עבודה זו נתמכה על ידי מימון את DZNE וגרנט מארי קירי הבינלאומי אפשרות (322120 כדי D.C.D.)

<ol>
	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>David, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+the+aggregating+proteome.">Aging and the aggregating proteome.</a> Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).</li><li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis.">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li><li>Ayyadevara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+Hypertension-Associated+Protein+Aggregates+in+Mouse+Heart+Have+Similar+Proteomic+Profiles.">Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles.</a> Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).</li><li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans.">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS biology. 8, 1000450 (2010).</li><li>Demontis, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO/4E-BP+signaling+in+Drosophila+muscles+regulates+organism-wide+proteostasis+during+aging.">FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging.</a> Cell. 143, 813-825 (2010).</li><li>Lechler, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Insulin/IGF-1+Signaling+Restores+the+Dynamic+Properties+of+Key+Stress+Granule+Proteins+during+Aging.">Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging.</a> Cell reports. 18, 454-467 (2017).</li><li>Reis-Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+age-dependent+changes+in+protein+solubility+identifies+genes+that+modulate+lifespan.">Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan.</a> Aging cell. 11, 120-127 (2012).</li><li>Tanase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Carbonyl+Modifications+on+Aging-Associated+Protein+Aggregation.">Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation.</a> Scientific reports. 6, 19311 (2016).</li><li>Walther, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Proteome+Remodeling+and+Aggregation+in+Aging+C.+elegans.">Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans.</a> Cell. 161, 919-932 (2015).</li><li>Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+paired+helical+filament+tau+and+normal+tau+from+human+brain+tissue.">Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue.</a> Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).</li><li>Goudeau, J., Aguilaniu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonylated+proteins+are+eliminated+during+reproduction+in+C.+elegans.">Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans.</a> Aging cell. 9, 991-1003 (2010).</li><li>Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+Aging+Drives+Protein+Accumulation+in+the+Uterus+and+Limits+Lifespan+in+C.+elegans.">Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans.</a> PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).</li><li>Uno, M., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-regulating+genes+in+C.+elegans.">Lifespan-regulating genes in C. elegans.</a> Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).</li><li>Sulston, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).</li><li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+As+a+tool+for+understanding+germline+development+in+Caenorhabditis+elegans:+uses+and+cautions.">RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions.</a> Developmental biology. 239, 177-189 (2001).</li><li>Rauniyar, N., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics.">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).</li><li>Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+polyglutamine+pathogenesis+in+C.+elegans.">Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans.</a> Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).</li><li>Fay, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+genetic+methods.">Classical genetic methods.</a> WormBook. , 1-58 (2013).</li><li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).</li><li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9, 85964 (2014).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+and+insulin+signaling+regulate+reproductive+aging+via+oocyte+and+germline+quality+maintenance.">TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance.</a> Cell. 143, 299-312 (2010).</li><li>Andux, S., Ellis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+maintains+oocyte+quality+in+aging+Caenorhabditis+elegans+females.">Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females.</a> PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).</li><li>Vilchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPN-6+determines+C.+elegans+longevity+under+proteotoxic+stress+conditions.">RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions.</a> Nature. 489, 263-268 (2012).</li><li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans.">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).</li><li>Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+the+Trade-Off+between+Somatic+Proteostasis+and+Reproduction+in+Caenorhabditis+elegans+Models+of+Polyglutamine+Diseases.">Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases.</a> Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).</li><li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+adult+neuronal+IIS/FOXO+transcriptome+reveals+adult+phenotype+regulators.">The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators.</a> Nature. 529, 92-96 (2016).</li><li>Kawarabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+brain,+CSF,+and+plasma+amyloid+(beta)+protein+in+the+Tg2576+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).</li><li>Kraemer, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+and+defective+neurotransmission+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy.">Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנחנו מדווחים על מתודולוגיה לבודד אגרגטים חלבון מאוד לא מסיס להזדקן C. elegans נתון RNAi לניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה סופג המערבי. אנו מראים כי שיפור פרוטוסטאזיס על-ידי הפחתת IIS במידה רבה מונעת צבירת חלבונים תלויי-גיל. על-ידי בחירת חלבונים צבירת-מועדים ספציפיים כדי overexpress C. elegans, זה אפשרי לנתח נוסף המנגנונים להתכוונן חלבון הגלום צבירה.
