Diese Arbeit wurde von der Universität Lüttich Krankenhaus (CHU Lüttich) unterstützt. Wir anerkennen "Instants Produktionen" für die Videoproduktion. Wir anerkennen auch Cedric François, der Patient, der im Film erschien.

Alle in diesem Abschnitt beschriebene Methoden wurden von der Ethikkommission der Universität Krankenhaus Lüttich genehmigt worden und alle gesunde Probanden gab schriftliche Einwilligungserklärung zur Teilnahme.
1. Sputum Induktion
<ol>
	<li>Pre- und Post-Bronchodilatator Spirometrie
	<ol>
		<li>Führen Sie eine Spirometrie (exspiratorischen Volumen in 1 Sekunde [FEV1] gezwungen und forcierte Vitalkapazität [FVC] Manöver) nach der American Thoracic Society (ATS) / European Respiratory Society (ERS) Standardkriterien12.</li>
		<li>Verwalten Sie 400 µg von inhalativen Salbutamol von einem gemessenen Dosis Inhalator (MDI) durch ein Distanzstück Gerät. Hinweis: Bei Erwachsenen sind Nebenwirkungen von inhalativen Salbutamol Tremor und Tachykardie13.</li>
		<li>Wiederholen Sie Spirometrie (FEV1 und FVC-Manöver) 15 min später, nach der ATS/ERS Standardkriterien12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der Ultraschall Vernebler Hinweis: Der Vernebler muss gründlich gereinigt und desinfiziert werden vor jedem Gebrauch gemäß den Anweisungen des Herstellers.<ol>
		<li>Füllen Sie die Verneblerkammer mit destilliertem Wasser bis zu den empfohlenen Wert.</li>
		<li>Stellen Sie eine saubere Tasse in der Verneblerkammer.</li>
		<li>Die Tasse mit dem entsprechenden Deckel abdecken.</li>
		<li>Füllen Sie die Tasse mit entweder 50 mL hypertonen Kochsalzlösung (5 %) für einen Patienten mit Post-Bronchodilatator FEV1 &#62; 65 % vorhergesagt oder 50 mL isotonische Kochsalzlösung (0,9 %) für einen Patienten mit Post-Bronchodilatator FEV1≤65 % prognostiziert.</li>
		<li>Fügen Sie 1,75 mL Salbutamol Sulfat-Lösung (5 mg/mL) auf der Tasse.</li>
		<li>Schließen Sie die Rohre und Ventile gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vernebelung und Auswurf Sammlung Hinweis: Führen Sie die Technik unter ärztlicher Aufsicht.<ol>
		<li>Erklären Sie den Ablauf für den Patienten.</li>
		<li>Lassen Sie den Patienten eine Nasenklammer verwenden.</li>
		<li>Schalten Sie den Vernebler und wählen Sie die unterste Ebene der Aerosol und Lüfter-Einstellungen.</li>
		<li>Bitten Sie den Patienten, das Aerosol durch das Mundstück mit Gezeiten Atmung für 5 min zu inhalieren. Hinweis: Aerosol und Lüfter Einstellungen können je nach Toleranz des Patienten erhöht werden.<ol>
			<li>Im Falle einer unerträglichen Husten oder Übelkeit das Verfahren einzustellen und gehen zu Schritt 1.3.5.</li>
			<li>Im Falle von Engegefühl in der Brust oder respiratorischen Beschwerden gehen Sie zu Schritt 1.3.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Deaktivieren Sie den Vernebler.</li>
		<li>Lassen Sie den Patienten die Nasenklemme entfernen, spülen den Mund mit Wasser und Gurgeln zweimal, bevor Sie in die Spüle verwerfen. Hinweis: Speichel Zellen können Sputum Probe verunreinigen und führen zu einer unbrauchbaren Probe.</li>
		<li>Bitten Sie den Patienten zu Husten, Auswurf in einen Kunststoffbehälter.</li>
		<li>Führen Sie eine Spirometrie (erzwungene exspiratorischen Manöver) zur Messung der FEV1.</li>
		<li>Die FEV1 Fall wie folgt zu bewerten: (FEV1 gemessen bei Schritt 3,8 [mL]) - (Post-Bronchodilatator FEV1 gemessen am Schritt 1.3 [mL]) / (Post-Bronchodilatator FEV1 gemessen am Schritt 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>Fällt die FEV1 um 20 % oder mehr von der Post-Bronchodilatator Wert, einzustellen Sie das Verfahren. FEV1 wieder 10 min. später zu messen. Fällt die FEV1 20 % oder mehr, Fragen Sie den Arzt zu verwalten vernebelt Ipratropium Bromid (0,25 mg/2 mL) und der Patient unter ärztlicher Aufsicht zu halten. Gehen Sie zu Schritt 1.3.10.</li>
