Este trabalho foi apoiado pelo Hospital da Universidade de Liège (Liège CHU). Reconhecemos "Produções de instantes" para a produção de vídeo. Também reconhecemos o Cedric François, o paciente que apareceu no filme.

Todos os métodos descritos nesta seção foram aprovados pelo Comitê de ética do Hospital da Universidade de Liège, e todos os indivíduos saudáveis deram consentimento escrito de participação.
1. indução de escarro
<ol>
	<li>Pré e pós-broncodilatador espirometria
	<ol>
		<li>Executar uma espirometria (volume expiratório forçado em 1 segundo [VEF1] e manobra de capacidade vital forçada [VT]) de acordo com a American Thoracic Society (ATS) / sociedade respiratória Europeia (ERS) critérios padrão12.</li>
		<li>Administre 400 µ g de salbutamol inalado em um inalador de dose calibrada (MDI) através de um dispositivo de espaçador. Nota: Em adultos, os efeitos adversos do salbutamol inalado incluem tremor e taquicardia13.</li>
		<li>Repita a espirometria (VEF1 e manobra de CVF) 15 min mais tarde, de acordo com os critérios ATS/ERS12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação do nebulizador ultra sonico Nota: O nebulizador deve ser cuidadosamente limpos e desinfectado antes de cada utilização, em conformidade com as instruções do fabricante.<ol>
		<li>Encha a câmara de nebulização com água destilada até o nível recomendado.</li>
		<li>Coloca uma xícara limpa na câmara de nebulização.</li>
		<li>Cubra a taça com a tampa adequada.</li>
		<li>Encha o copo com qualquer 50 mL de solução salina hipertônica (5%) para um paciente com pós-broncodilatador VEF1 &#62; 65% previsto ou 50 mL de solução salina isotônica (0,9%) para um paciente com pós-broncodilatador VEF1≤65% previsto.</li>
		<li>Adicione 1,75 mL da solução de sulfato de salbutamol (5 mg/mL) para a Copa.</li>
		<li>Conecte os tubos e válvulas de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleção de nebulização e escarro Nota: Execute a técnica sob supervisão médica.<ol>
		<li>Explica o procedimento ao paciente.</li>
		<li>Pedir ao paciente para usar um grampo do nariz.</li>
		<li>Ligue o nebulizador e selecionar o nível mais baixo das configurações de aerossol e ventilador.</li>
		<li>Pedir ao paciente para inalar o aerossol através da peça de boca com a respiração das marés por 5 min. Nota: Aerosol e fã de configurações podem ser aumentadas dependendo da tolerância do paciente.<ol>
			<li>Em caso de tosse insuportável ou náuseas, interrompa o procedimento e vá para a etapa 1.3.5.</li>
			<li>Em caso de aperto no peito ou desconforto respiratório, vá para a etapa 1.3.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Desligue o nebulizador.</li>
		<li>Pedir ao paciente para remover o grampo do nariz, enxágue a boca com água e bochechar duas vezes antes de descartá-lo na pia. Nota: Células de Saliva podem contaminar a amostra de escarro e levar a uma amostra inutilizável.</li>
		<li>Pedir ao paciente para tossir escarro em um recipiente plástico.</li>
		<li>Execute uma espirometria (manobra expiratória forçada) para medir VEF1.</li>
		<li>Avaliar a queda de1 FEV como segue: (VEF1 medido na etapa 3.8 [mL]) - (pós-broncodilatador VEF1 medido na etapa 1.3 [mL]) / (pós-broncodilatador VEF1 medido na etapa 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>Se o VEF1 cai em 20% ou mais do valor pós-broncodilatador, interrompa o procedimento. Medida VEF1 novamente 10 min mais tarde. Se o VEF1 cai 20% ou mais, pergunte o médico administrar o brometo de ipratrópio nebulização (0,25 mg/2 mL) e manter o paciente sob observação médica. Vá para a etapa 1.3.10.</li>
