Name: methodology for sputum induction and laboratory processing
Uploaded: 2017-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
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이 작품은 대학 병원의 리 (추 리)에 의해 지원 되었다. 우리는 비디오 제작에 대 한 "순간 프로덕션" 인정합니다. 우리는 또한 세 드 릭 프랑수아, 영화에 등장 하는 환자를 인정 합니다.

이 섹션에 설명 된 모든 방법을 리 대학 병원의 윤리 위원회에 의해 승인 되 고 모든 건강 한 과목 참여에 대 한 서 면된 동의 주었다.
1. 선 유도
<ol>
	<li>사전 및 사후 bronchodilator spirometry
	<ol>
		<li>spirometry 수행 (강제로 내쉬는 숨의 볼륨 1 초 [FEV1] 및 강제 중요 한 용량 [FVC] 책략) 미국 흉부 학회 (ATS)에 따르면 / 유럽 호흡기 학회 (ERS) 표준 기준12.</li>
		<li>스페이서 장치를 통해 흡입된 salbutamol의 400 µ g metered 복용량 흡입기 (MDI)에서 관리 합니다. 참고: 성인에서 salbutamol 흡입된의 부작용 떨림 및 심 박 급진13포함.</li>
		<li>반복 spirometry (FEV1 과 FVC 책략) 15 분 후,12의 ATS/ERS 표준 기준 따라 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>초음파 분무기의 준비 참고:는 분무기 해야 합니다 철저 하 게 청소 되며, 제조업체의 지침에 따라 각 사용 하기 전에 소독.<ol>
		<li>권장된 수준까지 증류수로 분무기 챔버를 채우십시오.</li>
		<li>분무기 챔버에 깨끗 한 컵을 넣습니다.</li>
		<li>적절 한 뚜껑 컵 커버.</li>
		<li>후 bronchodilator FEV1 환자에 대 한 고 식 염 수 (5%)의 중 50 mL 컵 채우기 &#62; 65% 예측 또는 예측 후 bronchodilator FEV1≤65 %는 환자에 대 한 isotonic 식 염 수 (0.9%)의 50 mL.</li>
		<li>Salbutamol 황산 솔루션 (5 mg/mL)의 1.75 mL 컵을 추가 합니다.</li>
		<li>튜브와 밸브 제조업체의 지침에 따라 연결 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nebulization 및가 래 컬렉션 참고: 의료 감독 기법을 수행 합니다.<ol>
		<li>환자에 게 절차를 설명 합니다.</li>
		<li>코 클립을 사용 하 여 환자를 부탁 드립니다.</li>
		<li>는 분무기를 돌려 고 졸 및 팬 설정의 최저 수준을 선택 합니다.</li>
		<li>5 분 간만 호흡과 입 조각을 통해에 어로 졸을 흡입 환자를 부탁 드립니다. 참고:에 어로 졸 및 팬 설정 환자의 허용 오차에 따라 증가 수 있습니다.<ol>
			<li>참을 수 없는 기침 또는 구역 질, 절차를 중단 하 고 1.3.5 단계로 이동 합니다.</li>
			<li>가슴 답 답, 호흡 불편 경우 1.3.8 단계로 이동 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>분무기를 해제 합니다.</li>
		<li>코 클립을 제거, 그의 입을 물으로 헹 구 고 싱크대에 그것을 삭제 하기 전에 두 번 양치질을 환자를 부탁 드립니다. 참고: 타 액 셀이 래 샘플을 오염 하 고 사용할 샘플 이어질 수 있습니다.</li>
		<li>플라스틱 용기에가 래를 기침 환자를 부탁 드립니다.</li>
		<li>FEV1측정 spirometry (강제로 내쉬는 숨 작전)을 수행 합니다.</li>