			<li>Wenn die FEV1 nicht um 20 % oder mehr von der Post-Bronchodilatator Wert fällt, wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.9 ein-bis dreimal hintereinander insgesamt Vernebelung von 10 bis 20 min zu erreichen. Hinweis: Die gesamte Vernebelung Zeit Qualität (Vorhandensein von Steckern oder Viskose Teile) und der Auswurf Probenmenge hängt. Die Probenqualität und/oder Quantität ist schlecht nach 10 min der Vernebelung, sollte das Verfahren verlängert werden, um eine totale Vernebelung Zeit von 15 bis 20 min zu erreichen.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Halten Sie die Auswurf-Probe gekühlt bis zur Verarbeitung.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sputum Verarbeitung
Hinweis: Bearbeiten der Auswurf innerhalb von 3 Stunden der Probenahme für optimale Zellviabilität.
Achtung: Tragen Sie einen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Schutzbrille.
<ol>
	<li>Erste Vorbereitungen
	<ol>
		<li>Machen Sie eine 10-divisibel Verdünnung der Lösung konzentrierte Dithiothreitol (schleimlösende Agent) mit sterilem destilliertem Wasser 10 mL einer Lösung von 6,5 mM, gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erhalten. Hinweis: Zur Vermeidung von konzentrierten Dithiothreitol Lösung Vermischung mit Umgebungsluft zurückziehen der Lösung aus der Durchstechflasche mit eine sterile Spritze und Nadel. Nach dem Öffnen werden die Durchstechflasche konzentrierte Lösung bei Raumtemperatur aufbewahrt und innerhalb von 5 Tagen genutzt. Die verdünnte Lösung wird täglich frisch zubereitet. Achtung: Wegen Augen- und Hautreizungen Gefahr, tragen Sie Schutzausrüstung (Kleidung, Handschuhe und Schutzbrille).</li>
		<li>Machen Sie eine 5-fold Verdünnung der Lösung Trypan blau (0,4 %) mit Dulbeccos Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) eine 0,08 % ige Lösung zu erhalten. Diese verdünnte Lösung bei Zimmertemperatur aufbewahren und innerhalb von 2 Wochen. Achtung: Wegen der krebserzeugenden Gefahren tragen Sie Schutzausrüstung (Kleidung, Handschuhe und Schutzbrille).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sammlung von Sputum überstand
	<ol>
		<li>Übertragen Sie ganze Sputum in ein 50 mL konischen Boden Kunststoffrohr und Wägen Sie die Probe.</li>
		<li>Fügen Sie ein 3-fold Gewicht des DPBS Lösung.</li>
		<li>Langsam Wirbel der Probe für 30 s.</li>
		<li>Zentrifuge bei 800 X g und 4 ° C für 10 Minuten.</li>
		<li>Filtern der Probe durch 2 Einzellagen steriler Gaze und den Überstand in ein 50 mL konischen Boden Kunststoffrohr zu sammeln.</li>
		<li>Aliquoten Überstand in 2 mL Kunststoff Rohre und bei-80 ° c aufbewahren Hinweis: Überstand Proben sind nützlich, um Sputum Fluiden Phase Komponenten bestimmen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sputum Mucolysis
	<ol>
		<li>Falls erforderlich, fügen Sie DPBS zum Zelle Pellet, ein Gesamtvolumen von 5 mL Zellsuspension zu erreichen.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Zellsuspension mit 1 Volumen von 6,5 mM Dithiothreitol. Verwenden Sie einen Bank-Rocker die Zellsuspension für 20 min bei Raumtemperatur zu rocken.<ol>
			<li>Wiederholen Sie mindestens 3 Mal mit DPBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die verdünnter Zellsuspension bei 550 x g und 4 ° C für 10 min.</li></ol></li></ol>Verwerfen Sie den überstand.
		<li>Die Zelle-Pellets in etwa 1 mL des DPBS aufzuwirbeln.</li>
	