			<li>Se o VEF1 não cai em 20% ou mais do valor pós-broncodilatador, repita as etapas de 3,2 a 3,9 uma a três vezes para alcançar um tempo de nebulização total de 10 a 20 min. Nota: O tempo de nebulização total dependerá (presença de fichas ou peças viscosas) de qualidade e quantidade da amostra do escarro. Se a qualidade da amostra e/ou quantidade é pobre após 10min de nebulização, o procedimento deve ser ampliado para alcançar um tempo de nebulização total de 15 a 20 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Manter a amostra de escarro refrigerada até o processamento.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. escarro processamento
Nota: Processe o escarro dentro de 3 horas de amostragem para viabilidade celular ideal.
Atenção: Use um jaleco, luvas e óculos de proteção.
<ol>
	<li>Preparativos preliminares
	<ol>
		<li>Fazer uma diluição de 10 vezes da solução concentrada de ditiotreitol (agente mucolítico) com água destilada estéril para obter 10 mL de uma solução de 6,5 mM, em conformidade com as instruções do fabricante. Nota: Para evitar a solução concentrada ditiotreitol, mistura com o ar ambiente, retire a solução do frasco com agulha e seringa estéril. Uma vez aberto, o frasco de solução concentrada deve ser mantido em temperatura e usado dentro de 5 dias. A solução diluída é preparada diariamente. Atenção: Por causa do perigo de irritação de olho e pele, utilize equipamento de protecção (vestuário, luvas e óculos de proteção).</li>
		<li>Fazer uma 5-fold diluição da solução de azul de trypan (0,4%) com de Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) para obter uma solução de 0,08%. Manter esta solução diluída à temperatura ambiente e usar dentro de 2 semanas. Atenção: Por causa de riscos cancerígenos, utilize equipamento de protecção (vestuário, luvas e óculos de proteção).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleta de escarro sobrenadante
	<ol>
		<li>Transferir o escarro todo em um tubo de plástico de fundo cónico de 50 mL e pesar a amostra.</li>
		<li>Adicione um peso 3 vezes da solução DPBS.</li>
		<li>Lentamente o vórtice a amostra por 30 s.</li>
		<li>Centrifugue a 800 x g e 4 ° C por 10 min.</li>
		<li>Filtrar a amostra através de 2 simples camadas de gaze estéril e recolher o sobrenadante em um tubo de plástico de fundo cónico de 50 mL.</li>
		<li>Alíquota do sobrenadante em plástico 2 mL tubos e armazená-los a-80 ° C. Nota: Amostras de sobrenadante são úteis para ensaiar componentes de fase fluida do escarro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mucolysis expectoração
	<ol>
		<li>Se necessário, adicione DPBS para o centrifugado para alcançar um volume total de suspensão de células de 5 mL.</li>
		<li>Dilua a suspensão de células com 1 volume de ditiotreitol 6,5 mM. Use um balancim de banco para agitar a suspensão de eritrócitos por 20 min em temperatura ambiente.<ol>
			<li>Repita pelo menos 3 vezes com DPBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de células diluído em 550 x g e 4 ° C por 10 min.</li></ol></li></ol>Desprezar o sobrenadante.
		<li>Ressuspender as células em cerca de 1 mL de DPBS.</li>
	
