MAL, JCG, ונתמכת על ידי גברת NIA (R00AG033176 וR01AG040081) ועל ידי מעבדת מחקר ופיתוח בימוי, ארה&quot;ב מחלקת אנרגית החוזה # DE-AC02-05CH11231.

1. עיבוד רקמות ועיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג רקמת שד אנושית כחומר שנזרק מפרוצדורות כירורגיות. mammoplasties ההפחתה יכולה לספק תאים נורמלים או שפירים; fibroadenomas וgynecomastias לספק תאים שפירים; רקמות כריתת שד אינן סרטניות (היקפי או נגדי לגידול, או תת עורית) לספק תאים שעשויות לנוע בין נורמלי לשפירים לmicrotumors מכיל. ודא אישור IRB תקין קיים לפני קבלת החומר שנזרק. כל החומר צריך להיות מטופלים על פי תקנות פתוגן bloodborne. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומרי מקום במכלים סטריליים המכילים חיץ או תקשורת (למשל הבינוני של 01:01 Dulbecco השינוי של הנשר והחם F-12 של) בתוספת 100 U / המ&quot;ל פניצילין, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל, 5 מיקרוגרם / המ&quot;ל Fungizone, 50U/ml polymyxin B, ו 10% סרום עוברי שור, והובלה למעבדה ב 4 ° C. רקמת ההפחתה מאמופלסטית ניתן לאחסן או נשלחה ב4 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות מבלי להשפיע באופן משמעותי suכדאיויות תא bsequent. חתיכות קטנות של רקמה מאמופלסטית הלא ירידה עשויות לדרוש עיבוד מהיר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את אזורי האפיתל ממטריצת סטרומה של רקמת שומן, רקמת חיבור וכלי דם באמצעות שילוב של מלקחיים, אזמל סטרילי ומספרי. חותך חתיכות של רקמות עם מספריים ומניחים בתבנית זכוכית גדולה סטרילי (למשל, 150 מ&quot;מ). עדינות לנתח את אזורי אפיתל, אשר מופיעים כגדילים לבנים המשובצים במטריצת סטרומה המצהיבה, תוך שימוש במלקחיים כדי להחזיק את החומר והאזמל כדי לגרד ממנו את החומר גס השומני. כדי להקל על עיכול, לחתוך את רקמת אפיתל לחתיכות קטנות יותר של 3-4 מ&quot;מ ~ באמצעות אזמלים ומקום מנוגדים למבחנת 50 מ&quot;ל. אם כמויות גדולות של רקמה שנמצאות בעיבוד, להבי אזמל טריים עשויים להיות נחוצים. הסרת חומר שומני מהצלחת לרשות בהתאם לתקנות מוסדיות. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברקמות כבדות סיביות (למשל, mas תת עוריtectomies עם מחלת fibrocystic חמורה), לא יהיה יותר חומר מוצק לבן, שאינו האפיתל. זה עלול להיות קשה לנתח את תאי האפיתל מסיבי מטריצות כאלה. חתיכות גדולות של חומר סיבי ניתן לחתוך לחתיכות קטנות יותר, כי הם ~ כיכר מ&quot;מ 1-3 באזור ומתעכלים בנפרד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רקמת אפיתל גזור לתוך צינור צנטריפוגה חרוטים (50 מ&quot;ל או 15 מ&quot;ל) עם הרקמה הכוללת שלא יעלה על שליש מהנפח של הצינור. להביא את הצינור עד נפח מלא, ומשאיר רק מרחב אוויר קטן, כדי לאפשר ערבוב במהלך סיבוב, תוך שימוש בתערובת עיכול רקמה (DME/F-12 או שווה ערך, אינסולין 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל, אנטיביוטיקה כאמורה לעיל, וריכוז סופי של 10 % FCS, collagenase 200 U / ml הגולמי וhyaluronidase 100 U / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות מקום על מסובבי צינורית HulaMixer ולסובב 360 מעלות בלילה 8 סל&quot;ד ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 600 XG למשך 5 דקות. השלך את השומן והבינוני supernatant להסכם הסילוקing לתקנות מוסדיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו להשלמת תהליך עיכול על ידי דילול aliquot קטן של הגלולה במדיום. העיכול יושלם כאשר בדיקה מיקרוסקופית מראה גושים של תאים (organoids) עם מבנים חינם מstroma המצורף (איור 1 א) חלק מופיע-ductal, מכתשיים, או ductal-מכתשיים. רקמות הפחתה מאמופלסטית בדרך כלל עדיין תצגנה stroma המצורף לאחר עיכול לילה ותדרושנה זמן עיכול נוסף. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה מתעכלת חלקי בתערובת טרייה רקמת עיכול ולדגור מחדש עם סיבוב ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4-12 שעות אחרות. חזור על שלבים 1.6 ו -1.7. אם העיכול הוא עדיין לא שלם, שוב להוסיף תערובת עיכול לגלולה ולדגור מחדש עם סיבוב על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הריכוז של אנזימים עשוי להיות מופחת למניעת יתר עיכול בן לילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העיכול יושלם, סרכזת צינורות ב 600 XG למשך 5 דקות, לשאוב לעכליון תערובת, resuspend גלולה במדיום בתוספת אנטיביוטיקה בכ 15 מ&quot;ל ml/50 צינור, צינור 5 ml/15 מ&quot;ל. </li></ol> 2. סינון והקפאה של חומר מתעכל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת aliquots של גלולת resuspended גבי מסננת מיקרומטר סטרילי 100 מעל צינור מ&quot;ל סטרילי 50. בואו לטמיון הבינוני לתוך הצינור, ואז לשטוף מחדש את organoids בזמנים מובילים 1-2x עם 2-3 מ&quot;ל של מדיום. חזור על פעולה עד שכל resuspended הגלולה הועברה. אם יש יותר מדי organoids על המסנן והבינוני כבר לא מתנקז בקלות, יש להשתמש במסנן חדש (ות) עבור החומר שנותר. זהירות להעיף את המסנן (הים) על גבי צינור סטרילי ורוחץ את organoids לתוך הצינור עם מדיום יותר. זוהי ברכת organoid מיקרומטר 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את החומר שמתנקז אל הצינור המקורי המ&quot;ל 50 ולחזור על התהליך של 2.1 באמצעות מסננת מיקרומטר 40, כדי לקבל את ברכת 40 מיקרומטר organoid, המכילה בעיקר מבני מכתשיים. החומר שמתנקז אל הצינור דואר מהווה ברכת התסנין, המכילה גושים בודדים / קטנים של תאי אפיתל mesenchymal וחתיכות קטנות של כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגלולה של 100 מיקרומטר, 40 מיקרומטר, וברכות תסנין ב 600 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, לשקם כל צינור בעל&quot;ה השנייה (או שווה ערך DME/F-12 עם 44% FCS ו 6% DMSO) באמצעות כ 1 מ&quot;ל של CPMII ל0.1 מ&quot;ל של ארז גלולה. שמור ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי מנת מבחן ל2 ברכות organoid ידי הצבת 0.1 מ&quot;ל של חומר resuspended לירידה של 35 מ&quot;מ רקמת תרבות פלסטיק מנה אחרת טיפה כמו ב3.2 להלן. ברכת התסנין ניתן לזרוע ישירות על גבי פלסטיק תרבית רקמה עם מדיום פיברובלסט (DME/F-12 או שווה ערך עם אינסולין 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו 10% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot חומר resuspended שנותר לאמפולות מקפיאה הסוג Nunc (1 מ&quot;ל / 2 אמפולה מ&quot;ל). הקפא לילה ב-80 ° C ולאחר מכן להעביר מייד לאחסון בחנקן נוזלי. יש לנו לא נצפה כל אובדן משמעותי של יכולת קיוםמאוחסן קפוא באמפולות המקורית שלנו מאז 1970 מאוחר. </li></ol> 3. זריעת Organoids ותת תרבויות העיקריות קפוא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות להפשיר אמפולה קפואה המכילה את organoids באמבטית ° C 37 מים. זרעים את organoids לתוך 2 עד 10 (6) בדרך כלל ~ 60 מנות מ&quot;מ, או 1-3 מנות 100 מ&quot;מ, בהתאם להערכה חזותית של מספר organoids באמפולה. organoids כ 20-40 seeded למנת 60 מ&quot;מ הוא אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> organoids המופשר מונחים בזהירות, טיפה אחרת טיפה, על משטח הצלחת עם המ&quot;ל פיפטה פיפטה פסטר 1 או לחלוקה שווה של organoids. Organoids הונח סמוך יחד יהיה מקום מוגבל לתולדה, והוליד פחות תאים לתת או הקפאה. הימנע מגרד את פני שטח הצלחת (תאים לא נוטים לגדול משטחים שרוטים אחרונים). חכה 1-2 דקות על מנת לאפשר לorganoids לצרף ולאחר מכן להוסיף את מקור צמיחה לאט כדי להימנע ממוציא את organoids (למשל 2-3 ml/60 מנת מ&quot;מ). אניncubate על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 humidified החממה. אלה הם התרבויות העיקריות. אנו משתמשים כעת M87A + בינוניים אוקסיטוצין (X) לצמיחת HMEC החזקה ביותר (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי היום 1, לבדוק שorganoids מחובר. הוסף מדיום נוסף (2-3 המ&quot;מ ml/60 מנה לדוגמה). נדידת תאים מorganoids צריכה להיות גלויה על 24-48 שעות, ותולדה המיטוטי ידי 48-72 שעות לאחר זריעה (האיור 1B, C). לפעמים קובץ מצורף הוא גרוע לאחר 24 שעות, במיוחד אם ציפוי organoids או organoids overdigested מנשים מבוגרות, אבל רוב ההכנות תיצרפנה בתוך 72 שעות. חתיכות קטנות של כלי הדם יכולות לצרף ולהצמיח תולדת תא פיברובלסט (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל תרבויות לפחות 3 פעמים בשבוע. תאים שגודלו בתקשורת M87A סוג לגדול למפגש קרוב בתוך 5-8 ימים, תלויים בצפיפות של זריעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צמיחה משמעותית פיברובלסט, Trypsinization דיפרנציאלי (DT), המבוסס עלניתוק מהיר של fibroblasts מפלסטיק פני השטח, יש צורך להסיר את fibroblasts. כאשר את תיקוני אפיתל הפכו תקשורת גדולה, לשאוב, צלחת לשטוף (לדוגמה, 1-2 ml/60 מנת מ&quot;מ) עם STE (מלוח, טריפסין 0.05%, 0.02% EDTA), aspirate, להוסיף STE מ&quot;ל 0.5 הטרי ולהשאיר בטמפרטורת חדר עבור סביב 1 דקות עם תצפית מיקרוסקופית מתמדת. כאשר fibroblasts לנתק אבל תאי האפיתל הם עדיין חסידים, בעדינות אך באופן חד לדפוק דופן הכלי נגד משטח קשה כדי לסלק את fibroblasts ולאחר מכן לשאוב במהירות. לשטוף פעם עם PBS, ולשאוב שוב. תרבויות מזוהמות בכבדות עם fibroblasts ייתכן DT נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת תרבויות עיקריות כאשר תיקוני אפיתל גדולים נמצאים, אבל לפני המפגש. צפיפות הזריעה ומצורפת organoid תשפיע על הזמן הנדרש. כדי לשמר את התרבות והעיקרית ליצירת תרבויות משתיים רבות, יכול להסתפק לאורך זמן, אנו מבצעים Trypsinizations החלקי (PT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב, לשטוף צלחת בקוטר 60 מ&quot;מימ עם STE 1-2 מ&quot;ל, להוסיף STE טרי מ&quot;ל 0.5 ל צלחת. ציית לניתוק תא מתחת למיקרוסקופ בטמפרטורת חדר במשך 1-5 דקות, עם דפיקות עדינות של המנה לקדם ניתוק תא. Trypsinization יש להפסיק כאשר 50% מהתאים שמנותקים. מוקדם PT בניתוק בדרך כלל יש תאים מהירים. למועד מאוחר יותר נק &#39;, תאים יכולים להיות ממוקמים על 37 מעלות צלזיוס לניתוק מהיר יותר, עם ניטור זהיר, כמו כל התאים עשויים לבוא במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מדיה המכילה סרום לצלחת, repipette להתרחץ, ולהעביר לצינור מ&quot;ל סטרילי 15. חזור עם 2x ~ 1-2 מיליליטר תקשורת נוספת, והוסיף לשטוף לצינור. Refeed המנה העיקרית ולחזור לחממה. ספירת התאים בצינור עם haemocytometer. PT בניתן לחזור סביב 4-8 פעמים עם צמיחה מחודשת של תאים טוב במנות העיקריות והצמיחה מקבילה לטווח ארוך משתיים subcultured או קפוא (תאי מעבר 2 נקראים משניים; פעם subcultured, תאים אינם loפריימריס nger). מרגע שהחומר organoid אינו קיים עוד בתרבויות העיקריות, משניים subcultured מראים ירידה בפוטנציאל הכפלת אוכלוסייה בטווח הארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תת תרבות למשנית, תאי זרע ישירות מהצינור לתוך כלים. הזריעה של צלחת 1-2 x 10 5 cells/100 מ&quot;מ במדיום חזק כגון M87A + X תוביל למפגש ב4-7 ימים. אנו מוסיפים רעלן הכולרה למדיום בקטע שני להגדלת פוטנציאל שגשוג; רעל כולרה מושמט בתרבות העיקרית משום שהיא מובילה לתולדת תא רבה שכבתית מorganoids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפאה כמשני, צינור גלולה ב 600 XG למשך 5 דקות, וresuspend בCPMII עם צפיפות סופית של 10 6 תאים / מ&quot;ל. Aliquot resuspended תאים לתוך אמפולות מקפיאה הסוג Nunc, להקפיא לילה ב-80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר מייד לאחסון בחנקן נוזלי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ להקפיא תאים מPT 1 למשמרת, ולהשתמש בתאים מPT השני לתת תרבות. PT בנוסף ניתן לאחסן הוקפא לשימוש עתידי. </li></ol>

