטות המתוארות בסעיף זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים והשליט של אוניברסיטת ונתן בכל המקצועות בריא בכתב הסכמה מדעת להשתתפות.
1. ברוק אינדוקציה
<ol>
	<li>ספירומטריה מראש, שלאחר למצוקת
	<ol>
		<li>לבצע ספירומטריה (הכריחו נפח expiratory בשנייה 1 [FEV1] ולתמרן חיוניים בכפייה קיבולת [FVC]) על פי החברה הגבילו אמריקאי (ATS) / הקריטריונים הסטנדרטיים החברה בדרכי הנשימה האירופי (ERS)12.</li>
		<li>לנהל µg 400 של סאלבוטאמול בשאיפה מ משאף במינון מוניות (MDI) דרך התקן מרווח. הערה: אצל מבוגרים, תיעודו של סאלבוטאמול בשאיפה כוללות רעד וקצב13.</li>
		<li>חזור ספירומטריה (FEV1 ולתמרן FVC) 15 דקות מאוחר יותר, על פי הקריטריונים הסטנדרטיים ATS/ERS12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנת מפוחים אולטראסוניות הערה: מפוחים צריך ביסודיות לנקות ולשמור נקיים לפני כל שימוש, בהתאם להוראות היצרן.<ol>
		<li>למלא את התא מפוחים עם מים מזוקקים עד לרמה המומלצת.</li>
		<li>מניחים כוס נקי בבית הבליעה מפוחים.</li>
		<li>מכסים את הספל עם המכסה המתאים.</li>
		<li>למלא את הכוס גם 50 מ של לקילו (5%) לחולה עם למצוקת שלאחר FEV1 &#62; 65% חזה או 50 מ ל תמיסת מול (0.9%) לחולה עם למצוקת שלאחר FEV1≤65% חזה.</li>
		<li>להוסיף 1.75 מ של פתרון סולפט סאלבוטאמול (5 מ"ג/מ"ל) בגביע.</li>
		<li>לחבר את צינורות ושסתומים בהתאם להוראות היצרן.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>אוסף nebulization וברוק הערה: בצע את הטכניקה תחת השגחה רפואית.<ol>
		<li>להסביר את ההליך למטופל.</li>
		<li>בקש מהמטופל להשתמש סרטון האף.</li>
		<li>הפעלת מפוחים ובחר ברמה הנמוכה ביותר של הגדרות תרסיס ומאוורר.</li>
		<li>בקש מהמטופל לשאוף בתרסיס דרך היצירה הפה עם הנשימה גאות במשך 5 דקות. הערה: תרסיס והגדרות מאוורר ניתן להגדיל בהתאם הסובלנות של המטופל.<ol>
			<li>במקרה של שיעול בלתי נסבל או בחילה, להפסיק את ההליך, עבור לשלב 1.3.5.</li>
			<li>במקרה של לחץ בחזה או אי נוחות בדרכי הנשימה, עבור לשלב 1.3.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>. כבה את מפוחים.</li>
		<li>בקש מהמטופל כדי להסיר את הסרטון האף, לשטוף את הפה עם מים, לגרגר פעמיים לפני השלכת אותו בכיור. הערה: רוק התאים עשויים לזהם את הדגימה ברוק, להוביל דוגמה לא שמיש.</li>
		<li>בקש מהמטופל להשתעל sputum לתוך מיכל פלסטיק.</li>
		<li>לבצע ספירומטריה (תמרון expiratory בכפייה) כדי למדוד FEV1.</li>
		<li>להעריך את האשמה1 FEV כדלקמן: (נמדד FEV1 צעד 3.8 [mL]) - (למצוקת שלאחר FEV1 נמדד בשלב 1.3 [mL]) / (למצוקת שלאחר FEV1 נמדד בשלב 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>אם ה FEV1 נופל על-ידי 20% או יותר מהערך למצוקת שלאחר, להפסיק את ההליך. למדוד FEV1 שוב 10 דקות מאוחר יותר. אם ה FEV1 נופל 20% או יותר, שאל את הרופא לנהל nebulized ipratropium ברומיד (0.25 מ"ג/2 מ"ל) ולשמור את החולה תחת השגחה רפואית. עבור לשלב 1.3.10.</li>
			<li>אם ה FEV1 לא נופל על-ידי 20% או יותר מהערך למצוקת שלאחר, חזור על שלבים 3.2 ל 3.9 אחת עד שלוש פעמים כדי להגיע בזמן nebulization סך של 10 עד 20 דקות. הערה: הזמן הכולל nebulization תלויות באיכות (נוכחות של פקקים או חלקים צמיגה) והן את כמות הדגימה ברוק. אם לדוגמה איכות ו/או כמות של עניים אחרי 10 דקות של nebulization, ההליך צריך ניתן להרחיב כדי להגיע בזמן nebulization סך של 15 עד 20 דקות.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>שמור את הדגימה sputum בקירור עד עיבוד.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. ברוק עיבוד
הערה: תהליך ברוק בתוך 3 שעות של דגימה עבור תא אופטימום הכדאיות.
התראה: ללבוש חלוק מעבדה, כפפות מגן ומשקפי מגן.
<ol>
	<li>הכנות ראשוניות
	<ol>
		<li>לגרום לדילול 10-fold הפתרון dithiothreitol מרוכז (סוכן mucolytic) עם מים מזוקקים סטריליים כדי לקבל 10 מ של פתרון 6.5 מ מ, בהתאם להוראות היצרן. הערה: על מנת למנוע פתרון dithiothreitol מרוכז ערבוב עם אויר, למשוך את הפתרון המבחנה עם מזרק סטרילי ואת המחט. ברגע שנפתח, המבחנה תמיסה מרוכזת חייב להיות לשמור בטמפרטורת החדר ולא להשתמש בו בתוך 5 ימים. הפתרון מדולל מוכן מדי יום. התראה: בגלל הסכנה לגירוי העין ועור, ללבוש ציוד מגן (ביגוד, כפפות, משקפי מגן).</li>
		<li>לגרום לדילול 5-fold הפתרון trypan blue (0.4%) עם Dulbecco Phosphate-Buffered מלוחים (DPBS) כדי לקבל פתרון 0.08%. לשמור על הפתרון מדולל בטמפרטורת החדר ולהשתמש בתוך 2 שבועות. שים לב: בשל סיכונים מסרטנים, ללבוש ציוד מגן (ביגוד, כפפות, משקפי מגן).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>אוסף של ברוק תגובת שיקוע
	<ol>
		<li>העברת ברוק כולו בתוך צינור פלסטיק 50 מל-התחתון חרוט ולשקול את הדגימה.</li>
		<li>להוסיף משקל 3-fold של DPBS פתרון.</li>
		<li>אט-אט מערבולת המדגם ב-30 s.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
		<li>לסנן את הדגימה דרך 2 שכבות יחידה של גזה סטרילית ולאסוף את תגובת שיקוע של צינור פלסטיק 50 מל-חרוט התחתון.</li>
		<li>Aliquot תגובת שיקוע בפלסטיק 2 mL צינורות ואחסן אותם ב- 80 ° c הערה: דוגמאות Supernatant שימושיים assay sputum שלב נוזל רכיבים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mucolysis ברוק
	<ol>
		<li>אם יש צורך, להוסיף DPBS בגדר תא להגיע הנפח הכולל של התא השעיה של 5 מ.</li>
		<li>לדלל התליה תא עם נפח 1 של 6.5 מ מ dithiothreitol. השתמש רוקר ספסל יפציץ התליה תא עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.<ol>
			<li>חזור על פחות 3 פעמים עם DPBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Centrifuge התליה תא מדולל ב 550 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li></ol></li></ol>למחוק את תגובת שיקוע.
		<li>Resuspend בגדר תא בבסביבות 1 מ"ל של DPBS.</li>
	