	
	<li>Avaliação das propriedades qualitativas da amostra do escarro (concentração de célula, a contaminação de células escamosas e viabilidade pelo método de exclusão Trypan azul) pela contagem de hemocytometer
	<ol>
		<li>Avaliar e registrar o volume exato da suspensão celular.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l de suspensão de células de 50 µ l da solução de azul de trypan 0,08% e homogeneizar.</li>
		<li>Colocar a amostra sob a lamela de um hemocytometer (câmara de Thoma) e colocá-la sob o microscópio ótico (400 X).</li>
		<li>Contar as células escamosas, as vida não-escamosas células (sem cor) e as células mortas não-Carcinoma de células (células de cor azul). Nota: Em caso de densidade celular muito baixo ou muito alto, se concentrar ou diluir a suspensão de eritrócitos e repita etapas 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>Avalie a concentração de células da suspensão, a percentagem de células escamosas e o percentual de viabilidade de células não-escamosas. Nota: Calcular a contagem total não-escamosas/g de escarro: célula de concentração da suspensão (passo 5.4) * volume da suspensão de eritrócitos (etapa 4.8) * % das células não-escamosas / peso da amostra do escarro (etapa 2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação de um manchado cytospin deslize com a suspensão de células e armazenamento de células residuais, se necessário Nota: Se a suspensão de célula contém mais de 80% de carcinoma de células células, a amostra é considerada pobre qualidade e inadequado para um cytospin slide14. Nesse caso, descontinuar o tratamento e considerar este exemplo malsucedido.<ol>
		<li>Dilua uma alíquota da suspensão celular com DPBS para obter pelo menos 350 µ l de uma suspensão de células em 500.000 células/mL.</li>
		<li>Monte o concentrador de célula em conformidade com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Encha cada um dos 3 compartimentos do concentrador de célula com 100 µ l da suspensão celular.</li>
		<li>Em um cytocentrifuge, giram por 2 min em 150 x g e temperatura de quarto. Descarte os sobrenadantes.</li>
		<li>Desmonte o concentrador de célula em conformidade com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Permitir que o slide para o ar seco. Nota: Nesta fase, células residuais podem ser armazenadas em um buffer adequado se necessário para novas experiências.</li>
		<li>Mancha o slide com uma coloração comercial kit (veja a Tabela de materiais), em conformidade com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Monte o slide com um meio de montagem apropriado e uma lamínula.</li>
		<li>Coloque a lâmina ao microscópio óptico (600 X) com a imersão de óleo.</li>
		<li>Contar pelo menos 500 células não-escamosas: neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfócitos e células epiteliais. Nota: Contagem diferencial de células é geralmente realizada por apenas um ou dois dedicados e treinados observadores para limitar interobservador discrepâncias.</li>
		<li>Registro de valores absolutos e porcentagens de cada tipo de célula.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+sputum+cell+counts:+their+usefulness+in+clinical+practice.">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li><li>Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+induced+sputum+to+investigate+airway+inflammation.">The use of induced sputum to investigate airway inflammation.</a> Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).</li><li>Leigh, T. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Evaluation+of+Nasal+and+Bronchial+Cytokines+and+Chemokines+Following+Experimental+Rhinovirus+Infection+in+Allergic+Asthma:+Increased+Interferons+(IFN-&#947;+and+IFN-&#955;)+and+Type+2+Inflammation+(IL-5+and+IL-13).">A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-&#947; and IFN-&#955;) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13).</a> EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).</li><li>Popov, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+technical+factors+influencing+the+induction+of+sputum+for+cell+analysis).">Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis).</a> European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).</li><li>Holz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+sputum+composition+between+two+inductions+performed+on+consecutive+days.">Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days.</a> Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).</li><li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+processing+on+inflammatory+markers+in+induced+sputum.">The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum.</a> European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).</li><li>Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects.">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li><li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum:+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination.">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método de escarro induzido é uma ferramenta útil para estudar o compartimento das vias respiratórias. Há várias possíveis aplicações desta técnica. Primeiro, pode melhorar o conhecimento sobre as células imunes e mecanismos envolvidos em diversas doenças respiratórias. Por exemplo, essa técnica tem permitido a investigação da inflamação das vias respiratórias em grandes coortes de pacientes, e tem sido demonstrado que cerca de metade dos pacientes asmáticos são caracterizados por um anormal das vias de inflamação eosinofílica15, 16 , 17, enquanto doentes com DPOC geralmente exibem um neutrófilo escarro levantadas contar18. Esta técnica também tem contribuído para melhor caracterização da inflamação das vias aéreas em pacientes com fibrose pulmonar idiopática e mediadores de evidências que podem contribuir para esta doença19. Em segundo lugar, a técnica de escarro induzido pode ser útil para predizer a resposta ao tratamento. Por exemplo, a presença de uma porcentagem anormal de eosinófilos escarro tem demonstrada ser um marcador preditivo de corticosteroide responsividade11,18. Em asma e DPOC, adequar a dose de corticosteroides para normalizar a percentagem de eosinófilos do escarro foi mostrado para ser mais eficaz na diminuição do número de exacerbações que o ajuste do tratamento de acordo com as actuais directrizes clínicas11 ,20,21. Em terceiro lugar, a análise do escarro pode ajudar a desenvolver terapias alvo. Por exemplo, a presença de um número anormal de neutrófilos de escarro na DPOC e alguns pacientes asmáticos tem levado ao desenvolvimento de tratamentos antineutrophilic11. Em quarto lugar, a técnica pode desempenhar um papel no diagnóstico. Por exemplo, a presença de eosinofilia de escarro é necessária fazer um diagnóstico de bronquite eosinofílica não asmática11.