חלבונים תלויי-גיל הגלום צבירה לעומת צבירה חלבונים הקשורים למחלה העבודה הנוכחית מתבססת על הממצאים הקודמים כי צבירת חלבון היא לא מוגבלת חלבונים ספציפיים צבירה בהקשר למחלה. על-ידי התמקדות אנדוגני חלבונים צבירת נוטה יותר מאשר ectopically ביטוי חלבונים הקשורים למחלה, הציפייה היא לספק הרומן תובנה פיזיולוגית רגולציה של תהליך צבירת. כמו אגרגטים חלבון תלויי-גיל מצויים במקומות שונים הסלולר5, המחקר שלהם אמור גם לספק תובנה תא מסוים מנגנוני בקרת איכות. בסך הכל, מנגנוני בקרה חלבון הגלום צבירת יכול גם להיות רלוונטי במניעת מחלת חלבון צבירה ראוי לציין, למרות צבירת חלבונים תלויי-גיל דומה בצבירת מספר היבטים המחלה חלבון, עדיין עדיין לא ברור אם אגרגטים אלה מכילים הסיבים עמילואיד, מאפיין של אגרגטים למחלות רבות.
הבחירה של C. Elegans דגם: יתרונות ומגבלות בהשוואה למודל יונקים, אחד היתרונות הגדולים של שימוש C. elegans ללמוד מאפיין זיקנה היא תוחלת החיים קצרה מאוד שלה. מאות חלבונים שונים באופן עקבי להיות מאד-צבירת-מועדים במהלך ההזדקנות, עלייה זו גדולה insolubility בקלות לזיהוי אפילו עם מיצוי הביוכימי מפושטת. מגבלה משמעותית של השימוש C. elegans ללמוד צבירת חלבונים תלויי-גיל זאת, הצורך לבודד מספר גדול של בעלי חיים גיל. כמו C. elegans הן אנדרוגיניות ולייצר כ 220 או רומא עוד בתקופת הרבייה שלהם שלב19, זה חיוני כדי למנוע רבייה או לחסל את רומא כדי גיל אוכלוסיה. קיימות מספר אפשרויות לגרום עקרות: אפשרות אחת היא שימוש fluorodeoxyuridine כימיים (FUdR), מעכב של סינתזת ה-DNA. עם זאת, FUdR מוביל רבים תופעות לוואי לרבות שינויים פרוטוסטאזיס האופטימיזציות חלבון צבירת20,21,22. חשוב לציין, FUdR גורם ספציפי גנוטיפ תגובות23. אפשרות נוספת היא להשתמש הרגיש סטרילי מוטציות. לדוגמה, spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141), ו gon-2(q388) שימשו בעבר ניתוחים ספקטרומטר מסה של תלויי-גיל בהעלאת פרוטאום5, 8.