	
	<li>הערכה של מאפייני המדגם ברוק (ריכוז תאי קשקש זיהום, הכדאיות בשיטה הדרה Trypan Blue) על-ידי ספירת hemocytometer איכותי
	<ol>
		<li>להעריך ולהקליט את עוצמת הקול המדויק של התליה תא.</li>
		<li>להוסיף 50 µL של השעיה תא µL 50 של הפתרון trypan blue 0.08%, homogenize.</li>
		<li>שים המדגם תחת coverslip של hemocytometer (Thoma קאמרית) ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ אופטי (400 X).</li>
		<li>לספור תאים קשקשיים תאים קשקשיים-שאינו חי (תאי צבע), תאים מתים שאינם קשקשיים (תאים בצבע כחול). הערה: במקרה של צפיפות התאים נמוך מדי או גבוה מדי, להתרכז או לדלל התליה תא וחזור על שלבים 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>להעריך את התא ריכוז ההשעיה, האחוז של תאים קשקשיים ו האחוז של הכדאיות של תאי קשקש. הערה: לחשב את סך הלא-קשקש הספירה/g של ברוק: התא ריכוז של המתלה (שלב 5.4) * נפח של התליה תא (שלב 4.8) * אחוז תאי קשקש / משקל של המדגם ברוק (שלב 2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנת cytospin ויטראז'ים שקופיות עם תא ההשעיה, אחסון של תאים שיורית, במידת הצורך הערה: אם התליה תא מכיל יותר מ 80% קשקשיים תאים, המדגם נחשב עני איכות מתאים cytospin שקופית14. במקרה זה, הפסק העיבוד ולשקול את הדוגמית הזו לא מוצלח.<ol>
		<li>לדלל עם aliquot של התליה תא עם DPBS כדי לקבל לפחות 350 µL של השעיה תאים-תאים למ"ל 500,000.</li>
		<li>להרכיב את רכז תא בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>למלא כל אחד תאי 3 במסוע תא µL 100 של השעיה התא הזה.</li>
		<li>ב cytocentrifuge, ספין למשך 2 דקות ב 150 x g ובטמפרטורת החדר. למחוק את supernatants.</li>
		<li>לפרק את רכז תא בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>לאפשר השקופית כדי אוויר יבש. הערה: בשלב זה, תאים שיורית ניתן לאחסן מאגר הולם במידת הצורך לניסויים נוספים.</li>
		<li>כתם השקופית עם צביעת מסחרי קיט (ראה את הטבלה של חומרים), בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>טעינת השקופית עם מדיום הרכבה מתאים ועם מכסה.</li>
		<li>מקם את השקופית תחת המיקרוסקופ האופטי (600 X) עם שמן טבילה.</li>
		<li>לספור תאים שאינם קשקשיים לפחות 500: נויטרופילים, אאוזינופילים, מקרופאגים, לימפוציטים ותאי אפיתל. הערה: ספירת התאים דיפרנציאלית מתבצע בדרך כלל על ידי היחידה או שניים ייעודי מאומן משקיפים להגבלת סתירות interobserver.</li>
		<li>הערכים המוחלטים הרשומה והאחוזים של כל סוג התא.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+sputum+cell+counts:+their+usefulness+in+clinical+practice.">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li><li>Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+induced+sputum+to+investigate+airway+inflammation.">The use of induced sputum to investigate airway inflammation.</a> Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).</li><li>Leigh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+induction+for+diagnosis+of+Pneumocystis+carinii+pneumonia.">Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia.</a> The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).</li><li>Pin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+induced+sputum+cell+counts+to+investigate+airway+inflammation+in+asthma.">Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma.</a> Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).</li><li>Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanovi&#263;, R., Sterk, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+sputum+induction.">Safety of sputum induction.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).</li><li>Delvaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nebulised+salbutamol+administered+during+sputum+induction+improves+bronchoprotection+in+patients+with+asthma.">Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma.</a> Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).</li><li>Efthimiadis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+sputum+processing+for+cell+counts,+immunocytochemistry+and+in+situ+hybridisation.">Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).</li><li>Kelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fluid-phase+mediators.">Analysis of fluid-phase mediators.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).</li><li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+sputum:+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways.">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li><li>Vignola, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+directions.">Future directions.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).</li><li>Brightling, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+induced+sputum.">Clinical applications of induced sputum.</a> Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).</li><li>Miller, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+spirometry.">Standardisation of spirometry.</a> European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).</li><li>Szefler, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asthma+outcomes:+biomarkers.">Asthma outcomes: biomarkers.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).</li><li>Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-eosinophilic+asthma:+importance+and+possible+mechanisms.">Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms.</a> Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).</li><li>Schleich, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+concomitant+local+and+systemic+eosinophilia+in+uncontrolled+asthma.">Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma.</a> The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).</li><li>Demarche, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+sputum+and+systemic+inflammation+in+asthma+phenotypes:+are+paucigranulocytic+asthmatics+really+non-inflammatory?.">Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory?.</a> BMC pulmonary medicine. 16, 46 (2016).</li><li>Pavord, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+assessment+of+airway+inflammation+using+induced+sputum.">Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum.</a> The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s (2002).</li><li>Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+biomarkers+in+IPF:+Evidence+for+raised+gene+expression+and+protein+level+of+IGFBP-2,+IL-8+and+MMP-7.">Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0171344 (2017).</li><li>Green, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asthma+exacerbations+and+sputum+eosinophil+counts:+a+randomised+controlled+trial.">Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial.</a> Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).</li><li>Siva, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophilic+airway+inflammation+and+exacerbations+of+COPD:+a+randomised+controlled+trial.">Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial.</a> European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).</li><li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+infiltration,+ICAM-1+expression,+and+eosinophil+chemotactic+activity+in+asthmatic+sputum.">Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).</li><li>Maes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asthma+inflammatory+phenotypes+show+differential+microRNA+expression+in+sputum.">Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).</li><li>Moermans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+systemic+cellular+inflammation+and+cytokine+release+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).</li><li>Gibson, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+induction+in+children.">Sputum induction in children.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).</li><li>Reddel, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Official+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society+Statement:+Asthma+Control+and+Exacerbations:+Standardizing+Endpoints+for+Clinical+Asthma+Trials+and+Clinical+Practice.">An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).</li><li>Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+eosinophil+apoptosis+in+induced+sputum+correlates+with+asthma+severity.">Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity.</a> The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).</li><li>Demarche, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asthma+Control+and+Sputum+Eosinophils:+A+Longitudinal+Study+in+Daily+Practice.">Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).</li><li>Belda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+sputum+cell+counts+in+healthy+adults.">Induced sputum cell counts in healthy adults.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).</li><li>Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+airway+neutrophilia+and+ageing+in+asthmatics+and+non-asthmatics:+Airway+neutrophilia+and+ageing.">Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing.</a> Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).</li><li>Thomas, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+age+on+induced+sputum+differential+cell+counts+in+normal+subjects.">The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects.</a> Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).</li><li>Chalmers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoking+and+airway+inflammation+in+patients+with+mild+asthma.">Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma.</a> Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).</li><li>Hansel, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Evaluation+of+Nasal+and+Bronchial+Cytokines+and+Chemokines+Following+Experimental+Rhinovirus+Infection+in+Allergic+Asthma:+Increased+Interferons+(IFN-&#947;+and+IFN-&#955;)+and+Type+2+Inflammation+(IL-5+and+IL-13).">A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-&#947; and IFN-&#955;) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13).</a> EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).</li><li>Popov, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+technical+factors+influencing+the+induction+of+sputum+for+cell+analysis).">Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis).</a> European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).</li><li>Holz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+sputum+composition+between+two+inductions+performed+on+consecutive+days.">Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days.</a> Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).</li><li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+processing+on+inflammatory+markers+in+induced+sputum.">The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum.</a> European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).