Além de obter uma contagem diferencial de células, a técnica de indução de escarro também permite que o desempenho de muitas análises adicionais, ao estudar células de expectoração ou escarro sobrenadante. A análise dos mediadores8,19,22 e a avaliação da atividade quimiotáctica da amostra para eosinófilos22são exemplos com expectoração sobrenadante. De células do escarro, RNA pode ser extraído e usado para microRNA ou expressão gênica analisa19,23 . As células do escarro também podem ser analisadas pelo fluxo cytometry9,23 , que permite, entre outros, immunophenotyping e classificação de células. Além disso, escarro células podem ser cultivadas10, e sua produção do mediador pode ser medida na vitro24. É interessante notar que, neste caso, o conteúdo do mediador é diferente do que pode ser encontrado na expectoração sobrenadante. Com efeito, mediadores na expectoração sobrenadante podem ser influenciados por secreções de células residentes das vias aéreas e por exsudação de plasma, contrariando o escarro cultura celular modelo24. Finalmente, imunocitoquímica e em situ hibridação também pode ser executada usando o escarro células7.
A escarro induzido a técnica tem algumas limitações. A indução deve ser realizada sob supervisão médica. Também é essencial para o operador dar instruções completa aos pacientes. Outras limitações incluem a cooperação e a condição médica dos pacientes, que são necessários esforços respiratórios. Sobre a viabilidade desta técnica em crianças, vários estudos têm relatado que foi bem sucedida e segura em crianças com mais de 6 anos de idade25. Dados sobre crianças de &#60; 6 anos de idade estão faltando25, mas é provável que a indução de escarro é difícil de executar essas crianças14. A técnica é atualmente restrita aos serviços e centros especializados de investigação porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado1. Outra limitação é que a técnica de indução de escarro e análise não é sempre bem sucedida, significando que um cytospin legível não é sempre obtido26. No entanto, a taxa de sucesso é geralmente cerca de 80% em diferentes coortes de pacientes4,26,,27,28,29. Finalmente, o cuidado deve ser tomado quando comparando diferentes coortes de pacientes em relação a correspondência da idade, como foi mostrado para o impacto do escarro célula contagem30,31. Da mesma forma, outros parâmetros como sexo e tabaco hábitos tem que ser correspondido como eles também podem interferir com o escarro célula contagem29,32. Quando o paciente correspondência não é possível, outra maneira de considerar idade, sexo ou status de fumar é para ajustar a análise estatística para estas características.
Em comparação com outras técnicas que permitem a coleta de células de vias aéreas, como biópsias e lavado broncoalveolar lavages, o método de escarro induzido tem as vantagens de ser simples, bem tolerado, seguro, reprodutível, cost-effective e não-invasiva. Estas vantagens permitem que a técnica de escarro induzido a ser executada em grande escala e repetidamente ao longo do tempo e torná-lo uma alternativa de escolha para a amostragem das vias respiratórias. Bronchosorption é outra técnica que permite a coleta do fluido mucosa para avaliar as vias aéreas mediadores33. Enquanto esta técnica (exigindo broncoscopia) é mais invasiva do que o escarro induzido, tem as vantagens de evitar qualquer contaminação com saliva e obtenção de altas concentrações de mediadores do que na de lavagem broncoalveolar33.
Passos críticos precisam de atenção no protocolo. Primeiro, cuidado deve ser tomado sobre a concentração salina e o tempo de indução, porque esses dois parâmetros podem influenciar os resultados e, portanto, precisa ser padronizada34,35. Em segundo lugar, o mucolysis com TDT é uma etapa importante do tratamento. Em comparação com PBS, TDT foi mostrado para melhor dispersar escarro células7, que melhora a qualidade de slide cytopsin e é essencial ter uma célula pode ser reproduzido de contagem2. No entanto, o agente mucolítico pode interferir com a medição dos componentes bioquímicos.Cravação de experiências então deve ser realizado quando um novo composto bioquímico36de medição. Finalmente, uma outra etapa crítica do processo é a célula contando passo, que deve ser realizado por um técnico treinado para garantir resultados confiáveis e interpretáveis.
Um método alternativo usando fichas de escarro (peças de lêmures ou mais densas), em vez de escarro todo, também é descrito na literatura7. Ambas as técnicas têm vantagens e desvantagens. A escarro toda técnica permite mais rápido processamento7, mas é frequentemente contaminada com saliva, o que dilui a amostra e pode reduzir a qualidade do cytospins2,7. Com a técnica de seleção de plug, a contaminação da saliva é reduzida, o que significa que as amostras são muitas vezes de melhor qualidade para a dosagem dos mediadores da fase fluida e cytospin slides7. O processamento é no entanto mais7 e plugues selecionadas podem não ser representativa da amostra inteira37. É também interessante notar que nem todas as amostras contêm plugues, que podem ser um fator limitante. Ambos os métodos são validados e podem ser reproduzidos, e atualmente não há nenhuma evidência de que a contagem de células diferenciais obtidas de ambos esses métodos é diferentes de14,38.
No futuro, escarro induzido pode ser usado como uma ferramenta clínica para fornecer biomarcadores para a investigação, diagnóstico e gerenciamento de todos os tipos de doenças respiratórias inflamatórias.