אך ישנם מספר מגבלות שקשורים לשימוש המוטנטים האלה. ראשית, כמו העקרות היא תלוית טמפרטורה, יש צורך לגדל את החיות ב 25 ° C, אשר מהווה הלחץ מתון, מאיץ הזדקנות, כמו גם חלבון צבירת. לעומת זאת, הבחנו כי מוטציות גון-2, glp-1 ו fem-1 הם longer-lived לעומת פראי-סוג כאשר ומתוחזק על 25 ° C (נתונים לא מוצג). שנית, יש מגבלות מסוימות הקשורות לכל סוג של פגם הרבייה. חיסרון אחד של שימוש זרע תקינה מוטציות הוא הייצור של oocytes מופרית (מיוצר גם בגילאי אנדרוגינוסים פראי-סוג). האיכות של אלה oocytes מסרב באופן משמעותי עם הגיל ולצבור בלוטת המין24,25. ניתוח כמותי ספקטרומטר מסה מדגים כי מוטציות זרע תקינה יש מספר קיפול רמות גבוהות יותר של חלבונים לא מסיסים צבירת עם הגיל בהשוואה מוטציות פחות בלוטת המין או germline לקויה. מציין חלבון misfolding, צבירת ממוקם בלוטת המין5, מסכים עם הקודם מחקרים12,13 , ויוו ניסויים חושפניים חלבונים צבורים ממוקם oocyte חריגה אשכולות5. לכן, צבירת החלבון ב- בלוטת המין יסתיר שינויים עדינים יותר בצבירת חלבונים ברקמות סומאטית. זה גם נחשבות בהשוואת התערבויות לפעול הרחבות שונות על פרוטוסטאזיס ברקמות הרבייה וגופניות. לכן, כדי להעריך רק חלבון סומאטית צבירה, אנחנו מעדיפות באמצעות מוטציות בלוטת המין-פחות גון-2 . חלופה יהיה להשתמש מוטציות germline לקויה glp-1 . עם זאת, נציין אלה שלבעלי-חיים יש פחות הגלום צבירת חלבון עם הגיל בהשוואה גון-2 מוטציות5. . זה כנראה תוצאה של פרוטוסטאזיס משופרת ברקמות סומאטית עקב איתות ה27,26,תקינה germline בלוטת המין28... אלטרנטיבה אחרת היא להשתמש בבעלי חיים פראי-סוג, להסיר את רומא כל יום על-ידי שיקוע. עם זאת, זה בעייתי בגלל הקושי לחלוטין הסרת כל רומא.
עוד מגבלה כללי השימוש C. elegans הוא גודלו הקטן, מה שהופך את רקמות ספציפיות עקירות מאתגר. כמו עקירות כל בעלי חיים כאלה אינם מספקים מידע רלוונטי הקשור תנאים שונים איך לווסת את צבירת חלבונים ברקמות מסוימות. ראוי לציין, בעיה זו יכול באופן פוטנציאלי שיפרו באמצעות השיטה פיתחה לאחרונה בהתבסס על תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון כדי לבודד תאים ספציפיים של C. elegans29. עדיין נשאר שיקבע אם שיטה זו יהיה מתאים להשיג מספיק חומר לחילוץ חלבונים לא מסיסים, בין אם זה יהיה ישים בגילאי חיות. לחלופין, רקמת חלבון ספציפי צבירת ורגולציה שלה יכול ייחקרו על ידי ניסויים נוספים ויוו . כחיות הטרנסגניים לבטא שכותרתו fluorescently חלבון צבירת נוטה להתמקד יכול במהירות להיווצר, כמו החיות הם שקופים, זה יחסית קל לבחון חלבון צבירת בחיי עיר.
בסך הכל, זה חיוני לעקוב אחר התוצאות פרוטיאומיה מבנית עם ויוו ניסויים ברקע פראי-סוג. השילוב של אפיון הביוכימי, מבוסס מיקרוסקופיה מאפשר מחקר מקיף של חלבון מצבור הערכה על תפקידם של הגנים של עניין. האחרון בהנחייתם של C . elegans RNAi בתיווך מצרי באמצעות האכלה ואת הזמינות של כל הגנום RNAi ספריות. בנוסף, קיימים מספר רב של מוטציות מאופיין לאישור התוצאות המתקבלות על-ידי RNAi או להשתמש במקום RNAi.
תרבית נוזלית והפקת הביוכימי: יתרונות ומגבלות כמו חלבונים המצטברים מאוד מהווים רק חלק קטן של חלבונים הכולל, יש צורך להתחיל את החילוץ עם מספר גדול של בעלי חיים. עם כמויות גדולות של חלבונים לא מסיסים, זה ואז ריאלי לביצוע פפטיד נרחב fractionation כדי להפחית את המורכבות מדגם ספקטרומטר מסה וכך לשפר את זיהוי של חלבונים בשפע נמוך יותר. אם רק כמויות קטנות של חלבונים לא מסיסים נדרשים, דרך חלופית היא לגדל תולעים על צלחות homogenize אותם עם חרוזים קרמיים. אחד החסרונות של תרבות נוזלי היא כי במקרה של זיהום, כל התרבות מושפע חייב להיות מושלך. באופן כללי, C. elegans הזדקנות מושפעת מאד טמפרטורה, פרמטר זה חייבים להיות מבוקרים היטב בתרבות נוזלי כדי להימנע בווריאציות צבירת חלבונים תלויי-גיל. בקרת טמפרטורה חיוני גם להשיג אוכלוסיה הומוגנית של בלוטת המין-פחות בעלי חיים בעת שימוש המוטציות gon-2(-) .