		<li>FEV1 가 다음과 같이 평가: (FEV1 단계 3.8 [mL]에서 측정)-(후 bronchodilator FEV1 단계 1.3 [mL]에서 측정) / (후 bronchodilator FEV1 측정 단계 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>FEV1 사후 bronchodilator 값에서 20% 이상 떨어지면, 절차를 중단 합니다. FEV1 다시 10 분 후 측정 합니다. 만약 FEV1 nebulized ipratropium 브 로마 이드 (0.25 mg/2 mL)를 관리 하 고 유지 의료 관찰 아래 환자를 의사에 게 20% 이상 떨어진다. 1.3.10 단계로 이동 합니다.</li>
			<li>FEV1 사후 bronchodilator 값에서 20% 이상 떨어지지 않는다, 반복 단계 3.2 3.9 1 ~ 3 배 10 ~ 20 분의 총 nebulization 시간에 도달. 참고: 총 nebulization 시간 품질 (플러그 또는 점성 부품의 존재)와 래 샘플의 수량에 따라 달라 집니다. 경우 샘플 품질 또는 수량 가난한 nebulization의 10 분 후, 15 ~ 20 분의 총 nebulization 시간 도달 하 절차를 확장 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>가 래 샘플을 처리까지 냉장 하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.가 래 처리
참고: 최적의 세포 생존 능력에 대 한 샘플링의 3 시간 안에가 래를 처리 합니다.
주의: 연구실 코트, 보호 장갑 및 고글을 착용.
<ol>
	<li>사전 준비
	<ol>
		<li>제조업체의 지침에 따라 6.5 m m 솔루션의 10 mL를 무 균 증류수와 집중된 dithiothreitol 솔루션 (mucolytic 에이전트)의 10 희석을 확인 합니다. 참고: 방지 하기 위해 주변 공기를 혼합 하는 집중된 dithiothreitol 솔루션, 솔루션에서에서 철수 유리병 멸 균 주사기와 바늘. 일단, 집중된 솔루션 유리병은 실 온에서 보관 고 5 일 이내에 사용 해야 합니다. 희석된의 솔루션은 매일 준비 하 고 있다. 주의: 눈과 피부 자극 위험 때문에 보호 장비 (의류, 장갑, 고글) 착용.</li>
		<li>Trypan 블루 솔루션 (0.4%)의 5 희석와 Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS) 0.08% 솔루션을 확인 합니다. 실 온에서이 희석된 솔루션을 유지 하 고 2 주 이내 사용. 주의: 발암 위험 때문에 보호 장비 (의류, 장갑, 고글) 착용.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>가 래 상쾌한의 컬렉션
	<ol>
		<li>50 mL 원뿔 하단 플라스틱 튜브에 전체 선 전송 및 샘플 무게.</li>
		<li>DPBS 솔루션의 3 무게를 추가 합니다.</li>
		<li>천천히 소용돌이 샘플 30 s.</li>
		<li>원심 분리기 800 x g와 4 ° C 10 분.</li>
		<li>멸 균 거 즈의 2 단일 레이어를 통해 샘플을 필터링 하 고 상쾌한 50 mL 원뿔 바닥에 플라스틱 튜브에서를 수집.</li>
		<li>Aliquot 2 mL 플라스틱에서 상쾌한 튜브 및-80 ° c.에서 그들을 저장합니다 참고: 표면에 뜨는 샘플은가 래 액체 단계 구성 요소 시험에 유용.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>가 래 Mucolysis
	<ol>
		<li>필요한 경우, 세포 현 탁 액 5 ml의 총 볼륨에 연결할 셀 펠 릿을 DPBS를 추가 합니다.</li>
		<li>6.5 m m dithiothreitol의 1 볼륨 세포 현 탁 액을 희석. 벤치 로커를 사용 하 여 실 온에서 20 분 동안 세포 현 탁 액을 바위.<ol>
			<li>DPBS와 3 번 이상 반복 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>G와 10 분 동안 4 ° C x 550에 희석된 세포 현 탁 액 원심</li></ol></li></ol>폐기는 상쾌한.
		<li>약 1 ml DPBS의 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	
	