</li><li>Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects.">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li><li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum:+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination.">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה sputum המושרה היא כלי שימושי ללמוד תא דרכי הנשימה. ישנם מספר יישומים אפשריים של טכניקה זו. קודם כל, זה עשוי לשפר את הידע על תאים חיסוניים ומנגנונים מעורב מחלות נשימה שונות. לדוגמה, טכניקה זו אפשרה את החקירה של דלקת דרכי הנשימה ב קוהורטות גדולות של חולים, ולא הוכח כי כמחצית מהמטופלים אסתמה מאופיינים של הנשימה נורמלית דלקת אאוזינופילית15, 16 , 17, ואילו מטופלי COPD מוצג בדרך כלל של נויטרופילים sputum מוגבה סופר18. טכניקה זו תרמה גם אפיון טוב יותר של דלקת דרכי הנשימה בחולים עם idiopathic פיברוזיס ריאתי, מגשרים ראיות שעשויים לתרום זו מחלה19. שנית, בטכניקה של ברוק המזורזת עשויה להיות שימושית לחזות את התגובה לטיפול. לדוגמה, נוכחות אחוז חריג של אאוזינופילים sputum הוכח להיות סמן ניבוי של הסטרואידים תגובתיות11,18. אסטמה, COPD, התאמת המינון של קורטיקוסטרואידים לנרמל את האחוז של אאוזינופילים sputum הוצגה להיות יותר יעיל בהפחתת מספר exacerbations מאשר התאמת הטיפול על פי הנחיות קליניות הנוכחי11 20, ,21. שלישית, ניתוח sputum עשוי לעזור לפתח טיפולים ממוקדים. לדוגמה, הנוכחות של מספר חריג של ברוק נויטרופילים ב כמה חולי אסתמה ו- COPD הוביל לפיתוח טיפולים antineutrophilic11. רביעית, הטכניקה עשויים לשחק תפקיד באבחון. לדוגמה, הנוכחות של אאוזינופיליה sputum יש צורך לערוך אבחנה של אי-אסטמה ברונכיט אאוזינופילית11.
מלבד קבלת ספירה מבדלת תא, בטכניקה של גרימת sputum מאפשר גם את הביצועים של ניתוחים נוספים רבים, על ידי לימוד sputum supernatant או תאים ברוק. דוגמאות עם sputum supernatant כוללים הניתוח של מגשרים8,19,22 , את ההערכה של הפעילות chemotactic של המדגם אאוזינופילים22. מתאי ברוק, RNA יכול חילוצם ואופן המשמש microRNA או ביטוי גנים מנתח19,23 . ניתן גם לנתח את התאים sputum מאת לזרום cytometry9,23 המאפשר, בין היתר, תאים immunophenotyping ומיון. יתר על כן, ברוק תאים יכול להיות בתרבית10, ייצורם מתווך יכול להיות נמדד במבחנה24. ראוי לציין כי במקרה זה, תוכן המתווך הוא שונה מכל מה ניתן למצוא ברוק supernatant. אכן, מגשרים בברוק supernatant עשוי להיות מושפע על ידי הפרשות דרכי הנשימה תאים תושב ועל ידי exudation פלזמה, בניגוד דגם24תרבות תא ברוק. לבסוף, immunocytochemistry וב -באתרו הכלאה גם ניתן לבצע באמצעות תאים sputum7.
הטכניקה sputum המושרה יש מספר מגבלות. אינדוקציה חייב להתבצע תחת פיקוח רפואי. זה חיוני גם באופרטור לתת הוראות יסודיות לחולים. מגבלות אחרות כוללות את שיתוף הפעולה ואת מצבו הרפואי של חולים, מאמצים במערכת הנשימה. בנוגע להיתכנות של טכניקה זו אצל ילדים, מספר מחקרים דיווחו שזה היה מוצלח ובטוח לילדים מעל גיל 6 בת25. נתונים על ילדי &#60; 6 שנים של גיל חסרים25, אך סביר כי sputum אינדוקציה היא קשה לבצע את הילדים האלה14. הטכניקה היא מוגבל ומרכזים שירותים מיוחדים כי זה טכנית תובעניים, זמן רב, וזה דורש צוות מיומן1. מגבלה נוספת היא כי הטכניקה של אינדוקציה sputum וניתוח אינה תמיד מוצלח, כלומר כי cytospin קריא לא תמיד מתקבל26. אולם, שיעור ההצלחה הוא בדרך כלל בסביבות 80% בגדודים שונים של מטופלים4,26,27,28,29. בסופו של דבר, זהירות יש לנקוט בעת השוואת גדודים שונים של חולים בדבר ההתאמה בין גיל כמו זה הוצג לפגיעה30,31ספירת תאים sputum. באופן דומה, פרמטרים אחרים כגון הרגלי מין וטבק צריך להיות מתאימים כפי הם גם עלולים להפריע29,32ספירת תאים ברוק. בעת התאמת המטופל אינו אפשרי, דרך נוספת לקחת לגיל, מין או מצב עישון בחשבון היא להתאים את ניתוח סטטיסטי עבור מאפיינים אלו.
השיטה sputum המושרה לעומת טכניקות אחרות, המאפשרים איסוף תאי איירווייז, ביופסיות, bronchoalveolar lavages, יש את היתרונות של להיות פשוטה נסבל היטב, בטוח, לשחזור, חסכונית, לא פולשנית. יתרונות אלה מאפשרים את הטכניקה sputum המושרה להתבצע ב בקנה מידה גדול, שוב ושוב לאורך זמן, ולהפוך אותו חלופה של בחירה עבור הדגימה את דרכי הנשימה. Bronchosorption היא טכניקה נוספת ומאפשר את האוסף של הנוזל שורות mucosal כדי להעריך את דרכי הנשימה מגשרים33. אמנם שיטה זו (דרישת ברונכוסקופיה) פולשניים יותר מאשר sputum המושרה, יש את היתרונות של הימנעות כל זיהום עם הרוק וקבלת ריכוז גבוה של מגשרים מאשר ב שטיפת bronchoalveolar33.
פעולות קריטיות צריך תשומת לב בפרוטוקול. ראשית, שים לב חייב להילקח בדבר ריכוז מלח ואת הזמן של אינדוקציה, כי אלה שני פרמטרים יכול להשפיע על התוצאות ולכן צריך להיות מתוקנן34,35. שנית, mucolysis עם DTT היא צעד חשוב של העיבוד. לעומת PBS, הוצגה DTT כדאי לפזר sputum תאים7, אשר משפר את איכות השקופית cytopsin חיוני יש ספירת תאים לשחזור2. עם זאת, הסוכן mucolytic עלולים להפריע המדידה של רכיבים הביוכימי.עולה ניסויים ואז לבצע בעת מדידת תרכובת ביוכימית36חדש. לבסוף, צעד קריטי נוסף של ההליך היא התא ספירת צעד, אשר חייב להתבצע על ידי טכנאי מוסמך כדי להבטיח תוצאות interpretable ואמין.
שיטה חלופית באמצעות sputum תקעים (חלקים viscid או צפופה), במקום ברוק שלמה, המתואר גם ספרות7. בשתי הטכניקות יש יתרונות וחסרונות. הטכניקה sputum כל מאפשר מהירה יותר עיבוד7, אך לעתים קרובות מזוהם עם הרוק, אשר מדללת את הדגימה, יכול להפחית את האיכות של2,cytospins7. עם הטכניקה הבחירה הכנס, הזיהום רוק מופחת, מה שאומר כי דגימות לעיתים קרובות באיכות טובה יותר את המינון של מתווכים פאזה נוזלית ועבור שקופיות cytospin7. העיבוד עם זאת עוד7 , תקעים שנבחר לא יכול להיות נציג של כל מדגם37. . זה גם ראוי לציין כי לא כל דוגמאות מכילים תקעים, אשר יכולים להיות הגבלת... שתי השיטות הן המאומת לשחזור, ויש כיום אין ראיות כי הסעיפים תא דיפרנציאלית המתקבל שתי השיטות האלה הם שונים14,38.
בעתיד, sputum המושרה יכול לשמש ככלי קליני כדי לספק סמנים ביולוגיים החקירה, אבחון וניהול של כל מיני מחלות דלקתיות במערכת הנשימה.