<ol>
	<li>Prowse, K. R., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+tissue-specific+regulation+of+mouse+telomerase+and+telomere+length.">Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).</li><li>Gil, J., Peters, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+INK4b-ARF-INK4a+tumour+suppressor+locus:+all+for+one+or+one+for+all.">Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).</li><li>Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Normal+Human+Mammary+Epithelial+Cells+in+Culture.">Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture.</a> In Vitro. 16, 415-425 (1980).</li><li>Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinctions+between+the+stasis+and+telomere+attrition+senescence+barriers+demonstrated+by+long-term+culture+of+normal+human+mammary+epithelial+cells.">Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells.</a> Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).</li><li>Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).</li><li>Stampfer, M. R., Bartley, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transformation+and+continuous+cell+lines+from+normal+human+mammary+epithelial+cells+after+exposure+to+benzo(a)pyrene.">Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).</li><li>Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p16+expression+with+first+senescence+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+and+extended+growth+capacity+with+inactivation.">Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation.</a> Oncogene. 17, 199-205 (1998).</li><li>Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf-1-induced+growth+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+is+p16-independent+and+is+overcome+in+immortal+cells+during+conversion.">Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion.</a> Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).</li><li>Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+p53+function+accelerates+acquisition+of+telomerase+activity+in+indefinite+lifespan+human+mammary+epithelial+cell+lines.">Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines.</a> Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).</li><li>Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -. L., Ljung, B. -. M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+genome+instability+in+breast+cancer.">In situ analysis of genome instability in breast cancer.</a> Nat Gene. 36, 984-988 (2004).</li><li>Li, Y., Pan, J., Li, J. -. L., Lee, J. -. H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+associated+with+breast+cancer+occur+as+normal+human+mammary+epithelial+cells+overcome+senescence+barriers+and+become+immortalized.">Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized.</a> Mol. Cancer. 6, (2007).</li><li>Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+function+in+cultured+human+mammary+epithelial+cells+turns+the+telomere-length+dependent+senescence+barrier+from+agonescence+into+crisis.">Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis.</a> Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).</li><li>Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-wise+DNA+methylation+changes+are+linked+to+escape+from+defined+proliferation+barriers+and+mammary+epithelial+cell+immortalization.">Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization.</a> Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).</li><li>Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+normal+human+mammary+cell+type+specific+miRNAs.">Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs.</a> Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).</li><li>LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments.">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).</li><li>Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+multipotent+progenitors+with+a+basal+differentiation+bias+during+aging+of+human+mammary+epithelia.">Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia.</a> Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה אנושי רקמת שד העיבוד המוצג כאן מאפשרת קבלת תאי האפיתל חלב טהורים מתערובת הטרוגנית של סוגי תאים בשד האנושי. סינון הדרך נקבובית של גודל קבוע מאפשר פרדה של שברים שונים של בלוטת החלב (למשל, ductal וductal-מכתשיים לעומת מכתשיים) ממטריצת סטרומה מעוכלת. fibroblasts החלב Isogenic ניתן להשיג כדי שיתאים לתאי האפיתל. חומרים מעוכלים קפוא שמרה כדאיות טובה במשך 30 שנים. שיטה זו עבדה בהצלחה בכל אבל רקמת שד מאוד סיבית, והוא קל לביצוע. וריאציות אחרות של עיבוד רקמת שד קיימות שאינם מספקים שברי האפיתל שנמצאים כבת קיימא, נקיים, או פרודים. מיקום של organoids מעובד בתרבות עם לחץ תקשורתי וישכנע נמוכים כגון M87A מאפשר צמיחה לטווח הארוך של HMEC עם סמני שושלת מרובים. HMEC כי כבר בתרבית על פלסטיק עדיין שומר על יכולת generaמבני te 3D עם נורמלי ביחסי שושלת vivo דמויים. תרבויות HMEC אלו מתאימים לחקירה מקיפה ניסיונית, כולל תפוקה גבוהה, התנהגות HMEC נורמלית וגורמים שעשויים להניע או לעכב הזדקנות ושינוי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> זכוכית צלחת פטרי 15 סנטימטרים </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> מספרי 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> מלקחי 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> אזמלים חד פעמיים </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / סטרפטומיצין </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> סולפט Polymixin B </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> חי טכנולוגיות</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> טריפסין 0.05% 100 מ&quot;ל </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> 100 מיקרומטר מסננת התא </td><td> BD פלקון </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> 40 מיקרומטר מסננת התא </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> צינורות 15 מ&quot;ל </td><td> גריינר ביו 1 </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> צינורות 50 מ&quot;ל </td><td> גריינר ביו 1 </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> מנות TC 10 סנטימטרים </td><td> גריינר ביו 1 </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> מנות TC 6 סנטימטר </td><td> גריינר ביו 1 </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> בקבוקוני קריוגני </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> אוזר מדעי </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> אפנדורף מודל </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