	<li>Hemocytometer 수가 래 샘플 (셀 농도 편평 세포 오염, Trypan 블루 제외 방법으로 생존)의 질적 속성의 평가
	<ol>
		<li>평가 하 고 셀 서 스 펜 션의 정확한 볼륨을 기록.</li>
		<li>0.08 %trypan 블루 솔루션의 50 µ L에 세포 현 탁 액의 50 µ L을 추가 하 고 균질.</li>
		<li>Hemocytometer (Thoma 챔버)의 coverslip 아래 샘플을 넣어 하 고 광학 현미경 (400 X) 두십시오.</li>
		<li>계산 편평 세포, 생활 비 편평 상피 세포 (질된 세포), 그리고 죽은 비 편평 상피 세포 (블루 색 셀). 참고: 너무 낮게 또는 너무 높은 세포 밀도 경우 집중 또는 세포 현 탁 액을 희석 하 고 반복 단계 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>정지, 편평 세포의 비율 및 비 편평 세포의 생존 능력의 비율의 세포 농도 평가 합니다. 참고: 계산가 래의 총 비 편평 세포 수/g: 세포 현 탁 액 (단계 5.4)의 농도 * 볼륨 세포 현 탁 액 (단계 4.8)의 * 비 편평 세포의 % 무게 /가 래 샘플 (2.2.1 단계)의.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>필요한 경우 세포 현 탁 액 및 잔여 세포의 저장과 준비의 얼룩진된 cytospin 슬라이드 참고: 세포 현 탁 액 포함 80% 이상이 편평 세포, 샘플 간주 됩니다 가난한 품질과 cytospin 슬라이드14를 위해 부적 한. 이 경우, 처리를 중단 하 고이 샘플 실패 고려.<ol>
		<li>500, 000 셀/mL에 세포 현 탁 액의 적어도 350 µ L를 DPBS와 세포 현 탁 액의 약 수를 희석.</li>
		<li>조립 셀 집중 장치 제조업체의 지침에 따라.</li>
		<li>이 세포 현 탁 액의 100 µ L 셀 집중의 3 구획의 각각을 채우십시오.</li>
		<li>Cytocentrifuge에서 150 x g 및 실 온에서 2 분 동안 회전. supernatants 삭제 합니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 셀 집중 분해.</li>
		<li>건조 공기를 허용 합니다. 참고:이 단계에서 잔여 세포 저장할 수 있습니다 적절 한 버퍼에 추가 실험을 위해 필요한 경우.</li>
		<li>얼룩 상업 얼룩과 슬라이드 키트 ( 테이블의 자료를 참조), 제조업체의 지침에 따라.</li>
		<li>적합 한 장착 매체와 커버 슬립 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
		<li>기름 침수와 광학 현미경 (600 X) 슬라이드를 놓습니다.</li>
		<li>적어도 500 편평 비 셀: 호 중구, 호 산 구는, 대 식 세포, 림프 톨, 그리고 상피 세포. 참고: 차동 세포 수는 일반적으로 단 하나에 의해 수행 또는 2 전용 interobserver 불일치를 제한 하는 관찰자 훈련.</li>
		<li>레코드의 절대 값 및 각 셀의 비율을 입력합니다.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
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저자는 공개 없다.