	
	<li>Bewertung der qualitativen Eigenschaften der Sputum Probe (Zellkonzentration, Plattenepithelkarzinom Kontamination und Lebensfähigkeit von Trypan blau-Ausschluss-Methode) von Hemocytometer Graf
	<ol>
		<li>Bewerten Sie und notieren Sie die genaue Menge der Zellsuspension.</li>
		<li>50 µL der Lösung 0,08 % Trypan blau 50 µL Zellsuspension hinzu und homogenisieren.</li>
		<li>Legen Sie die Probe unter dem Deckglas ein Hemocytometer (Thoma-Kammer) und legen Sie es unter dem Lichtmikroskop (400 X).</li>
		<li>Die Plattenepithelzellen, die lebenden nicht-Plattenepithelkarzinom Zellen (ungefärbt) und die Toten Plattenepithelkarzinom Zellen zählen (blau gefärbte Zellen). Hinweis: Bei zu niedriger oder zu hoher Zelldichte, konzentrieren Sie oder verdünnen Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie die Schritte 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>Beurteilen Sie die Zellkonzentration der Suspension, den Prozentsatz der Plattenepithelzellen und der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der nicht-Plattenepithelien. Hinweis: Berechnen Sie die gesamten nicht-Plattenepithelkarzinom Graf/g Sputum: Handy-Konzentration der Suspension (Schritt 5.4) * Volumen der Zellsuspension (Schritt 4.8) * % der nicht-Plattenepithelien / Gewicht der Sputum Probe (Schritt 2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der gefärbten Cytospin schieben mit der Zellsuspension und Speicherung der verbleibenden Zellen bei Bedarf Hinweis: Wenn die Zellsuspension enthält mehr als 80 % Plattenepithelkarzinom Zellen, die Probe gilt als Armen Qualität und ungeeignet für eine Cytospin Folie14. In diesem Fall die Verarbeitung unterbrechen und betrachten in diesem Beispiel nicht erfolgreich.<ol>
		<li>Ein Aliquot der Zellsuspension mit DPBS mindestens 350 µL Zellsuspension bei 500.000 Zellen/mL zu verdünnen.</li>
		<li>Montieren Sie die Zelle Konzentrator gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Füllen Sie jede der 3 Fächer des Konzentrators Zelle mit 100 µL dieser Zellsuspension.</li>
		<li>In einem Cytocentrifuge spin für 2 min bei 150 x g und Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Überstände.</li>
		<li>Zerlegen des Zelle Konzentrators gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen. Hinweis: In diesem Stadium können verbleibende Zellen in einem ausreichenden Puffer gespeichert werden bei Bedarf für weitere Experimente.</li>
		<li>Fleck, die Folie mit einem kommerziellen Färbung kit (siehe die Tabelle der Materialien), gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Montieren Sie die Folie mit einer geeigneten Eindeckmittel und einem Deckglas.</li>
		<li>Legen Sie die Folie unter dem Lichtmikroskop (600 X) mit Ölimmersion.</li>
		<li>Zählen Sie mindestens 500 nicht-Plattenepithelien: Neutrophilen, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Epithelzellen. Hinweis: Differential Zellenzahl erfolgt in der Regel nur von einem oder zwei gewidmet und geschulte Beobachter, interobserver Diskrepanzen zu begrenzen.</li>
		<li>Rekord Absolute Werte und Prozentangaben der einzelnen Zelle.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+sputum+cell+counts:+their+usefulness+in+clinical+practice.">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li><li>Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+induced+sputum+to+investigate+airway+inflammation.">The use of induced sputum to investigate airway inflammation.</a> Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).</li><li>Leigh, T. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+technical+factors+influencing+the+induction+of+sputum+for+cell+analysis).">Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis).</a> European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).</li><li>Holz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+sputum+composition+between+two+inductions+performed+on+consecutive+days.">Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days.</a> Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).</li><li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+processing+on+inflammatory+markers+in+induced+sputum.">The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum.</a> European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).</li><li>Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects.">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li><li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum:+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination.">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die induzierte Sputum-Methode ist ein nützliches Werkzeug, um die Atemwege Fach zu studieren. Es gibt mehrere mögliche Anwendungen dieser Technik. Erstens kann es wissen über Immunzellen und Mechanismen, die in verschiedenen Erkrankungen der Atemwege verbessern. Zum Beispiel dieser Technik hat die Untersuchung der Atemwege Entzündung im großen Kohorten von Patienten erlaubt, und es hat sich gezeigt, dass etwa die Hälfte der Asthma-Patienten durch eine abnorme Atemwege Eosinophile Entzündung15, gekennzeichnet sind 16 , 17, während COPD-Patienten weisen in der Regel eine erhöhte Sputum Neutrophilen zählen18. Diese Technik hat auch beigetragen, um bessere Charakterisierung der Entzündung der Atemwege bei Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose und Beweise Mediatoren, die zu dieser Krankheit19beitragen können. Zweitens kann die Technik induzierte Sputum vorherzusagen Reaktion auf die Behandlung hilfreich sein. Zum Beispiel das Vorhandensein einer abnormen Prozentsatz der Auswurf Eosinophile nachweislich eine prädiktive Marker Kortikosteroid Reaktionsfähigkeit11,18sein. Asthma und COPD zeigte Anpassung der Dosis von Kortikosteroiden, den Prozentsatz der Auswurf Eosinophile normalisieren sich mehr wirksam bei der Verringerung der Zahl der Exazerbationen als Anpassung der Behandlung nach den aktuellen klinischen Richtlinien11 ,20,21. Drittens kann Sputum Analyse helfen, um gezielte Therapien zu entwickeln. Zum Beispiel hat die Anwesenheit von eine abnorme Anzahl von neutrophilen Granulozyten Sputum in COPD und Asthma-Patienten zur Entwicklung der antineutrophilic Behandlungen11geführt. Viertens kann die Technik eine Rolle bei der Diagnose. Das Vorhandensein von Sputum Eosinophilie ist beispielsweise notwendig, um eine Diagnose von nicht-asthmatischen Eosinophile Bronchitis11.