בהתאם המטרה של המחקר, חשוב לשקול בשיטות חילוץ שונות. החילוץ הביוכימי המובאת כאן הותאמה בתחילה מן הפרוטוקולים לבודד אגרגטים הקשורים למחלה11,30,31. בחרנו ריכוזים גבוהים יחסית של דטרגנטים כגון 0.5% מרחביות לבודד מצרפי יותר לא מסיסים. גם על-ידי pelleting 0.5% מרחביות מצרפי לא מסיסים במהירויות נמוכות צנטריפוגלי, פרוטוקול זה רק לבודד מצרפי גדול יותר. לחלופין, פרוטוקול מחמירים פחות היה שפורסמו לאחרונה10. במחקר זה, אגרגטים קטנים של מסיס יותר חולצו גם על-ידי השמטת מרחביות ועל -ידי שימוש במהירויות מאוד גבוהות צנטריפוגלי ב g 500,000 x. השוואה של הפרוטוקולים השונים מראה עלייה כללית במספר של חלבונים ב- פרוטאום צבירה באמצעות פרוטוקול7מחמירים פחות. נציין כי מאריכים חיים עם מופחת הדף היומי-2 מערכת אזעקה יעילה למנוע ההצטברות של מרחביות מסיסים והן אגרגטים מרחביות-לא מסיס ב בלוטת המין-פחות חיות7.
אין ויוו ניתוח של צבירת חלבונים תלויי-גיל כאשר בונים מודלים מהונדס לצורך צבירת חלבונים תלויי-הגיל הבאות, זה רלוונטי לשקול איזו רקמה כדי overexpress החלבון נוטה צבירת עניין ועל איזה רמות הביטוי. אנחנו מעדיפות ביטוי ברקמות הממוקמים באזור הראש כדי למנוע הפרעה autofluorescence, אשר בולט במעי הזדקנות. כדי להמחיש את התווית על-ידי פלורסנט אגרגטים עם ההגדלה נמוך, החלבון צבירת נוטה צריך להתבטא ברמה גבוהה יחסית. מצד שני, ביטוי גבוה מדי יגרום החלבון צבירת נוטה אל טופס אגרגטים כבר בבעלי חיים צעירים.
יחדיו, שיטות אלה יעזור לנו להבין למה חלק פרוטאום אגרגטים עם הגיל ולהוביל בסופו של דבר להתפתחות של אסטרטגיות קידום הזדקנות בריאה.

חלבון misfolding, צבירת מזוהים בתור סימן היכר של מספר מחלות ניווניות כגון נוירודגנרטיביות (ALS) לספירה, PD, ומובהקת (חדרתי), ועוד רבים אחרים. למשל, הרכבות α-synuclein לתוך הסיבים עמילואיד זה לצבור כמו גופיפי בפרט הסובסטנציה ניגרה של החולים במחלה, ואילו ב- ALS חולים misfold TDP-43 או FUS כדי אגרגטים cytoplasmic טופס המתנוונת מוטורי לגלוקוז. בכל אחד של הפרעות ניווניות אלה, מנגנוני שמירה על הומאוסטזיס חלבון או פרוטוסטאזיס להיכשל כדי למנוע ההצטברות של חלבונים misfolded, וכתוצאה מכך מוביל למחלות.