유도 선 방법은 기도 구획을 공부 하는 유용한 도구입니다. 이 기술의 몇 가지 가능한 응용 프로그램을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 그것은 면역 세포와 다양 한 호흡기 질환에 관련 된 메커니즘에 대 한 지식을 높일 수 있습니다. 예를 들어,이 기술은 환자의 큰 동료에서 기도 염증의 조사를 허용 했다 그리고 천식 환자의 절반 정도는 비정상적인 기도 감염은 염증15, 특징은 보여왔다 16 , 17, COPD 환자는 일반적으로 올려진된 선 neutrophil 전시 하는 동안18세. 이 기술은 특 발성 폐 섬유 증 환자에서 기도 염증의 더 나은 특성 및 증거 중재자가 병19에 기여할 수에 기여 했다. 둘째, 유도 된가 래의 기술 치료 반응 예측을 유용할 수 있습니다. 예를 들어가 래 호 산 구는의 비정상적인 비율의 존재 코르 티 코 스테로이드 반응성11,18의 예측 마커 되도록 표시 되었습니다. 천식 및 COPD가 래 호 산 구는의 비율을 정상화 코르 티 코 스테로이드의 복용량을 조정 표시 했다11 현재 임상 지침에 따라 치료 조정 보다 exacerbations의 수를 감소에 더 효과적 ,,2021. 셋째, 선 분석 표적으로 한 치료를 개발 하는 데 도움이 있습니다. 예를 들어가 래 COPD와 일부 천식 환자에서 호 중구의 비정상적인 수의 존재 antineutrophilic 치료11의 개발을 주도하 고 있다. 넷째, 기술 진단에 한 역할을 재생할 수 있습니다. 예를 들어가 래 eosinophilia의 존재 비 천식 감염은 기관지염11의 진단을 만들 필요가 있다.
차동 셀 개수 구하기, 외 선 유도의 기술 또한 표면에 뜨는 래 또는 래 세포를 공부 하 여 많은 추가 분석의 성능 수 있습니다. 표면에 뜨는 래와 예로 중재자8,,1922 의 분석 및 호 산 구는22에 대 한 샘플의 혈 활동의 평가 있습니다. 가 래 세포에서 RNA를 추출 수 및 예측에 관한 사용 또는 유전자 발현 분석19,23 . 가 래 셀 흐름 cytometry9,23 사람들과 immunophenotyping 및 셀 정렬 허용 하 여 분석할 수 있습니다. 또한,가 래 세포 배양된10, 수 그리고 그들의 중재자 생산 측정 된 생체 외에서24를 수 있습니다. 이 경우에 지적 가치가 있다, 중재자 콘텐츠는 무엇에서 찾을 수 있습니다 선 표면에 뜨는 다릅니다. 실제로, 표면에 뜨는 래에 중재자 기도 주민 세포에서 분 비 물에 의해 및 플라즈마 나옴가 래 세포 문화 모델24반대에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 마지막으로, immunocytochemistry와 제자리에서 교 잡도 수행할 수 있습니다가 래 세포7를 사용 하 여.
유도 선 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 감 응 작용은 의료 감독 하에 수행 되어야 합니다. 또한 환자에 게 철저 한 지침 연산자에 대 한 필수적 이다. 호흡 노력 필요에 따라 다른 한계는 협력 및 환자의 건강 상태를 포함 합니다. 아이 들에 있는이 기술의 타당성에 관한 여러 연구 결과 그것이 성공적이 고 6 세25이상의 어린이 안전 보고 있다. 자식에는 데이터 &#60; 나이의 6 년25, 부족 하지만 선 유도 그 아이 들14에서 수행 하기 어려운. 기술은 현재 연구 서비스 및 전문된 센터 때문에 기술적으로 까다로운, 시간이 걸리는, 그것은 훈련된 한 직원1필요 제한 됩니다. 또 다른 한계 선 유도 및 분석의 기술 항상 성공, 읽을 수 있는 cytospin는 항상26을 취득 하지 의미 하지는 않다는 것입니다. 그러나, 성공률은 일반적으로 80% 환자4,26,27,,2829의 다른 동료에 약. 마지막으로, 환자의 래 셀 수30,31영향을 같이 했다 나이 일치에 관한 다른 동료를 비교할 때 주의 촬영 해야 합니다. 마찬가지로, 성별 및 담배 습관 같은 다른 매개 변수 또한가 래 셀 수29,32방해할 수로 일치 해야 합니다. 환자 일치 하는 것은 불가능 하다, 나이, 성별, 흡연 상태 고려해 야 하는 또 다른 방법은 이러한 특성에 대 한 통계 분석을 조정입니다.
생체 검사와 bronchoalveolar lavages, 같은 항공에서 세포를 수집을 허용 하는 다른 기술에 비해 유도 선 방법 간단한, 잘 용납, 안전, 재현성, 비용, 및 비-침략 적 되 고의 이점이 있다. 이러한 장점을 수행 할 큰 규모에서 반복적으로 시간이 지남에, 유도 선 기술을 허용 하 고 기도 샘플링에 대 한 선택의 대안. Bronchosorption 기도 중재자33평가 점 막 내벽 액체의 수집을 허용 하는 다른 기술입니다. 이 기술은 (필요한 상계) 유도 래 보다 더 많은 침략 하는 동안 타 액과 어떤 오염 든 지 고 bronchoalveolar 게33보다 중재자의 높은 농도 얻기의 이점이 있다.
중요 한 단계는 프로토콜에 주의가 필요합니다. 첫째, 주의 이러한 두 개의 매개 변수는 결과 영향을 미칠 수 있기 때문에 그러므로 표준화 된34,35를 해야 염 분 농도 유도 시간에 관한 촬영 해야 합니다. 둘째, DTT와 mucolysis는 처리의 중요 한 단계 이다. PBS, 비교 DTT가 래 셀7, cytopsin 슬라이드 품질을 향상 하 고 재현할 수 셀 카운트2필수적입니다 더 나은 분산 표시 했다. 그러나, mucolytic 에이전트는 생 화 확 적인 부품의 측정을 방해할 수 있습니다.급상승 실험 다음 수행 되어야 한다 새로운 생 화 확 적인 화합물36를 측정 하는 경우. 마지막으로, 프로시저의 또 다른 중요 한 단계는 안정적이 고 해석할 결과 숙련 된 기술자에 의해 수행 해야 단계를 계산 하는 셀입니다.
전체 선 대신가 래 플러그 (점성 또는 밀도 부품)를 사용 하 여 다른 방법 또한 문학7에 설명 되어 있습니다. 두 방식 모두 장단점이 있다. 전체 선 기술은 더 빠른7, 처리 수 수 하지만 자주 타 액 샘플을 dilutes cytospins2,7의 품질을 줄일 수 있으며 오염 된. 플러그 선택 기법으로 타 액 오염 감소, 즉 그 샘플 들은 액체 단계 중재자의 복용량에 대 한 고 cytospin 슬라이드7에 대 한 더 나은 품질의. 그러나 처리는 더 이상7 하 고 선택한 플러그 전체 샘플37의 대표 되지 않을 수 있습니다. 그것은 또한 모든 샘플 제한 될 수 있습니다 플러그 포함 지적 가치입니다. 두 방법 모두는 검증 되 고 재현, 그리고 현재는 이러한 두 방법에서 얻은 차동 셀 카운트는 다른14,38증거.
미래에, 유도 선 조사, 진단, 및 염증 성 호흡기 질환의 모든 종류의 관리에 대 한 바이오 마커를 제공 하기 위해 임상 도구로 사용 될 수 있습니다.