Vários métodos são usados para investigar a inflamação das vias aéreas: direto de medições (como biópsias brônquicas ou lavado broncoalveolar lavages) e métodos indirectos (como sintoma, avaliação, testes de função de análise e pulmão de amostra de sangue)1. As técnicas diretas têm a vantagem de avaliar confiantemente a inflamação das vias aéreas, mas são invasiva e não viável em grande escala por causa do desconforto do paciente e o risco incorrido1. Quanto os métodos indirectos, eles mal se correlacionar com a avaliação direta da inflamação de vias aéreas1.
Coleta de escarro é outra maneira de amostras de células das vias aéreas e permite a avaliação direta da inflamação das vias aéreas. No entanto, produzir expectoração espontânea pode levar a amostras de má qualidade e não é possível para todos os pacientes2. Esta questão foi superada com o uso de nebulização ultra-sônica solução salina hipertônica para induzir a produção de expectoração2. Esse método foi inicialmente usado em pacientes infectados com o vírus de imunodeficiência humana (HIV) para o diagnóstico de pneumonia por Pneumocystis carinii pneumonia3 e foi adaptado para indivíduos saudáveis e asmáticos em 19924. Indução de escarro também é viável em pacientes mais graves com o uso de solução salina isotônica5. Embora geralmente bem tolerado, a inalação de solução salina pode causar broncoespasmo em pacientes com hyperresponsive vias aéreas5. Portanto, é aconselhável administrar um agonista beta de ação curta antes do procedimento1. Além disso, mostramos anteriormente que adicionar salbutamol para a solução salina no nebulizador ultra-sônico diminuiu ainda mais este risco6. As vantagens da indução de escarro é que é não-invasivo2 e seguro quando apropriado precauções5.
Para o processamento de amostras de escarro, dois métodos são atualmente usados na literatura: a técnica de escarro toda e a ficha de seleção7. Em nosso laboratório, é realizada a técnica de escarro de todo. O objetivo principal do processamento de escarro é obter uma contagem diferencial de células para estudar o tipo de inflamação presente no lúmen das vias aéreas. No entanto, muitas análises adicionais também são possíveis investigar processos inflamatórios e mecanismos imunes, estudando mediadores no escarro sobrenadante8 ou por meio de investigação detalhada em células de escarro (por exemplo, , fluxo cytometry9, culturas de células10, genómica10, proteomics10, imunocitoquímica7, in situ da hibridação7, etc)
A técnica de indução de escarro e análise está atualmente limitada a Pesquisar serviços e centros especializados na prática clínica porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado1. Inflamação das vias respiratórias pode ser investigada com este método para várias doenças respiratórias como a asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), tosse crônica ou de fibrose pulmonar idiopática11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1223">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Spirometer - Spirobank</td>
			<td style="width:265px;">MIR France</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:305px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salbutamol MDI - Ventolin</td>
			<td>GLAXOSMITHKLINE</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 0135-913</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Nebulizer UltraNeb</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td>UltraNeb U3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Devilbiss UltraNeb Disposable Cups &#38; Lids</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td>100HD-647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td style="width:140px;">1001005879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">One-way Valves</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">One-way Valves</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Aerosol T-connector&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Ventilation circuit monobranch corrugated</td>
			<td style="width:265px;">Int&#39;Air Medical France</td>
			<td style="width:140px;">TA30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl 5 %&#160;</td>
			<td style="width:265px;">/</td>
			<td style="width:140px;">/</td>
			<td style="width:305px;">Produced by our hospital pharmacy</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Mini-Plasco NaCl 0.9%</td>
			<td style="width:265px;">B.Braun Medical&#160; Diegem Belgium</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin</td>
			<td>GLAXOSMITHKLINE</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 0094-987</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent</td>
			<td style="width:265px;">Boehringer Ingelheim Germany</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 1543-305</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:265px;">LONZA Belgium</td>
			<td style="width:140px;">BE17512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Sputolysin reagent</td>
			<td style="width:265px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:140px;">56000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Trypan blue 0.4% solution 100 mL</td>
			<td style="width:265px;">LONZA Bio Whittaker Belgium</td>
			<td style="width:140px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer - Thoma chamber</td>
			<td style="width:265px;">Labor Optik Lancing UK</td>
			<td style="width:140px;">1500000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hemacolor Stainig set</td>
			<td style="width:265px;">Merck Belgium</td>
			<td style="width:140px;">1116610001</td>
			<td style="width:305px;">Alternative product&#160; : Diff Quik Staining Set 
			&#160;Medion Diagnostic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium - Entellan</td>
			<td style="width:265px;">Merck Belgium</td>
			<td style="width:140px;">107960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Statspin Cytofuge 12&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Beckman Coulter Belgium</td>
			<td>X00-003066-001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for sputum induction and laboratory processing