בדיקה ניסיונית של תא התנהגות נורמלית אנושית חלב אפיתל (HMEC), וכיצד תאים רגילים לרכוש נכסים חריגים, ניתן בהנחייתם של מערכות תרבות במבחנת שמודל מדויק יותר בביולוגית vivo. השימוש בחומר אנושי הנגזר ללימוד התמיינות תאים, הזדקנות, הזדקנות, והנצחה הוא יתרון במיוחד בהתחשב בהבדלים הרבים המולקולריים המשמעותיים בנכסים אלה בין תאי מכרסמי אדם ובדרך כלל מנוצלים 1-2. תאי חלב להציג מערכת מודל נוחה בגלל כמויות גדולות של רקמות נורמליות ולא נורמליות זמינות בשל התדירות מאמופלסטית צמצום וניתוחי כריתת שד. בלוטת החלב מורכב מתערובת מורכבת של סוגים רבים שונים של תאים,, שומן למשל, אפיתל, mesenchymal, אנדותל. תאי האפיתל הם אחראים לתפקוד החלב המובדל של הנקה,והם גם מקורו של הרוב המכריע של מקרי סרטן שד בנשים. פתחנו שיטות לעיבוד רקמות התעלמות ניתוחית בלוטת חלב למרכיבי אפיתל טהורים כמו גם תאי mesenchymal 3. החומרים מעובדים יכולים להיות מאוחסנים קפוא ללא הגבלה זמן, או באופן יזום לתרבות העיקרית. חומרים שנזרקו כירורגים מועברים למעבדה וידנית גזור להעשרה לרקמות המכילות אפיתל. לאחר עיכול של הרקמה הגזורה באמצעות רצועות חומרי סטרומה hyaluronidase collagenase ומepithelia בקרום המרתף. את החתיכות הקטנות של העץ נובעים אפיתל (organoids) ניתן להפריד stroma עיכול על ידי סינון רציף על קרומים של גודל נקבובי קבוע. בהתאם לגודל נקבובי, שברים ניתן להשיג בהיקף של חתיכות גדולות יותר ductal / מכתשיים, צבירי מכתשיים קטנים יותר, או בתאי סטרומה. אנו צפינו צמיחה מעולה כאשר תרבויות הם יזמו כorganoids לא כדיסתאים בודדים sociated. מיקום של organoids בתרבות באמצעות תקשורת ישכנע מתח נמוך תומך בצמיחה לטווח הארוך של HMEC הנורמלי עם סמנים של סוגי שושלת מרובים (,, מוליד luminal myoepithelial) 4-5. כמות מספקת של תאים ניתן להשיג מרקמות של אדם אחד כדי לאפשר בדיקה ניסיונית נרחבת באמצעות קבוצות סטנדרטיות סלולריות, כמו גם חקירה באמצעות שיטות תפוקה גבוהות. HMEC התרבותי שהוא מועסק במגוון רחב של מחקרים הבוחנים את התהליכים הרגילים המסדירים את הצמיחה, התמיינות, הזדקנות, והזדקנות, וכיצד תהליכים נורמלים אלו שונו במהלך שינוי האלמותי וממאירים 4-15,16. ההשפעות של גידול בנוכחות של חומר חוץ תאי מטריצה, סוגי תאים אחרים, ו / או תרבות 3D יכולות להיות לעומת צמיחה ב5,15 פלסטיק. HMEC התרבותי, החל בתאים נורמלים, מספק מערכת ניסויית צייתנית לבחון גורמים העשוי להניע או למנוע הזדקנות אנושית וגידולים ממאירים.