여러 가지 방법을 조사 기도 염증에 사용 됩니다: 직접 측정 (예: 기관지 생 검 또는 bronchoalveolar lavages)와 간접 방법 (증상 평가, 같은 혈액 샘플 분석 및 폐 기능 검사)1. 직접 기술을 안정적으로 평가 하는 기도 염증의 이점이 있다 하지만 그들은 침략과 가능 하지에 대규모 환자 불편 때문에 고 위험 발생1. 간접적인 방법에 관해서는 그들은 제대로 기도 염증1의 직접 평가와 연관.
가 래 컬렉션 기도에서 샘플 셀에 다른 방법 이며, 기도 염증의 직접적인 평가 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 자발적으로 래를 생산 품질의 샘플을 이어질 수 있습니다 그리고 모든 환자2불가능. 가 래 생산2유도 하 초음파 nebulized 마 식 염 수를 사용 하 여이 문제를 극복 되었습니다 했다. 이 메서드와 Pneumocystis carinii 폐 렴3 의 진단을 위한 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염 환자에서 처음 사용 되었다 건강 한 과목과 19924천식에 대 한 적응 했다. 가 래 유도 또한 isotonic 식 염 수5를 사용 하 여 더 심한 환자에서 가능 합니다. 비록 일반적으로 잘 용납 하 고, 염 분의 흡입 hyperresponsive 항공5환자의 bronchospasm을 발생할 수 있습니다. 따라서, 절차1전에 짧은 행동 beta 주 작동 근을 관리 하는 것이 좋습니다. 또한, 우리는 이전 것이 위험6감소 더 salbutamol 초음파 분무기에 소금물을 추가 보여주었다. 선 유도의 장점 그것은 비 침략 적2 5촬영 때 적절 한 안전 예방 조치 이다.
가 래 샘플 처리에 대 한 두 가지 방법에서에서 현재 사용 문학: 전체 선 기술과 플러그 선택7. 우리의 실험실에서 전체 선 기술 수행 됩니다. 선 처리의 기본 목적은 염증 기도 루멘에의 종류 공부 차동 세포 수를 얻을 것입니다. 그러나, 많은 추가 분석 추가 선 표면에 뜨는8 에서 중재자를 공부 하거나가 래 셀에 자세한 조사를 수행 하 여 염증 성 프로세스와 면역 메커니즘을 조사 수 있습니다 (예: , flow cytometry9, 셀 문화10, 유전체학10, proteomics10, immunocytochemistry7, 제자리 교 잡7, 등)
선 유도 및 분석의 기법 때문에 기술적으로 까다로운, 시간이 걸리는, 훈련된 직원1필요 서비스 및 임상 연습에서 전문화 된 센터를 현재 제한 됩니다. 기도 염증과 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 만성 기침, 또는 특 발성 폐 섬유 증11같은 다양 한 호흡기 질환에 대 한이 방법으로 조사 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Spirometer - Spirobank</td><td>MIR France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol MDI - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0135-913</td><td>See drug available in the country</td></tr><tr><td>Nebulizer UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>UltraNeb U3000</td><td></td></tr><tr><td>Devilbiss UltraNeb Disposable Cups &amp;amp; Lids</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>100HD-647</td><td></td></tr><tr><td>DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>1001005879</td><td></td></tr><tr><td>One-way Valves</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41664</td><td></td></tr><tr><td>One-way Valves</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41665</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol T-connector&amp;nbsp;</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41077</td><td></td></tr><tr><td>Ventilation circuit monobranch corrugated</td><td>Int&#039;Air Medical France</td><td>TA30A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5 %&amp;nbsp;</td><td>/</td><td>/</td><td>Produced by our hospital pharmacy</td></tr><tr><td>Mini-Plasco NaCl 0.9%</td><td>B.Braun Medical&amp;nbsp; Diegem Belgium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0094-987</td><td>See drug available in the country</td></tr><tr><td>Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent</td><td>Boehringer Ingelheim Germany</td><td>CNK: 1543-305</td><td>See drug available in the country</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>LONZA Belgium</td><td>BE17512F</td><td></td></tr><tr><td>Sputolysin reagent</td><td>Calbiochem</td><td>56000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4% solution 100 mL</td><td>LONZA Bio Whittaker Belgium</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer - Thoma chamber</td><td>Labor Optik Lancing UK</td><td>1500000</td><td></td></tr><tr><td>Hemacolor Stainig set</td><td>Merck Belgium</td><td>1116610001</td><td>Alternative product&amp;nbsp; : Diff Quik Staining Set&lt;br/&gt; &amp;nbsp;Medion Diagnostic&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mounting medium - Entellan</td><td>Merck Belgium</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Statspin Cytofuge 12&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Belgium</td><td>X00-003066-001</td><td></td></tr></tbody></table>