מספר שיטות משמשים כדי לחקור דלקת דרכי הנשימה: ישיר מדידות (כמו ביופסיות הסמפונות או bronchoalveolar lavages), שיטות עקיפות (כמו הערכה סימפטום, דם מדגם ניתוח ויצירת ריאה תפקודי)1. הטכניקות ישירה יש את היתרון של אמין הערכת הדלקת של דרכי הנשימה, אבל הם פולשנית, לא ריאלי בקנה מידה גדול בגלל נוחות המטופל, הסיכון שיגרמו1. לגבי שיטות עקיפות, הם לקוי לתאם עם בחינה ישירה של דלקת דרכי הנשימה1.
אוסף sputum דרך נוספת לתאים מדגם של דרכי הנשימה ומאפשר את ההערכה ישירה של דלקת דרכי הנשימה. למרות זאת, בהפקת sputum באופן ספונטני עלול להוביל דגימות של איכות ירודה, אינה אפשרית עבור חולים כל2. יש כבר להתגבר על בעיה זו על-ידי שימוש ultrasonically nebulized היפרטונית כדי לעודד את ייצור sputum2. שיטה זו שימשה בתחילה בחולים נגוע וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) לאבחון של דלקת ריאות Pneumocystis carinii 3 , הותאמה עבור חולי אסטמה 19924והנושאים בריא. ברוק אינדוקציה היא גם אפשרית בחולים חמורות יותר באמצעות מלוחים מול5. אמנם בדרך כלל נסבל היטב, שאיפת תמיסת מלח עלולה לגרום לעווית הסימפון בחולים עם hyperresponsive איירווייז5. לכן, מומלץ לנהל אגוניסט בטא קצרת לפני ההליך1. יתר על כן, אנו בעבר הראו כי הוספת סאלבוטאמול תמיסת מלח ב מפוחים אולטראסאונד נוסף ירד זה סיכון6. היתרונות של ברוק אינדוקציה היא כי זה לא פולשנית2 בטוח בעת הצורך באמצעי זהירות נלקחים5.
עיבוד sputum דגימות, שתי שיטות משמשים כיום בספרות: הטכניקה כל ברוק, את הבחירה של הכנס7. במעבדה שלנו, הטכניקה sputum כולו מתבצע. המטרה העיקרית של עיבוד ברוק היא כדי לקבל ספירת תאים דיפרנציאלית ללמוד את הסוג של דלקת נוכח לומן דרכי הנשימה. עם זאת, רבים ניתוחים נוספים הינם אפשריים להמשיך לחקור תהליכים דלקתיים ומנגנונים המערכת החיסונית, על ידי לימוד מגשרים sputum supernatant8 או על-ידי ביצוע חקירה מפורטת על תאים ברוק (למשל , flow cytometry9, תרביות תאים10, גנומיקה10, פרוטאומיקס10, immunocytochemistry7, בחיי עיר הכלאה7, וכד')
הטכניקה של אינדוקציה sputum וניתוח מוגבלת כעת ומרכזים שירותים מיוחדים הקלינית כי היא תובענית מבחינה טכנית, זמן רב, והיא דורשת צוות מיומן1. דלקת דרכי הנשימה עשוי להיחקר בשיטה זו עבור מחלות שונות בדרכי הנשימה כמו אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), שיעול כרוני או idiopathic פיברוזיס ריאתי11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1223">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Spirometer - Spirobank</td>
			<td style="width:265px;">MIR France</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:305px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salbutamol MDI - Ventolin</td>
			<td>GLAXOSMITHKLINE</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 0135-913</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Nebulizer UltraNeb</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td>UltraNeb U3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Devilbiss UltraNeb Disposable Cups &#38; Lids</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td>100HD-647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td style="width:140px;">1001005879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">One-way Valves</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">One-way Valves</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Aerosol T-connector&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Ventilation circuit monobranch corrugated</td>
			<td style="width:265px;">Int&#39;Air Medical France</td>
			<td style="width:140px;">TA30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl 5 %&#160;</td>
			<td style="width:265px;">/</td>
			<td style="width:140px;">/</td>
			<td style="width:305px;">Produced by our hospital pharmacy</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Mini-Plasco NaCl 0.9%</td>
			<td style="width:265px;">B.Braun Medical&#160; Diegem Belgium</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin</td>
			<td>GLAXOSMITHKLINE</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 0094-987</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent</td>
			<td style="width:265px;">Boehringer Ingelheim Germany</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 1543-305</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:265px;">LONZA Belgium</td>
			<td style="width:140px;">BE17512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Sputolysin reagent</td>
			<td style="width:265px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:140px;">56000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Trypan blue 0.4% solution 100 mL</td>
			<td style="width:265px;">LONZA Bio Whittaker Belgium</td>
			<td style="width:140px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer - Thoma chamber</td>
			<td style="width:265px;">Labor Optik Lancing UK</td>
			<td style="width:140px;">1500000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hemacolor Stainig set</td>
			<td style="width:265px;">Merck Belgium</td>
			<td style="width:140px;">1116610001</td>
			<td style="width:305px;">Alternative product&#160; : Diff Quik Staining Set 
			&#160;Medion Diagnostic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium - Entellan</td>
			<td style="width:265px;">Merck Belgium</td>
			<td style="width:140px;">107960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Statspin Cytofuge 12&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Beckman Coulter Belgium</td>
			<td>X00-003066-001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for sputum induction and laboratory processing