Neben der Erlangung einer differenziellen Zellzahl, erlaubt die Technik der Induktion Auswurf auch die Durchführung von viele zusätzliche Analysen, durch das Studium entweder Sputum überstand oder Sputum Zellen. Beispiele mit Sputum überstand die Analyse der Mediatoren8,19,22 und die Bewertung der chemotaktische Aktivität der Probe für Eosinophile22. Aus Sputum Zellen RNA kann extrahiert und verwendet für MicroRNA oder Genexpression analysiert19,23 . Die Auswurf-Zellen können auch durch Flow Cytometry9,23 ermöglicht unter anderem die Immunphänotypisierung und Sortieren von Zellen analysiert werden. Darüber hinaus kann Sputum Zellen kultiviert10sein können, und ihre Vermittler-Produktion gemessene in-vitro-24. Es ist erwähnenswert, dass in diesem Fall, der Mediator Inhalt unterscheidet sich von was im Sputum überstand gefunden werden kann. In der Tat können Mediatoren im Sputum Überstand durch Sekrete aus den Atemwegen resident Zellen und Plasma Exsudation, im Gegensatz zu den Auswurf Zelle Kultur Modell24beeinflusst werden. Zu guter Letzt kann Immunocytochemistry und in Situ Hybridisierung auch mit Auswurf Zellen7durchgeführt werden.
Die induzierte Sputum-Technik hat einige Einschränkungen. Die Induktion muss unter ärztlicher Aufsicht durchgeführt werden. Es ist auch wichtig für den Betreiber, genaue Anweisungen für die Patienten zu geben. Andere Einschränkungen umfassen die Zusammenarbeit und den Gesundheitszustand des Patienten, wie respiratorische Anstrengungen erforderlich sind. Bezüglich der Machbarkeit dieser Technik bei Kindern haben mehrere Studien berichtet, dass es erfolgreich und sicher bei Kindern älter als 6 Jahre alt25war. Daten über Kinder der &#60; 6. Lebensjahr fehlen25, aber es ist wahrscheinlich, dass Sputum Induktion schwierig in diesen Kindern14durchzuführen ist. Die Technik beschränkt sich derzeit auf Dienstleistungen und spezialisierten Zentren zu erforschen, weil es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig ist und geschultes Personal1 erfordert. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Technik der Auswurf Induktion und Analyse ist nicht immer erfolgreich, was bedeutet, dass eine lesbare Cytospin26nicht immer erreicht wird. Die Erfolgsquote ist jedoch in der Regel ca. 80 % in verschiedenen Kohorten von Patienten4,26,27,28,29. Zu guter Letzt muss Vorsicht beim Vergleich verschiedener Kohorten von Patienten über die passenden Alters, wie es gezeigt wurde, um die Auswirkungen der Auswurf Zelle zählen30,31. Ebenso haben andere Parameter wie Geschlecht und Tabak Gewohnheiten angepasst werden, da sie auch mit dem Sputum Zelle zählen29,32stören können. Wenn Patienten Abgleich nicht möglich ist, ist eine weitere Möglichkeit, Alter, Geschlecht oder Rauchen Status berücksichtigen die statistische Auswertung für diese Eigenschaften anzupassen.
Im Vergleich zu anderen Techniken, die es ermöglichen, sammeln von Zellen von Airways, wie Biopsien und alvéolaire Lavages hat induzierte Sputum-Methode die Vorteile des Seins einfach, gut verträglich, sicher, reproduzierbar, kostengünstig und nicht-invasive. Diese Vorteile ermöglichen die induzierte Sputum-Technik in großem Maßstab und wiederholt im Laufe der Zeit durchgeführt werden, und machen es zu einer Alternative der Wahl für die Atemwege Probenahme. Bronchosorption ist eine andere Technik ermöglicht die Sammlung der Schleimhaut Flüssigkeit um Atemwege Mediatoren33zu bewerten. Während diese Technik (die Bronchoskopie) mehr invasiv als induzierte Sputum ist, hat es die Vorteile der Vermeidung von Verunreinigungen mit Speichel und höhere Konzentrationen von Mediatoren als alvéolaire Lavage33erhalten.
Wichtige Schritte brauchen Aufmerksamkeit im Protokoll. Erstens muss Vorsicht über die saline Konzentration und die Zeit der Induktion, weil diese beiden Parameter können Einfluss auf die Ergebnisse und daher standardisierte34,35 müssen. Zweitens ist die Mucolysis mit DVB-t-ein wichtiger Schritt der Verarbeitung. Im Vergleich zu PBS zeigte sich DVB-t besser Sputum Zellen7, zu zerstreuen, die verbessert die Cytopsin Folie und ist sehr wichtig, eine reproduzierbare Zelle zählen2. Jedoch kann die schleimlösende Agent mit der Messung von biochemischen Komponenten stören.Spick Experimente sollten dann durchgeführt werden, wenn eine neue biochemische Verbindung36messen. Schließlich ist ein weiterer wichtiger Schritt des Verfahrens der Zelle zählen Schritt, die von einem geschulten Techniker, zuverlässig und interpretierbare Ergebnisse gewährleisten durchgeführt werden müssen.
Eine alternative Methode mit Auswurf Stecker (zähflüssig oder dichteren Teile), statt die ganze Sputum wird auch in der Literatur7beschrieben. Beide Verfahren haben vor- und Nachteile. Die ganze Sputum-Technik ermöglicht die schnellere Verarbeitung7, aber ist häufig kontaminiert mit Speichel, die die Probe verdünnt und kann die Qualität der Cytospins2,7reduzieren. Mit der Stecker-Auswahl-Technik wird die Speichel Kontamination reduziert, was bedeutet, dass Proben oft von besserer Qualität für die Dosierung von Fluiden Phase Mediatoren und Cytospin Folien7. Die Verarbeitung ist jedoch länger7 und ausgewählten Stecker möglicherweise nicht repräsentativ für die gesamte Probe-37. Es ist auch erwähnenswert, dass nicht alle Proben Stecker, enthalten, die begrenzt werden können. Beide Methoden sind validierte und reproduzierbare und derzeit gibt es keine Beweise, dass die differenzielle Zellenzahlen von beiden Methoden erhalten verschiedene14,38.
In Zukunft könnte induzierte Sputum als klinische Werkzeug Biomarker für die Untersuchung, Diagnose und Behandlung aller Arten von entzündlichen Erkrankungen der Atemwege zu verwendet werden.