methodology for sputum induction and laboratory processing

선 유도 및 처리의 기술 수집 및 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 같은 다양 한 호흡기 질환에 흥미 롭 기도에서 세포의 분석을 수 있도록 인식된 비-침략 적 방법입니다. 만성 기침, 또는 특 발성 폐 섬유 증입니다. 이 기술은 잘 용납 하 고, 안전 하 고 비-침략 적, 하지만 현재 연구 서비스 및 전문된 센터 임상 연습에서 기술적으로 까다로운, 소모, 그리고 숙련 된 직원을 필요로 하기 때문에. 선 유도 및 분석의 성공률은 약 80%.
여기, 우리는 래 샘플의 유도 및 실험실 처리를 설명합니다. 가 래는 salbutamol와 마 또는 isotonic 식 염 수의 흡입에 의해 유발 됩니다. 처리를 위해 전체 선 기술을 사용 하 고. Dithiothreitol (DTT)는가 래 샘플의 mucolysis를 허용 하는 데 사용 됩니다. 가 래 처리의 기본 목적은 기도 루멘에 셀 유형을 공부 하 차동 세포 수를 얻을 것입니다. 추가 분석은 또한 표면에 뜨는 래과가 래 세포, 염증 성 프로세스와 면역 메커니즘에 대 한 조사를 더 수 수행할 수 있습니다. 예로 표면에 뜨는 래에 중재자를 공부 하 고 cytometry, genomics, proteomics 등가 래 세포에 분석의 큰 스펙트럼을 수행 있습니다.
마지막으로, 건강 한 컨트롤, 천식, COPD 환자에 선 분석의 대표적인 결과 표시 됩니다.