הטכניקה של אינדוקציה sputum ועיבוד היא שיטה לא פולשנית מוכר המאפשר איסוף וניתוח של תאים של דרכי הנשימה, וזה מעניין למחלות שונות בדרכי הנשימה כמו אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), שיעול כרוני או idiopathic פיברוזיס ריאתי. טכניקה זו היטב נסבל, בטוחה, לא פולשנית, אך מוגבלת כעת שירותי מחקר ומרכזי מתמחה באימון קליניים כי היא תובענית מבחינה טכנית, זמן רב, והיא דורשת צוות מיומן. שיעור ההצלחה של אינדוקציה sputum וניתוח הוא כ- 80%.
כאן, אנו מתארים עיבוד אינדוקציה והמעבדה sputum דגימות. ברוק הנגרמת על ידי שאיפת תמיסת hypertonic או מול עם סאלבוטאמול. עיבוד, אנו משתמשים בטכניקה sputum שלם. Dithiothreitol (DTT) משמש כדי לאפשר mucolysis של ברוק דגימות. המטרה העיקרית של עיבוד ברוק היא כדי לקבל ספירת תאים דיפרנציאלית ללמוד את סוגי תאים נוכח לומן דרכי הנשימה. ניתן לבצע ניתוחים נוספים גם על ברוק supernatant ותאים ברוק, אשר עשוי לאפשר את המשך בחקירת תהליכים דלקתיים, מנגנונים חיסוניים. דוגמאות כוללות לומד מגשרים בברוק supernatant וביצוע מגוון גדול של ניתוח בתאי sputum כגון cytometry זרימה, גנומיקה או פרוטאומיקס.
לבסוף, מוצגים תוצאות נציג של ניתוח sputum פקדים בריא לחולי אסתמה, מטופלי COPD.