Verschiedene Methoden werden verwendet, um Entzündungen der Atemwege zu untersuchen: direkte Messungen (wie bronchiale Biopsien oder alvéolaire Lavages) und indirekte Methoden (wie Symptom Bewertung, Bluttests Probe Analyse und Lunge Funktion)1. Die direkte Techniken haben den Vorteil, zuverlässig beurteilen die Entzündung der Atemwege, aber sie sind invasive und nicht machbar im großen Maßstab wegen Patienten Beschwerden und das Risiko entstehen1. Wie bei der indirekten Methoden korrelieren sie schlecht mit der direkten Beurteilung der Atemwege Entzündung1.
Sputumansammlung ist eine weitere Möglichkeit, Sample-Zellen der Atemwege und ermöglicht die direkte Beurteilung der Entzündung der Atemwege. Dennoch produzieren Sputum spontan zu Proben von schlechter Qualität führen kann und ist nicht für alle Patienten2möglich. Dieses Problem konnte gelöst werden, mithilfe von Ultraschall vernebelt hypertonen Kochsalzlösung Sputum Produktion2induzieren. Diese Methode diente zunächst zur Diagnose von Pneumocystis-Carinii -Pneumonie-3 bei Patienten mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) infiziert und wurde für gesunden Probanden und Asthmatiker in 19924angepasst. Sputum Induktion kann auch bei schweren Patienten mit isotonischer Kochsalzlösung5. Obwohl in der Regel gut vertragen, kann die Inhalation von Kochsalzlösung Bronchospasmus bei Patienten mit hyperreaktiven Airways5führen. Daher wird es empfohlen, einen kurzwirksamen Beta-Agonisten vor dem Verfahren1. Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt, dass die Salzlösung in der Ultraschallvernebler Salbutamol hinzufügen weiter dieses Risiko6 verringert. Die Vorteile der Auswurf Induktion ist, dass es nicht-invasive2 und sichere, wenn die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden5.
Für die Verarbeitung von Sputum Proben, werden derzeit zwei Methoden in der Literatur verwendet: die ganze Sputum-Technik und die Stecker Auswahl7. In unserem Labor erfolgt die gesamte Sputum-Technik. Das primäre Ziel der Auswurf-Verarbeitung ist eine differenzielle Zellzahl um die Art der Entzündung in das Lumen der Atemwege vorhanden Studie zu erhalten. Viele weitere Analysen sind jedoch auch möglich, weitere entzündliche Prozesse und Abwehrmechanismen, durch das Studium der Mediatoren im Sputum überstand8 oder indem die Detailuntersuchung auf Auswurf Zellen untersuchen (z.B. , flow Cytometry9, Zelle Kulturen10, Genomics10, Proteomics10, Immunocytochemistry7, in Situ Hybridisierung7, etc.)
Die Technik der Auswurf Induktion und Analyse beschränkt sich derzeit auf Dienstleistungen und spezialisierten Zentren in der klinischen Praxis zu erforschen, weil es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig ist und geschultes Personal1 erfordert. Entzündungen der Atemwege kann mit dieser Methode für verschiedene Erkrankungen der Atemwege wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), chronischer Husten oder idiopathischer Lungenfibrose11untersucht werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1223">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Spirometer - Spirobank</td>
			<td style="width:265px;">MIR France</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:305px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salbutamol MDI - Ventolin</td>
			<td>GLAXOSMITHKLINE</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 0135-913</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Nebulizer UltraNeb</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td>UltraNeb U3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Devilbiss UltraNeb Disposable Cups &#38; Lids</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td>100HD-647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td style="width:140px;">1001005879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">One-way Valves</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">One-way Valves</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Aerosol T-connector&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Ventilation circuit monobranch corrugated</td>
			<td style="width:265px;">Int&#39;Air Medical France</td>
			<td style="width:140px;">TA30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl 5 %&#160;</td>
			<td style="width:265px;">/</td>
			<td style="width:140px;">/</td>
			<td style="width:305px;">Produced by our hospital pharmacy</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Mini-Plasco NaCl 0.9%</td>
			<td style="width:265px;">B.Braun Medical&#160; Diegem Belgium</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin</td>
			<td>GLAXOSMITHKLINE</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 0094-987</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent</td>
			<td style="width:265px;">Boehringer Ingelheim Germany</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 1543-305</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:265px;">LONZA Belgium</td>
			<td style="width:140px;">BE17512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Sputolysin reagent</td>
			<td style="width:265px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:140px;">56000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Trypan blue 0.4% solution 100 mL</td>
			<td style="width:265px;">LONZA Bio Whittaker Belgium</td>
			<td style="width:140px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer - Thoma chamber</td>
			<td style="width:265px;">Labor Optik Lancing UK</td>
			<td style="width:140px;">1500000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hemacolor Stainig set</td>
			<td style="width:265px;">Merck Belgium</td>
			<td style="width:140px;">1116610001</td>
			<td style="width:305px;">Alternative product&#160; : Diff Quik Staining Set 
			&#160;Medion Diagnostic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium - Entellan</td>
			<td style="width:265px;">Merck Belgium</td>
			<td style="width:140px;">107960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Statspin Cytofuge 12&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Beckman Coulter Belgium</td>
			<td>X00-003066-001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for sputum induction and laboratory processing