דמויות מייצגות לרקמות מתעכלות כראוי לorganoids והניחו בתרבות מוצגות באיור 1. הרקמה מתעכלת חלקי תציג חומר עדיין מחובר לחלק החיצוני של מבנים אלה, וסביר להניח שחלק צמיחת תאי fibroblastic בתרבות העיקרית, הדורש DT להסיר. רקמת Overdigested תציג גבולות חיצוניים פחות חלקים, ועלול לקחת זמן רב כדי לצרף בתרבות העיקרית. תולדת אפיתל צריכה להתחיל בתוך 48-72 שעות (1B, C). חתיכות קטנות של כלי דם (1D) יכולות להיות מקור לתולדת התא mesenchymal. אוטופיות צמח אפיתל להראות אוכלוסיות הטרוגניות מורפולוגית, עם אוכלוסיות שגשוג המכילות תערובות של תאים עם סמנים הקשורים ל, מוליד myoepithelial, ושושלות luminal (1E, 3C-E). צמיחה בתקשורת מתח הנמוכה כגון M87A תוספת עם רעל ואוקסיטוצין כולרה תתמוך בטווח הארוך מעולהצמיחה של קיפאון טרום HMEC הנורמלי בהשוואה לניסוחי תקשורת קודמים (איור 2). תקשורת מסוג M87A גם תתמוך בצמיחה של תאי luminal ומולידו במעברים 4-8 (איורי 3C-E, 4); לאחר מכן, רוב התאים להראות סמני שושלת myoepithelial בלבד. HMEC תרבית על פלסטיק יכול לשמור על היכולת שלהם ליצור ארגון עצמי 3D הראוי בmicropatterned 3D microwells, עם תאים פנימיים לתאי myoepithelial (איור 4 א &#39;, ב&#39;) luminal, וכדי ליצור מבנים מאורגנים כאשר מצופה בMatrigel (4C, ד). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. organoids HMEC והתרבות העיקרית. () Organoid מראה מבנה ductal-מכתשיים לאחר עיכול וסינון. (B, C) Organoids מראה מבנה ductal ומכתשיים 2 ימים לאחר ההשמה בתרבות העיקרית; לציין outgr תא התחילהowth (חצים לבנים). (ד &#39;) כלי דם קטנים מצורפים ומתחיל עם תולדת פיברובלסטים מאותן תרבויות כמו B, C. (ה) תולדת אפיתל תאים מתרבות organoid העיקרית לאחר 4 ימים. שושלות מזוהות ע&quot;י השאירה עם נוגדנים לK14 (אדום) וK19 (ירוק); גרעינים הוכתמו DAPI (כחול). Luminal (K14-/K19 +, ירוק), myoepithelial (K14 + /-K19, אדום), ואב (K14 + / K19 +, צהובים) תאים גלויים. תאי בתוליים הם נצפו בליבת organoid עקב חדירת נוגדנים שלמות. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. Organoids הצמיחה של תרבויות HMEC בניסוחי מדיה שונים. המתקבל מאדם אחד, דגימה 184, היה ביוזמת בתרבות העיקרית באמצעות ניסוחי מדיה שונים. הצמיחה הטובה ביותר לטווח ארוך מתקבלת באמצעות הניסוח האחרון שלנו, M87A + אוקסיטוצין (X) 4. בינוני זה תומך גםצמיחה של שושלות HMEC מרובות (ראה איור. 1E). ניסוח תקשורת מוקדם יותר, 