פרוטוסטאזיס היא קריטית כדי להבטיח תאיים ושליטה בתנאים רגילים מנגנונים רגולטוריים אלה בחוזקה הקצב של סינתזת חלבונים, קיפול, והשפלה. מספר מחקרים מדגימים כי עם ההזדקנות, היכולת של תאים ואיברים רבים, כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון נפרצת בהדרגה, ההידרדרות פיזיולוגיים של הרשתות פרוטוסטאזיס עם הגיל הוא פקטור חשוב מחמירות עבור מחלות ניווניות (נבדקה הפניות1,2,3). העובדה כי את בקרת האיכות של חלבון וגם התגובה התאית פרש חלבון מתח נחשפים עם גיל מציע כי חלבון misfolding, צבירת יכול להיות תוצאה כללית של הזדקנות. אכן, אנחנו ואחרים הראו כי צבירת חלבון אינה מוגבלת למחלות והופך להיות במקום חלק פרוטאום מאוד דטרגנט-לא מסיס חיות בגילאי4,5,6,7 ,8,9,10. ניתוח חישובית, ויוו גילה כי אלה אגרגטים הפיזיולוגיות הקשורות לגיל דומים המחלה אגרגטים היבטים מספר5. הגילוי של צבירת חלבון אנדוגני, תלויי-הגיל נותן לנו את ההזדמנות כדי לנתח את המנגנונים הסלולר המולקולריים המסדירים מצבור חלבון, ללא שימוש ectopically ביטוי חלבונים הקשורים למחלות אנושיות. כיום, קיים מידע מוגבל על התקנון של חלבון נפוץ insolubility ועל ההשפעות של זה dysregulation על הבריאות של האורגניזם.
נמטודות C. elegans הוא אחד האורגניזמים דגם באופן מקיף ביותר למד ב הזדקנות מחקר כמו החיות האלה יש אורך חיים קצר יחסית ולהראות תכונות האופייניות הזדקנות רבות הנהוגות עילאיים. השפעות ההזדקנות על חלבון insolubility נחקרו C . elegans מאת רציפים fractionation הביוכימי בהתבסס על מסיסות דיפרנציאלית, אשר נמצא בשימוש נפוץ להוציא אגרגטים המחלה בתחום של מחקרים הקשורים ניוון מוחיים11 . באמצעות ספקטרומטר מסה כמותית, הוצגו מספר חלבונים מאות להפוך צבירת נוטה C . elegans בהיעדר מחלת5. כאן נתאר בפירוט פרוטוקול לגדול מספרים גדולים של תולעים החילוץ רציפים כדי לבודד חלבונים צבורים על כימות באמצעות ספקטרומטר מסה וניתוח מאת תספיג ותרבות נוזלי. כי חלבונים misfolded של צבירת נוטה להצטבר יישון C. elegans גונדות ומסכות שינויים אחרים רקמות סומאטית5,12,13, נשתמש מוטציה בלוטת המין-פחות להתמקד בניתוח חלבון insolubility ברקמות שאינן-הרבייה. השיטה המובאת המאפשרת הניתוח של אגרגטים גדולים, מאוד לא מסיס מסיסים ב- 0.5% מרחביות, מגורען על ידי מהירות צנטריפוגלי נמוכה יחסית. לחלופין, היה נוהל חילוץ מחמירים פחות לאסוף גם אגרגטים מסיס יותר ויותר שפורסם במקומות אחרים10. בנוסף, אנו מתארים את שיטת להערכת צבירת ויוו C. elegans.
בסך הכל, שיטות אלה בשילוב עם התערבות ב RNA (RNAi) ניתן להעריך את התפקיד של גנים של עניין להתכוונן צבירת חלבונים תלויי-גיל. בשביל זה אנו מתארים את הניתוח של תמציות של תולעים, בגיל צעיר עם ובלי נוקאאוט של חלבון ספציפי עניין באמצעות RNAi. שיטות אלה צריך להיות כלי רב עוצמה כדי לקבוע אילו רכיבים של הרשת פרוטוסטאזיס לווסת את החלבון insolubility. מספר התערבויות מופחתת כמו פקטורי גדילה דמויי אינסולין/אינסולין (IGF) 1 איתות (IIS) הוכחו באופן דרמטי לעיכוב הזדקנות C. elegans 14. אריכות ימים מסלולים לעיתים קרובות לגרום מנגנוני בקרת איכות חלבון, ולכן המסלולים הללו יכול להיות פעיל השפעה על קצב צבירת חלבון. לדוגמה, נדגים צבירת מופחתת חלבון הטמון בבעלי חיים ארוכים על עיכוב של מסלול IIS7.