Hemocytometer תמונה אופיינית מוצג באיור 1 זה הוא מדמיין עם המיקרוסקופ באמצעות את hemocytometer. תאים קשקשיים מזוהים בקלות, כפי שהם הרבה יותר גדול מאשר תאי קשקש. אלה תאים קשקשיים הם תאים אפיתל בא מן הפה. שני סוגים של תאים מוכתמות Trypan Blue כאשר מת. זהירות יש לנקוט כדי להימנע ספירת שמרים חיידקים, גרוטאות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
איור 1 : Hemocytometer תמונה המציגה (A) חיים שאינם-קשקש, (B), מת ללא-קשקש ו (ג) הקשקש התא. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
Cytospin שקופית: איור 2 מציג תמונת הנציגה של שקופית cytospin שהושג לאחר העיבוד ברוק. ניתן להבחין את סוגי תאים שונים (נויטרופילים, אאוזינופילים, מקרופאגים, לימפוציטים, ותאי האפיתל) על-ידי הגיוון ומורפולוגיה שלהם. במקרים מסוימים, זיהום על ידי תאים קשקשיים יכול להיות חשוב ונחשבת, אם האחוז של תאים קשקשיים גדול מ- 80%, המדגם לא מוצלח (איור 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
איור 2 : Cytospin שקופית תמונה המציגה (A) של נויטרופילים, (B) macrophage, (ג) eosinophil, (ד) הלימפוציטים, ו- (E) תא אפיתל. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
איור 3 : דוגמה של שקופית cytospin באיכות ירודה עם &#62; 80% של תאים קשקשיים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
אחוזי הצלחה במחלקה שלנו, שיעור ההצלחה של הפרוצדורה (שילוב של אינדוקציה מוצלחת של cytospin קריא), בהתבסס על מדגם של חולים 1,129 (לנסיינים בריאים, חולי אסטמה או מטופלי COPD), 82% (924/1,129). בניתוח משנה בהתאם לסוג של חולים, שיעור ההצלחה הוא 75% (57/76) במקצועות בריאות, 82% (827/1,004) בחולי אסטמה, 82% (40/49) בחולי COPD.
תוצאות במקצועות בריא ב ניתוח רטרוספקטיבי של סדרה של 289 לנסיינים בריאים מהמחלקה שלנו, החציון (טווח בין רבעוני) משקל sputum היה 3.72 g (טווח בין רבעוני של 2.46 g - 5.54 g), ספירת החציוני הכולל הלא-קשקש/g של ברוק 0.59 x 106 ( טווח בין רבעוני של 0.37 x 106 - 1.29 x 106).
בנושאים האלה בריאים, חלקם של תאים קשקשיים הוא נמוך ב- 19% (10% 34%) והוא הכדאיות בגובה של 66% (54-78%). לגבי האחוז של סוגי תאים שונים, תוצאות מסוכמות באיור 4A. ניתן להבחין כי האחוז של מקרופאגים (49% [31-68%]) הוא גבוה יותר מאשר האחוז של נויטרופילים (34% [14% - 60%]), ואילו האחוזים של לימפוציטים (2% [1-3%]), אאוזינופילים (0% [0% 0%]) ותאי אפיתל (4% [2-11%]) נמוכים. תוצאות אלו דומים כאשר הנתונים מבוטאים בערכים מוחלטים (איור 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
איור 4 : התוצאות נציג של ספירת דיפרנציאלית שנצפתה לנסיינים בריאים המבוטא באחוזים (A) או לערכים מוחלטים (B). התוצאות יוצגו כמו חציון (טווח בין רבעוני). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
חשוב גם להתחשב הגיל של המטופלים. אכן, מתאם חזק הוא בין גיל החולה את הפרופורציה של נויטרופילים נוכח sputum דגימות (איור 5). באופן דומה, בעת מיון מטופלים לפי קבוצות גיל 10 שנה (איור 6), הבחנו עלייה משמעותית באחוזים נויטרופילים עם הגדלת קבוצת גיל. לכן, משתנה זה יש לקחת בחשבון כאשר משווים תוצאות גדודים שונים, זהירות יש לנקוט את ההתאמה של נושאים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
איור 5: מתאם בין גיל לבין ברוק אחוז נויטרופילים. המתאם חושבה עם הבדיקה ספרמן. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
איור 6: האבולוציה של האחוז נויטרופילים בהתאם לקטגוריית גיל. הערך-p של אנובה היה &#60; 0.0001 עבור ההשוואה של נויטרופילים אחוז בין כיתות גיל. השוואות מרובות נעשו עם מבחן השוואות מרובות של דאן. ערכי p-מיוצגים כדלקמן: * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0.01, ו * * * p &#60; 0.001. התוצאות יוצגו כמו חציון (טווח בין רבעוני). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
התוצאות בחולים הסובלים ממחלות מערכת הנשימה הטכניקה של ברוק המושרה משמש בדרך כלל כדי להעריך את הפרופיל תאים דלקתיים אצל חולי אסתמה.טכניקה זו ויכול להיות מיושם גם לחולים הסובלים ממחלת ריאות חסימתית כרונית, מחלות נשימה דלקתי אחר. בעת השוואה בין הנבדקים בריא לחולי אסתמה, מטופלי COPD (הקבוצות 3 להיות תואמות גיל, מגדר, טבק הרגלים), הבחנו כי הפרופיל תאים דלקתיים שונה לגמרי בין קוהורטות אלה (איור 7). אכן, חולי אסתמה בדרך כלל מאופיינים אאוזינופילים sputum מוגבה, ואילו חלקם של נויטרופילים sputum הוא בדרך כלל גבוה יותר בחולי COPD לעומת שולט בריא, אשר קשורה לחומרת המחלה.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
איור 7 : ברוק תאים דלקתיים לפרופיל לנסיינים בריאים (n = 45), חולי אסתמה (n = 108), ומטופלים COPD (n = 54). לשלוש הקבוצות היו תואמות מגדר, גיל, הרגלי טבק. ערכי-p של אנובה היו &#60; 0.05, &#60; 0.0001, ו &#60; 0.0001 עבור ההשוואה של נויטרופילים, אאוזינופילים מקרופאגים בין קבוצות, בהתאמה. השוואות מרובות נעשו עם מבחן השוואות מרובות של דאן. ערכי p-מיוצגים כדלקמן: * p &#60; 0.05 ו * * * p &#60; 0.001. התוצאות יוצגו כמו חציון (טווח בין רבעוני). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing at JoVE.com