3 מ&quot;מ ספק צמיחה חזקה פחות, ואילו אמצעי תקשורת סרום חינם, MCDB170 (MEGM המסחרי) 17 מוביל לאינדוקציה מהירה של cyclin קינאז מעכב p16 INK4A ובחירה עבור תאי חריגים 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> איור 3. השוואה של גיוון בשושלת organoids חסר תרבות וHMEC התרבותי ב4 במעבר. (A, B) ניתוח FACS של organoid חסר תרבות, enzymatically ניתק ל() ביטוי של EpCAM וCD49f/alpha 6 integrin, ו (ב) CD227/Muc1 וCD10/CALLA. (C, D) ניתוח FACS של 4 בקטע שלפני קיפאון HMEC לביטוי של (C) וEpCAM CD49f/alpha 6 integrin, ו( ד &#39;) CD227/Muc1 וCD10/CALLA. עמ זיהויopulations מתויגים כהלפריקונים (מבטא סמנים luminal EPCAM או CD227), חבר פרלמנט האירופי (מבטא סמנים myoepithelial CD49f או CD10), או PROG (העשיר בCD49f + + EPCAM האוכלוסייה /). שים לב כי במהלך ההסתגלות לתקנת התרבות של שינויי EpCAM וCD49f לעומת organoids תרבות. (ה) לא הממוין HMEC וFACS מועשרים הלפריקונים וחבר פרלמנט אירופי, בשעת 4 בקטע ה מוכתמת לניתוח immunofluorescence של קרטין K14 (MEP סמן) וK19 (LEP מרקר) כדי לאמת את זיהוי שושלת. מוכתם גרעינים עם DAPI נראה כחול. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> איור 4. HMEC המתורבת מסוגל להרכיב מבנים מאורגנים ביחסים עם שושלת vivo דמויים כאשר הניחו microenvironments מתאים. () טרום קיפאון 4 בקטע HMEC היה FACS המועשרn בluminal הלפריקונים ושושלות MEP myoepithelial באמצעות סמנים לCD227 וCD10, עם שושלות אלו אומתו ע&quot;י ביטוי של K14 וK19 (לא מוצג). (ב) כאשר מערבבים יחד בmicropatterned microwells, את התאים בתרבית היו מסוגלים ארגון עצמי לbilayers עם חבר פרלמנט אירופי, בצד החיצוני והפנימי [הלפריקונים שהותאם מנסון ואח&#39;. 5]. הלפריקונים כותרת fluorescently (ירוק) וחבר הפרלמנט אירופי (אדום) היו הדמיה עם confocal מיקרוסקופ ב0 שעות, 24 שעות, 48 שעות ואחרי בנוסף לmicrowells (העליון). בקרת HMEC תויגו באופן שרירותי בתוויות ניאון אדומים או ירוקות (נמוך). (ג) תמונת שדה מוארת של תאי אב FACS מועשרים (cKit +) מצופה בתרבות 3D (Matrigel) וגדל במשך 18 ימים. מבנים וכתוצאה יכולים תערוכת המורפוגנזה מכתשיים. (ד) מבנים הוצאו מMatrigel ומוכתם לזהות K14 וK19; גרעינים היו counterstained עם DAPI. ניתוח Immunofluorescent מראה מבנים מאורגנים עם פולה luminal ובסיס נכונהיושרה.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture at JoVE.com