<table style="border-collapse:collapse;width:635pt" width="847">
	<colgroup>
		<col style="width:161pt" width="215" />
		<col style="width:92pt" width="122" />
		<col style="width:258pt" width="344" />
		<col style="width:125pt" width="166" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Fernbach culture flask&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Corning</td>
			<td class="xl19" style="width:258pt" width="344">4425-2XL</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Membrane Screw Cap&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Schott</td>
			<td class="xl19">1088655</td>
			<td class="xl17">GL45</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Nutating Mixer</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">VWR</td>
			<td class="xl19">444-0148</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Separatory funnel</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Nalgene</td>
			<td class="xl19">4300-1000</td>
			<td class="xl17">Capacity 1,000 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">1 ml syringe&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">BD Plastipak</td>
			<td class="xl19">300013</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Gray needle, 27 G x &#189; &#34;, 0.4 mm x 13 mm</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">BD Microlance 3</td>
			<td class="xl19">300635</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Membrane filters 0.025 &#181;M</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Millipore</td>
			<td class="xl19">VSWP04700</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">pH strip</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Machery-Nagel</td>
			<td class="xl19">92110</td>
			<td class="xl17">pH-Fix 0-14</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Roche</td>
			<td class="xl19">4693132001</td>
			<td class="xl16" style="width:125pt" width="166">Complete Mini EDTA-free tablets&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Octoxynol-9&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Applichem</td>
			<td class="xl19">A1388</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">M1317</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Nonylphenylpolyethylenglycol</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Applichem</td>
			<td class="xl19">A1694</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Nonidet P40 (NP40)</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">DNaseI</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Roche</td>
			<td class="xl19">04716728001</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">recombinant, RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">RNaseA</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Promega</td>
			<td class="xl19">A7973</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">solution</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Total protein blot staining</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermofisher</td>
			<td class="xl19">S11791</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Sypro Ruby protein blot stain</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Total protein gel staining</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermofisher</td>
			<td class="xl19">S12001</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Sypro Ruby protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Serva</td>
			<td class="xl19">36970</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Iodoacetamide</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Serva</td>
			<td class="xl19">26710</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Ammoniumbicarbonate</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">09830</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Promega</td>
			<td class="xl25" style="width:258pt" width="344">V5111</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Isobaric tags for relative and absolute quantitation</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sciex</td>
			<td class="xl19">4352135</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">iTRAQ Reagents Multiplex Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge Avanti J-26XP</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Beckmann Coulter</td>
			<td class="xl19">393126</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Ultracentrifuge Optima Max-XP</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Beckmann Coulter</td>
			<td class="xl19">393315</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge 5424R</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5404000413</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge 5702</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5702000329</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge Megafuge 40R</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75004518</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Concentrator Plus</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5305000304</td>