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

מתודולוגיה Sputum אינדוקציה ועיבוד מעבדה

כאן נתאר את הטכניקה של ברוק אינדוקציה. פרוטוקול זה גם מסביר את ברוק עיבוד כדי לבצע ספירה מבדלת תא וכדי לאסוף sputum supernatant תאים עבור ניתוח נוסף.

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

methodology-for-sputum-induction-and-laboratory-processing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

27.3K Views.  University of Liege. כאן נתאר את הטכניקה של ברוק אינדוקציה. פרוטוקול זה גם מסביר את ברוק עיבוד כדי לבצע ספירה מבדלת תא וכדי לאסוף sputum supernatant תאים עבור ניתוח נוסף.

Video: Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

ביצוע ועיבוד FNA של Pad שומן Anterior עבור עמילואיד

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

כיצד למדוד מתקפל קליפתיים מתמונות MR: מדריך שלב אחר שלב כדי לחשב מדד Gyrification מקומי

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

אינדוקציה של קרצינומה של תאי מעבר שלפוחית ​​השתן פולשנית בMUC1 עכברים הטרנסגניים חיסוניים אנושיים שלמים: מודל לפיתוח חיסוני

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

מרה Duct קשירת בעכברים: אינדוקציה של דלקת כבד פגיעה ופיברוזיס ידי חסימתית cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

אינדוקציה של טרשת עורקים מואצת בעכברים: מודל "פגיעת חוט"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the human respiratory tract. NA is a non-invasive technique which absorbs fluid from the inferior turbinate, and causes minimal discomfort. NA has yielded reproducible results with the ability to frequently repeat sampling of the upper airway. 
By comparison, alternative methods of sampling the respiratory mucosa, such as nasopharyngeal aspiration (NPA) and conventional swabbing, are more invasive and may result in greater data variability. Other methods have limitations, for instance, biopsies and bronchial procedures are invasive, sputum contains many dead and dying cells and requires liquefaction, exhaled breath condensate (EBC) contains water and saliva, and lavage samples are dilute and variable.
BA can be performed through the working channel of a bronchoscope in clinic. Sampling is well tolerated and can be conducted at multiple sites in the airway. BA results in MLF samples being less dilute than bronchoalveolar lavage (BAL) samples.
This article demonstrates the techniques of NA and BA, as well as the laboratory processing of the resulting samples, which can be tailored to the desired downstream biomarker being measured. These absorption techniques are useful alternatives to the conventional sampling techniques used in clinical respiratory research.

This manuscript describes the use of nasal and bronchial absorption techniques, specifically using synthetic absorptive matrices (SAM) to sample the mucosal lining fluid (MLF) of the upper and lower airway. These methods provide better standardization and tolerability than existing respiratory sampling techniques.

ספיגת נוזלים באף ובסימפונות: דגימה מדויקת של רירית מערכת הנשימה האנושית, מעבדה בעיבוד של דגימות

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

אסטרטגיות דגימה ועיבוד של דגימות רקמה Biobank של מודלים ביו חזירי

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...