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

שיטה לעיבוד חומרי פסולת אנושיות חלב כירורגית מתוארת. רקמת מעובד, בצורה של organoids, ניתן לאחסן קפוא ללא הגבלה זמן או להציב בתרבות לצמיחה לטווח ארוך. שיטה זו מאפשרת בדיקה ניסיונית של ביולוגיה של תא נורמלית אנושית אפיתל, ואת ההשפעות של הפרעות חיצוניות.

עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

processing-human-reduction-mammoplasty-mastectomy-tissues-for-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K Views.  Lawrence Berkeley National Laboratory. שיטה לעיבוד חומרי פסולת אנושיות חלב כירורגית מתוארת. רקמת מעובד, בצורה של organoids, ניתן לאחסן קפוא ללא הגבלה זמן או להציב בתרבות לצמיחה לטווח ארוך. שיטה זו מאפשרת בדיקה ניסיונית של ביולוגיה של תא נורמלית אנושית אפיתל, ואת ההשפעות של הפרעות חיצוניות.

Video: Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

ביצוע ועיבוד FNA של Pad שומן Anterior עבור עמילואיד

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

העיקרית של תרבות האנושית שיווי המשקל schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

אדם Dupuytren של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות לחקר myofibroblasts והתאי מטריקס האינטראקציות

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

A Glioblastoma האדם דגם תרבות פרוסה Organotypic לחקר גידול תאים סרטניים ואפקטים ספציפיים לחולה של תרופות אנטי פולשניות

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...