A técnica de indução de escarro e processamento é um método não-invasivo reconhecido, permitindo a coleta e a análise das células das vias aéreas, o que é interessante em várias doenças respiratórias como a asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), tosse crônica ou fibrose pulmonar idiopática. Esta técnica é bem tolerado, seguro e não invasivo, mas está atualmente limitada a serviços de pesquisa e centros especializados na prática clínica porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado. A taxa de sucesso de indução de escarro e análise é cerca de 80%.
Aqui, descrevemos a indução e laboratório de processamento de amostras de escarro. Expectoração é induzida por inalação de solução salina hipertônica ou isotônica com salbutamol. Para o processamento, nós usamos a técnica de escarro de todo. Ditiotreitol (DTT) é usado para permitir que o mucolysis de amostras de escarro. O objetivo principal do processamento de escarro é obter uma contagem diferencial de células para estudar os tipos de células presentes no lúmen das vias aéreas. Análises adicionais podem ser efectuadas na expectoração sobrenadante e as células do escarro, que podem permitir a investigação sobre processos inflamatórios e mecanismos imunes. Exemplos incluem estudando mediadores na expectoração sobrenadante e realizando um amplo espectro de análise em células de escarro como citometria de fluxo, genômica ou proteômica.
Finalmente, apresentam-se resultados representativos de análise do escarro em doentes com DPOC, asmáticos e controles saudáveis.