			<td class="xl17">Centrifugal evaporator</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Fluorescent stereo-microscope M165 FC&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Leica</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">With Planapo 2.0x objective</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Dissection microscope</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Leica&#160;</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17">Leica S6E</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="80" rowspan="2" style="width:161pt;height:60.0pt" width="215">High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td class="xl18" height="80" rowspan="2" style="width:92pt;height:60.0pt" width="122">Zeiss</td>
			<td class="xl19" height="80" rowspan="2" style="width:258pt;height:60.0pt" width="344"></td>
			<td class="xl16" height="80" rowspan="2" style="width:125pt;height:60.0pt" width="166">With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">Software</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl32"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Image analysis software</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">ImageJ</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Analysis of mass spectrometry data</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Protein Prospector</td>
			<td class="xl136" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl137">http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">E.coli strain</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">OP50</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">CGC</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">RNAi bacteria</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">L4440</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Julie Ahringer RNAi library</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">C. elegans mutants</td>
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122"></td>
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl17" height="42" style="height:31.5pt">CF2253</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">CGC, strain name: EJ1158&#160;</td>
			<td class="xl40" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl17">Genotype: gon-2(q388)</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">C. elegans transgenics</td>
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122"></td>
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">DCD214</td>
			<td class="xl25" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122">Della David&#39;s lab at DZNE T&#252;bingen</td>
			<td class="xl40" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl68" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166">Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">DCD215</td>
			<td class="xl87" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122">Della David&#39;s lab at DZNE T&#252;bingen</td>
			<td class="xl40" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl68" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166">Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study changes in inherent protein aggregation with age in caenorhabditis elegans

בעשרות השנים האחרונות, השכיחות של הפרעות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), גדל. הפרעות הקשורות לגיל אלה מאופיינים במראה של אגרגטים חלבון עם מבנה fibrillary במוחם של חולים אלו. בדיוק הסיבה חלבונים מסיסים בדרך כלל עוברים תהליך צבירת נשאר ממעטים להבין. גילוי חלבונים צבירת אינה מוגבלת תהליכי מחלה וזה במקום חלק מתהליך הזדקנות נורמלית מאפשר חקר המנגנונים המולקולריים הסלולר המסדירים מצבור חלבון, ללא שימוש ectopically הביע אנושי חלבונים הקשורים למחלה. כאן נתאר מתודולוגיות לבחון צבירת חלבון הגלום ב Caenorhabditis elegans דרך גישות משלימות. ראשית, נבחן כיצד לגדל מספר גדול של גיל-מסונכרנות C. elegans לקבל חיות בגילאי, אנו מציגים את ההליכים ביוכימי כדי לבודד אגרגטים מאוד לא מסיס-גדול. בשילוב עם נוקאאוט גנטי יישוב, זה אפשרי לנתח את התפקיד של גנים של עניין לקדם או למנוע צבירת חלבונים תלויי-גיל באמצעות ספקטרומטר מסה כמותיים או ניתוח מקיף. ניתוח המבוסס על המועמד עם נוגדנים. ממצאים אלה ואז מאושרות על-ידי ניתוח ויוו עם חיות הטרנסגניים המבטאים חלבונים צבירת נוטה מתויג פלורסנט. שיטות אלה צריך לעזור להבהיר מדוע חלבונים מסוימים נוטים צבירה עם הגיל, ובסופו של דבר איך לשמור חלבונים אלה תקינים.

השתמשנו השיטות המובאות להעריך איך מאריכים חיים עם IIS מופחתת לווסת את צבירת חלבונים תלויי-גיל. מאת המערבי כתם (ראה שלב 2.2, מהר מיצוי חלבונים לא מסיסים לניתוח תספיג), אנו ניתח את הסיכום והתוכן חלבונים לא מסיסים של יאנג (יום 3 של בגרות), בגילאי תולעים (יום 18 של בגרות) על שליטה RNAi ועל RNAi מיקוד האינסולין / לקולטן IGF-1-כמו הדף היומי-2. . הבחנו אין שינויים גדולים ברמות החלבון הכולל עם הגיל או בין שליטה הדף היומי-2 תנאים RNAi (איור 2א). כצפוי, הבחנו עלייה חזקה הקשורות לגיל רמות החלבונים לא מסיס מאוד בבעלי השליטה (איור 2B). לשם השוואה במאריכים חיים על הדף היומי-2 RNAi, צבירת הנטייה צומצם באופן משמעותי. כל חלבון מכתים של תמציות לא מסיסים חשף חלבון פחות מורכב הלהקה דפוס תמציות בת 18 יום תולעים על הדף היומי-2 RNAi לעומת שולט מתאימים-גיל. ניתוח כמותי ספקטרומטר מסה הפגינו מאריכים חיים עם IIS מופחתת יש הכולל צבירת חלבונים הקשורים בגיל פחות וזה חשוב, הדף היומי-2 עכבות לחלוטין יושב על insolubility תלויי-הגיל של משנה ספציפית של חלבונים7. מעקב על ממצאים אלה, התמקדנו על אחד החלבונים האלה צבירת מועדת, PAB-1. PAB-1 הוא מחייב RNA חלבון עם תחום "פריון כמו" החזוי. נוגדן מכתים אישר כי מאריכים חיים מתוחזק PAB-1 מסיס עם הגיל (איור 2C).