Die Technik der Auswurf Induktion und Verarbeitung ist eine anerkannte nicht-invasive Methode ermöglicht die Erfassung und Analyse von Zellen aus den Atemwegen in interessante verschiedene Erkrankungen der Atemwege wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), chronischer Husten oder idiopathischer Lungenfibrose. Diese Technik ist gut verträglich, sicher und nicht-invasive, aber beschränkt sich derzeit auf Forschungsservice und spezialisierten Zentren in der klinischen Praxis weil es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig ist und geschultes Personal erfordert. Die Erfolgsquote der Auswurf Induktion und Analyse ist etwa 80 %.
Hier beschreiben wir die Induktion und Labor Verarbeitung von Sputum Proben. Auswurf wird durch das Einatmen von hypertonen oder isotonische Kochsalzlösung mit Salbutamol induziert. Für die Verarbeitung verwenden wir die ganze Sputum-Technik. Dithiothreitol (DTT) wird verwendet, um Mucolysis von Sputum Proben zu ermöglichen. Das primäre Ziel der Auswurf-Verarbeitung ist eine differenzielle Zellzahl zur Untersuchung in das Lumen der Atemwege vorhanden Zelltypen zu erhalten. Zusätzliche Analysen können auch durchgeführt werden, auf Sputum überstand und Auswurf-Zellen, die weitere Untersuchung entzündliche Prozesse und Abwehrmechanismen ermöglichen können. Beispiele hierfür sind Mediatoren im Sputum überstand zu studieren und ein breites Spektrum von Analysen auf der Auswurf Zellen wie Durchflusszytometrie, Genomik und Proteomik.
Schließlich werden repräsentative Ergebnisse der Auswurf Analyse in gesunden Kontrollpersonen, Asthmatiker und COPD-Patienten dargestellt.