Hemocytometer 일반적인 이미지는 hemocytometer를 사용 하 여 현미경으로 시각화는 그림 1 에 표시 됩니다. 편평 세포는 쉽게 식별 합니다, 그들은 비 편평 세포 보다 훨씬 더 큰. 이 편평 상피 세포는 상피 세포는 입에서 나오는. 두 종류의 세포는 Trypan 블루 때 죽은 물 들 다. 주의 효 모, 박테리아 및 스크랩 방지로 이동 해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
그림 1 : 죽은 비 편평 상피 세포, 그리고 (C)는 편평 상피 세포 (A) 생계 비 편평 상피 세포, (B)를 보여주는 Hemocytometer 그림. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
Cytospin 슬라이드: 그림 2 는 선 처리 후 얻은 cytospin 슬라이드의 대표 이미지. 다른 세포 유형 (호 중구, 호 산 구는, 대 식 세포, 림프 톨, 그리고 상피 세포) 그들의 형태학 및 채색에 의해 분화 될 수 있다. 경우에 따라 편평 상피 세포에 의해 오염 중요 한 있을 수 있습니다 그리고, 편평 세포의 비율 80% 보다 큰 경우, 샘플 실패 (그림 3) 것으로 간주 됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
그림 2 : Cytospin 슬라이드 그림 표시 (A) neutrophil, (B)는 대 식 세포, (C)는 eosinophil (D)는 림프 구 및 (E)는 상피 세포. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
그림 3 : 와 품질 cytospin 슬라이드의 예 &#62; 편평 세포의 80%. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
성공률 우리 부서에서 (성공적인 유도 및 읽을 수 있는 cytospin 결합) 절차의 1,129 환자 (건강 한 과목 이나 천식, COPD 환자)의 샘플에 따라, 82% (924/1,129). 환자의 유형에 따라 하위 분석에서 성공률 이며 건강 한 과목에서 75% (57/76), 82% (827/1,004) 천식, COPD 환자의 82% (40/49).
건강 한 과목에 결과 우리 부서, 중앙값 (interquartile 범위)에서 289 건강 한 과목의 일련의 회 고 분석에 선 무게 3.72 g (2.46 g-5.54 g의 interquartile 범위) 이었고,가 래의 메디아 총 비 편평 세포 수/g x 106 (0.59 0.37 x 10의 interquartile 범위6 -1.29 x 106).
그 건강 한 주제에서 편평 세포의 비율이 19% (10%-34%)에 낮은 이며 생존은 66% (54-78%)에서 높은. 다른 세포 유형의 비율에 대 한 결과 그림 4A에서 요약 된다. 우리는 대 식 세포 (49% [31-68%])의 백분율은 동안 세포 (2% [1-3%])의 비율 (34% [14%-60%]), 호 중구의 비율 보다 높은, 호 산 구는 (0% 0%-0%)과 상피 세포 (4% [2-11%])는 낮은 볼 수 있습니다. 이러한 결과 비슷한 데이터 절대 값 (그림 4B)에서 표시 됩니다 때.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
그림 4 : 건강 한 과목에서 차동 세포 수의 대표적인 결과 절대 값 (A) 백분율 또는 (B)로 표현 합니다. 결과 중간 (interquartile 범위)로 표시 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그것은 또한 환자의 나이 고려 하는 것이 중요입니다. 실제로, 강한 상관 관계는가 래 샘플 (그림 5)에 환자의 나이 및 호 중구의 비율 사이 존재. 마찬가지로, 10 년 나이 그룹 (그림 6)에 따라 환자를 분류 하는 경우 연령 증가 함께 호 중구 백분율에 상당한 증가 관찰 합니다. 따라서, 다른 동료에서 결과 비교할 때이 변수를 고려 한다 그리고 과목의 일치에 주의 이동 해야 합니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
그림 5: 나이 및가 래 호 중구 백분율 사이 상관 관계 상관 관계 계산 Spearman 테스트와 함께. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
그림 6: 나이 카테고리에 따라 호 중구 백분율의 진화. ANOVA의 p-값이 &#60; 0.0001 호 중구 백분율 나이 클래스 간의 비교에 대 한. 여러 비교 던의 여러 비교 테스트 했다. P-값은 다음과 같이 표시 됩니다: * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0.01, 그리고 * * * p &#60; 0.001. 결과 중간 (interquartile 범위)로 표시 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
호흡기 질환으로 고통 받아 환자에 있는 결과 유도 된가 래의 기술 주로 천식 환자에서 염증 성 셀 프로 파일을 평가 하기 위해 사용 됩니다.이 기술은 또한 COPD, 다른 염증 성 호흡기 질환으로 고통 받아 환자에 적용할 수 있습니다. 비교할 때 건강 한 과목, 천식, COPD 환자 (나이, 성별, 그리고 담배 습관에 대 한 일치 되는 3 그룹), 염증 성 셀 프로 파일은이 동료 (그림 7) 사이 아주 다른 관찰 합니다. 실제로, 천식 환자는 보통 특징 제기 래 호 산 구는가 래 호 중구의 비율은 COPD 환자의 건강 한 컨트롤에 비해 일반적으로 더 높은 질병 심각도에 연결 되는.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
그림 7 : 건강 한 과목의가 래 염증 셀 프로 파일 (n = 45), 천식 환자 (n = 108), 및 COPD 환자 (n = 54). 3 그룹은 성별, 나이, 및 담배 습관에 대 한 일치 했다. ANOVA의 p-값 &#60; 0.05, &#60; 0.0001, 및 &#60; 0.0001 호 중구, 호 산 구는, 및 세포 그룹 간의 비교에 대 한 각각. 여러 비교 던의 여러 비교 테스트 했다. P-값은 다음과 같이 표시 됩니다: * p &#60; 0.05와 * * * p &#60; 0.001. 결과 중간 (interquartile 범위)로 표시 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

선 유도 및 실험실 방법론

여기는 선 유도의 기술에 설명합니다. 이 프로토콜도 선 차동 세포 수를 수행 하 고 표면에 뜨는 래를 수집 처리 및 추가 분석에 대 한 셀을 설명 합니다.