Hemocytometer Uma imagem típica é mostrada na Figura 1 que é visualizado com o microscópio usando o hemocytometer. Células escamosas são facilmente identificadas, como eles são muito maiores do que as células não-escamosas. Estas células escamosas são células epiteliais, vindo da boca. Os dois tipos de células estão manchados pelo azul Trypan quando morto. Cuidado deve ser tomado para evitar a contagem de leveduras, bactérias e sucata.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
Figura 1 : Hemocytometer imagens mostrando (A) a vida não-escamosas, (B) um morto não-escamosas e (C) um carcinoma de células células. Barra de escala = 50 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Cytospin slide: a Figura 2 mostra uma imagem representativa de um slide cytospin obtido após o processamento do escarro. Os diferentes tipos de células (neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfócitos e células epiteliais) podem ser diferenciados por meio de sua morfologia e coloração. Em alguns casos, a contaminação por células escamosas pode ser importante e, se a percentagem de células escamosas é superior a 80%, a amostra é considerada mal sucedida (Figura 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
Figura 2 : Imagens de slide Cytospin mostrando (A) um neutrófilo, (B) um macrófago, (C) um eosinófilo, (D) um linfócito e (E) uma célula epitelial. Barra de escala = 20 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
Figura 3 : Exemplo de um slide de cytospin de má qualidade com &#62; 80% de células escamosas. Barra de escala = 20 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Taxa de sucesso No nosso departamento, a taxa de sucesso do procedimento (combinando uma indução bem sucedida e um cytospin legível), com base em uma amostra de 1.129 pacientes (indivíduos saudáveis, asmáticos ou pacientes DPOC), é de 82% (924/1.129). Em uma análise de sub de acordo com o tipo de pacientes, a taxa de sucesso é de 75% (57/76) em indivíduos saudáveis, 82% (827/1.004) em asmáticos e 82% (40/49) em doentes com DPOC.
Resultados em indivíduos saudáveis Em uma análise retrospectiva de uma série de 289 indivíduos saudáveis do nosso departamento, a mediana (intervalo interquartil) peso de escarro foi 3,72 g (intervalo interquartil de 2,46 g - 5,54 g) e a mediana total não-escamosas contagem/g de escarro foi 0,59 x 106 ( intervalo interquartil de 0,37 x 106 - 1,29 x 106).
Os indivíduos saudáveis, a proporção de células escamosas é baixa em 19% (10% - 34%) e a viabilidade é alta em 66% (54-78%). Sobre o percentual dos diferentes tipos de células, os resultados estão resumidos na Figura 4A. Podemos observar que a porcentagem de macrófagos (49% [31-68%]) é maior do que a porcentagem de neutrófilos (34% [14% - 60%]), enquanto as percentagens de linfócitos (2% [1-3%]), eosinófilos (0% [0-0%]) e células epiteliais (4% [2-11%]) são baixas. Estes resultados são semelhantes quando os dados são expressos em valores absolutos (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
Figura 4 : Resultados representativos da contagem diferencial de células observadas em indivíduos saudáveis expressaram em percentagens (A) ou (B) valores absolutos. Os resultados são mostrados como mediana (intervalo interquartil). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Também é importante ter em conta a idade dos pacientes. Na verdade, uma forte correlação está presente entre a idade do paciente e a proporção de neutrófilos em amostras de escarro (Figura 5). Da mesma forma, quando a classificação dos pacientes segundo grupos de idade de 10 anos (Figura 6), observamos um aumento significativo da percentagem de neutrófilos, com o aumento da faixa etária. Portanto, essa variável deve ser considerada ao comparar resultados de diferentes coortes, e cuidado deve ser tomado na correspondência de assuntos.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
Figura 5: Correlação entre idade e escarro porcentagem de neutrófilos. Calculou-se a correlação com o teste de Spearman. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
Figura 6: Evolução da percentagem dos neutrófilos de acordo com a categoria de idade. O p-valor de ANOVA foi &#60; 0,0001 para a comparação da porcentagem de neutrófilos entre classes de idade. Várias comparações foram feitas com o teste de comparações múltiplas de Dunn. Os p-valores são representados como segue: * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0,01, e * * * p &#60; 0.001. Os resultados são mostrados como mediana (intervalo interquartil). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Resultados em pacientes que sofrem de doenças respiratórias A técnica de escarro induzido é comumente usada para avaliar o perfil de células inflamatórias em pacientes asmáticos.Esta técnica também pode ser aplicada para pacientes que sofrem de DPOC, outra doença respiratória inflamatória. Ao comparar indivíduos saudáveis, asmáticos e DPOC (os 3 grupos sendo pareados por idade, sexo e hábitos de tabaco), observamos que o perfil de células inflamatórias é bem diferente entre estas coortes (Figura 7). De fato, pacientes asmáticos são geralmente caracterizados por eosinófilos escarro levantadas, enquanto a proporção de neutrófilos de escarro é geralmente superior em doentes com DPOC em comparação com controles saudáveis, que está relacionada com a severidade da doença.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
Figura 7 : Perfil de células inflamatórias escarro de indivíduos saudáveis (n = 45), os pacientes asmáticos (n = 108) e doentes com DPOC (n = 54). Os três grupos foram pareados por sexo, idade e hábitos de tabaco. Os p-valores da ANOVA foram &#60; 0,05, &#60; 0,0001, e &#60; 0,0001 para a comparação de neutrófilos, eosinófilos e macrófagos entre grupos, respectivamente. Várias comparações foram feitas com o teste de comparações múltiplas de Dunn. Os p-valores são representados como segue: * p &#60; 0,05 e * * * p &#60; 0.001. Os resultados são mostrados como mediana (intervalo interquartil). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Metodologia para a indução de escarro e laboratório de processamento