Hemocytometer Ein typisches Bild ist in Abbildung 1 dargestellt, die mit dem Mikroskop mit Hilfe der Hemocytometer visualisiert wird. Plattenepithelien sind leicht erkennbar, da sie viel größer als die nicht-Plattenepithel-Zellen sind. Diese Plattenepithelzellen sind Epithelzellen aus dem Mund kommen. Beide Arten von Zellen werden durch Trypan blau, wenn tote gefärbt. Vorsicht muß genommen werden, zu zählen, Hefen, Bakterien und Schrott.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Hemocytometer Abbildung (A) ihren Lebensunterhalt nicht-Plattenepithelkarzinom, (B) einen Toten nicht-Plattenepithelkarzinom und (C) ein Plattenepithelkarzinom Zelle. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Cytospin Folie: Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Bild der Cytospin Folie nach Auswurf Verarbeitung erhalten. Die verschiedenen Zelltypen (Neutrophilen, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Epithelzellen) können durch ihre Morphologie und Färbung unterschieden werden. In einigen Fällen Kontamination durch Plattenepithelien kann wichtig sein und wenn der Prozentsatz der Plattenepithelien größer als 80 % ist, gilt die Probe erfolglos (Abbildung 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Cytospin Folie Bild (A) eine Neutrophilen, (B) eine Makrophage, (C) eine Eosinophilen (D) eine Lymphozyten und (E) eine Epithelzelle. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Beispiel für eine schlechte Qualität Cytospin Folie mit &#62; 80 % der Plattenepithelzellen. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Erfolgsquote In unserer Abteilung die Erfolgsrate des Verfahrens (eine Kombination aus einer erfolgreichen Einarbeitung und eine lesbare Cytospin), basierend auf einer Stichprobe von 1.129 Patienten (gesunden Probanden, Asthma oder COPD-Patienten), 82 % (924/1.129). In einem Sub-Analyse nach der Art des Patienten ist die Erfolgsquote bei 75 % (57/76) bei gesunden Probanden, 82 % (827/1.004) bei Asthmatikern und 82 % (40/49) bei COPD-Patienten.
Ergebnisse bei gesunden Probanden In einer retrospektiven Analyse einer Reihe von 289 gesunden Probanden aus unserer Abteilung, der Median (Interquartilbereich) Auswurf Gewicht war 3,72 g (Interquartilbereich 2,46 g - 5,54 g) und die mittlere total nicht-Plattenepithelkarzinom Graf/g Sputum 0,59 x6 (10) Interquartilbereich 0,37 x 106 - 1,29 x 106).
Bei den gesunden Probanden der Anteil der Plattenepithelien ist gering und liegt bei 19 % (10 % bis 34 %) und die Lebensfähigkeit ist hoch bei 66 % (54-78 %). Bezüglich der Anteil der verschiedenen Zelltypen werden die Ergebnisse in Abbildung 4Azusammengefasst. Wir können beobachten, dass der Prozentsatz von Makrophagen (49 % [31-68 %]) ist höher als der Anteil der Neutrophilen (34 % [14 % - 60 %]), während der Anteil der Lymphozyten (2 % [1-3]), eosinophile (0 % [0-0 %]) und Epithelzellen (4 % [2-11 %]) sind niedrig. Diese Ergebnisse ähneln, wenn Daten in absoluten Werten (Abbildung 4 b) ausgedrückt werden.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : Repräsentative Ergebnisse für die differenzielle Zellzahl bei gesunden Probanden, ausgedrückt als Prozentsätze (A) oder (B) Absolutwerte beobachtet. Ergebnisse werden als Median (Interquartilbereich) angezeigt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Es ist auch wichtig, das Alter der Patienten zu berücksichtigen. In der Tat ist eine starke Korrelation zwischen Alter des Patienten und der Anteil der Neutrophilen im Sputum Proben (Abbildung 5). Ebenso, wenn Patienten nach 10-Jahres-Altersgruppen (Abbildung 6) klassifizieren, beobachteten wir eine deutliche Zunahme der Neutrophilen Anteil mit zunehmendem Alter. Daher diese Variable betrachtet werden, wenn Sie Ergebnisse aus verschiedenen Kohorten zu vergleichen, und Vorsicht getroffen werden, in die passenden Themen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Korrelation zwischen Alter und Auswurf Neutrophilenzahl Prozentsatz. Die Korrelation wurde berechnet mit der Spearman-Test. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
Abbildung 6: Evolution der Neutrophilen Anteil entsprechend der Lebensaltersstufe. Der p-Wert von ANOVA war &#60; 0,0001 für den Vergleich der Neutrophilen Prozentsatz zwischen Altersklassen. Mehrere Vergleiche wurden mit Dunns multiple Vergleiche-Test gemacht. Die p-Werte sind wie folgt dargestellt: * p &#60; 0,05, ** p &#60; 0.01 und *** p &#60; 0,001. Ergebnisse werden als Median (Interquartilbereich) angezeigt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergebnisse bei Patienten mit Erkrankungen der Atemwege Die Technik der induzierte Sputum wird häufig verwendet, das entzündliche Zelle Profil bei asthmatischen Patienten beurteilen.Diese Technik kann auch für Patienten mit COPD, einer anderen entzündlichen Erkrankung der Atemwege angewendet werden. Beim Vergleich von gesunden Probanden, Asthmatiker und COPD-Patienten (die 3 Gruppen für Alter, Geschlecht und Tabak Gewohnheiten verglichen wird), haben wir beobachtet, dass die entzündlichen Zelle Profil zwischen diese Kohorten (Abbildung 7 unterscheidet). In der Tat, Asthma-Patienten in der Regel erhöhte Sputum Eosinophile, zeichnen sich durch während der Anteil der Neutrophilen Auswurf bei COPD-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen in der Regel höher ist, ist mit der Schwere der Erkrankung verbunden.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
Abbildung 7 : Sputum entzündliche Zelle Profil von gesunden Probanden (n = 45), Asthma-Patienten (n = 108), und COPD-Patienten (n = 54). Die drei Gruppen wurden für Geschlecht, Alter und Tabak Gewohnheiten abgestimmt. Die p-Werte der ANOVA waren &#60; 0,05, &#60; 0,0001, und &#60; 0,0001 für den Vergleich der Neutrophilen, eosinophilen Granulozyten und Makrophagen zwischen Gruppen, beziehungsweise. Mehrere Vergleiche wurden mit Dunns multiple Vergleiche-Test gemacht. Die p-Werte sind wie folgt dargestellt: * p &#60; 0,05 und *** p &#60; 0,001. Ergebnisse werden als Median (Interquartilbereich) angezeigt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Methodik für Sputum Induktion und Labor-Verarbeitung