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

methodology-for-sputum-induction-and-laboratory-processing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

27.4K 조회수.  University of Liege. 여기는 선 유도의 기술에 설명합니다. 이 프로토콜도 선 차동 세포 수를 수행 하 고 표면에 뜨는 래를 수집 처리 및 추가 분석에 대 한 셀을 설명 합니다.

비디오: Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

<meta charset="utf8"></head><body>유도 가래 분석을 통한 폐 대식세포의 탄소 정량화

Measuring Carbon Content in Airway Macrophages Exposed to Carbon-Containing Particulate Matters

Pulmonary macrophages exhibit a dose-dependent pattern in phagocytizing particles. Following engulfment, these macrophages are subsequently excreted with sputum, rendering macrophages and particles visible and quantifiable under light microscopy. Notably, elemental carbon within the mammalian body originates exclusively from external contaminants. Consequently, the carbon content in airway macrophages (CCAM) serves as a valid exposure biomarker, accurately estimating individual exposure to carbon-containing particulate matter (PM). This article delineates a protocol involving sputum collection, preservation, processing, slide preparation, and staining, as well as macrophage photo acquisition and analysis. After removing the macrophage nuclei, the proportion of cytoplasm area occupied by carbon particles (PCOC) was calculated to quantify carbon content in each macrophage. The results indicate an elevation in CCAM levels after exposure to carbon-containing PM. In summary, this non-invasive, precise, reliable, and standardized method enables the direct measurement of carbon particles within target cells and is utilized for large-scale quantification of individual CCAM through induced sputum.

<meta charset="utf8"></head><body>탄소 함유 미립자 물질에 노출된 기도 대식세포의 탄소 함량 측정

This article describes a detailed experimental protocol for measuring the carbon content of airway macrophages with the aim of assessing the internal exposure dose at the level of individual particulate matter exposure.

탄소 함유 미립자 물질에 노출된 기도 대식세포의 탄소 함량 측정

Pulmonary macrophages exhibit a dose-dependent pattern in phagocytizing particles. Following engulfment, these macrophages are subsequently excreted with ...

연구

환경과학

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the host&#39;s microbial community. To disentangle the origin of microbial VOCs, volatile headspace analysis of bacterial mono- and co-cultures of Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Acinetobacter baumannii, and stable isotope probing in biological samples of feces, saliva, sewage, and sputum were performed. Mono- and co-cultures were used to identify volatile production from individual bacterial species or in combination with stable isotope probing to identify the active metabolism of microbes from the biological samples.
Vacuum-assisted sorbent extraction (VASE) was employed to extract the VOCs. VASE is an easy-to-use, commercialized, solvent-free headspace extraction method for semi-volatile and volatile compounds. The lack of solvents and the near-vacuum conditions used during extraction make developing a method relatively easy and fast when compared to other extraction options such as tert-butylation and solid phase microextraction. The workflow described here was used to identify specific volatile signatures from mono- and co-cultures. Furthermore, analysis of the stable isotope probing of human associated biological samples identified VOCs that were either commonly or uniquely produced. This paper presents the general workflow and experimental considerations of VASE in conjunction with stable isotope probing of live microbial cultures.

This protocol describes the extraction of volatile organic compounds from a biological sample with the vacuum-assisted sorbent extraction method, gas chromatography coupled with mass spectrometry using the Entech Sample Preparation Rail, and data analysis. It also describes culture of biological samples and stable isotope probing.

진공 보조 흡착제 추출을 통해 인간 관련 샘플에서 활발히 생산된 미생물 휘발성 유기 화합물 포획

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

생화학

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

면역학 및 감염병학

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

등온 증폭을 이용한 인간 호흡기 세균 감염 진단

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

저자 스포트라이트: Advancing Rapid detection of respiratory Pathogens Using Microfluidic Chip(미세유체 칩을 사용한 호흡기 병원체의 신속한 검출 발전) 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

선 유도 및 실험실 방법론

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