Aqui descrevemos a técnica de indução de escarro. Este protocolo também explica o escarro de processamento para realizar uma contagem diferencial de células e para coletar escarro sobrenadante e as células para uma análise mais aprofundada.

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

methodology-for-sputum-induction-and-laboratory-processing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

27.3K visualizações.  University of Liege. Aqui descrevemos a técnica de indução de escarro. Este protocolo também explica o escarro de processamento para realizar uma contagem diferencial de células e para coletar escarro sobrenadante e as células para uma análise mais aprofundada.

Vídeo: Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

Executar e Processamento de FNA Pad Fat Anterior para amilóide

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Medicina

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Como medir o Folding Cortical partir de imagens de MR: um tutorial passo-a-Passo para Calcular Índice Gyrification local

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Processamento da mamoplastia redutora e tecidos humanos Mastectomia para cultura de células

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Ligadura do ducto biliar em ratos: Indução de Inflammatory Lesão hepática e fibrose por colestase obstrutiva

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Indução de Aterosclerose Acelerada em Camundongos: O Modelo de "Lesão por Fio"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the human respiratory tract. NA is a non-invasive technique which absorbs fluid from the inferior turbinate, and causes minimal discomfort. NA has yielded reproducible results with the ability to frequently repeat sampling of the upper airway. 
By comparison, alternative methods of sampling the respiratory mucosa, such as nasopharyngeal aspiration (NPA) and conventional swabbing, are more invasive and may result in greater data variability. Other methods have limitations, for instance, biopsies and bronchial procedures are invasive, sputum contains many dead and dying cells and requires liquefaction, exhaled breath condensate (EBC) contains water and saliva, and lavage samples are dilute and variable.
BA can be performed through the working channel of a bronchoscope in clinic. Sampling is well tolerated and can be conducted at multiple sites in the airway. BA results in MLF samples being less dilute than bronchoalveolar lavage (BAL) samples.
This article demonstrates the techniques of NA and BA, as well as the laboratory processing of the resulting samples, which can be tailored to the desired downstream biomarker being measured. These absorption techniques are useful alternatives to the conventional sampling techniques used in clinical respiratory research.

This manuscript describes the use of nasal and bronchial absorption techniques, specifically using synthetic absorptive matrices (SAM) to sample the mucosal lining fluid (MLF) of the upper and lower airway. These methods provide better standardization and tolerability than existing respiratory sampling techniques.

Absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da Mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Estratégias de amostragem e processamento de amostras de tecido do Biobanco de suínos modelos biomédicos

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...