Hier beschreiben wir die Technik der Auswurf Induktion. Dieses Protokoll erklärt auch das Sputum Verarbeitung auszuführenden differenzielle Zellzahl und Auswurf überstand zu sammeln und Zellen zur weiteren Analyse.

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

methodology-for-sputum-induction-and-laboratory-processing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

27.3K Aufrufe.  University of Liege. Hier beschreiben wir die Technik der Auswurf Induktion. Dieses Protokoll erklärt auch das Sputum Verarbeitung auszuführenden differenzielle Zellzahl und Auswurf überstand zu sammeln und Zellen zur weiteren Analyse.

Serie: Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

Durchführung und Abwicklung der FNA Anterior Fat Pad für Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Forschung

Medizin

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Wie kortikale Faltung von MR-Bildern messen: eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Local Gyrification Index Compute

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

Induktion von Invasive Transitional Handy Blasenkarzinom in Immune intakte menschliche MUC1 transgenen Mäusen: Ein Modell für Immuntherapie Entwicklung

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induktion von beschleunigter Atherosklerose bei Mäusen: Das "Wire-Injury"-Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the human respiratory tract. NA is a non-invasive technique which absorbs fluid from the inferior turbinate, and causes minimal discomfort. NA has yielded reproducible results with the ability to frequently repeat sampling of the upper airway. 
By comparison, alternative methods of sampling the respiratory mucosa, such as nasopharyngeal aspiration (NPA) and conventional swabbing, are more invasive and may result in greater data variability. Other methods have limitations, for instance, biopsies and bronchial procedures are invasive, sputum contains many dead and dying cells and requires liquefaction, exhaled breath condensate (EBC) contains water and saliva, and lavage samples are dilute and variable.
BA can be performed through the working channel of a bronchoscope in clinic. Sampling is well tolerated and can be conducted at multiple sites in the airway. BA results in MLF samples being less dilute than bronchoalveolar lavage (BAL) samples.
This article demonstrates the techniques of NA and BA, as well as the laboratory processing of the resulting samples, which can be tailored to the desired downstream biomarker being measured. These absorption techniques are useful alternatives to the conventional sampling techniques used in clinical respiratory research.

This manuscript describes the use of nasal and bronchial absorption techniques, specifically using synthetic absorptive matrices (SAM) to sample the mucosal lining fluid (MLF) of the upper and lower airway. These methods provide better standardization and tolerability than existing respiratory sampling techniques.

Aufnahme von nasalen und bronchialen Flüssigkeiten: Precision Sampling der menschlichen Atemwege Schleimhaut und Labor Verarbeitung von Proben

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

Retinale Organoid-Induktionssystem zur Ableitung von 3D-Netzhautgewebe aus humanen pluripotenten Stammzellen

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...