אין ויוו ניתוח של מצבור PAB-1, שהפקנו חיות הטרנסגניים לבטא tagRFP::PAB-1 בהשרירים בלוע. בבעלי חיים צעירים, tagRFP::PAB-1 היה בעיקר diffusely ממוקם לאורך הלוע (איור 3א', רמת צבירה "נמוך") אבל עם הגיל, הבחנו הצטברות מתקדמת ב puncta בהיר החל הנורה בלוע האחורי ( איור 3A, רמת צבירה "ביניים"). במהלך ההזדקנות, אנחנו גם נצפתה צבירה בהנורה לועי הקדמי (איור 3א', רמת צבירה 'גבוהה') מספר גדל והולך של בעלי חיים. על ידי קיבוץ חיות אלה בקטגוריות שונות, אנחנו הבקיע קצב צבירת PAB-1 באוכלוסיה. באותו יום 2 של בגרות רוב התולעים (88%) היו אף אחד או מעט מאוד puncta, אין חיות עם רמות גבוהות צבירת אותרו. כבר ביום 5, 19% של האוכלוסיה הראה ביניים ו 16% צבירה גבוהה ברמות בעוד יום 7 יותר מ 70% של התולעים הציג צבירת בחט רמות. כדי לנתח את ההשפעה של אריכות ימים על צבירה תלויי-הגיל של tagRFP:PAB-1, יצרנו tagRFP::PAB הטרנסגניים-1 תולעים עם מוטציה הדף היומי-2 . בעלי חיים אלה הראו tagRFP:PAB מופחת באופן משמעותי-1 היווצרות puncta עם ההזדקנות, עם פחות מ- 15% מהאוכלוסייה המציגות צבירת בחט רמות אפילו יום 7 (איור 3ב).
באמצעות הגישות השונות שתוארו כאן, אנחנו חשף כי מופחת IIS מונעת צבירת חלבונים תלויי-גיל כדי הרחבות שונות, מאריכים חיים יעילים במיוחד עבור שחזור את הדינמיקה של PAB-17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig1.jpg"> איור 1 : סכימטי של זרימת העבודה כדי ללמוד לשינויים חלבון הגלום צבירה עם הגיל ב C. elegans.  השלבים העיקריים מודגשים. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig2.jpg"> איור 2 : חלבון insolubility עולה עם הגיל בבעלי שליטה, אבל לא אצל בעלי חיים עם איתות מופחתת הדף היומי-2 - (א) חלבון הכולל כתמים שבר מוחלט בין יום 3 מוטציות gon-2(-) 18 יום נתון שליטה הדף היומי-2 RNAi (גדל ב- 25 ° C). (B) חלבון הכולל כתמים מרחביות-לא מסיס שבר בין יום 3 מוטציות gon-2(-) 18 יום נתון שליטה הדף היומי-2 RNAi (גדל ב- 25 ° C). לוח פרסום מחדש הפניה7. Immunoblot (ג) גילוי PAB-1 בשבר מרחביות-לא מסיס, חלבון הרלוונטיים להקות שמציין החץ האדום. לוח פרסום מחדש הפניה7. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig3.jpg"> איור 3: הדף היומי-2 מופחתת איתות מונע ההצטברות של tagRFP::PAB-1 puncta עם הגיל. (א) נציג תמונות של תולעים עם ביטוי tagRFP::PAB-1 בהשרירים בלוע (בהגדלה מיקרוסקופ, הגדרות לזיהוי tagRFP: עירור 558 ננומטר, פליטה 583 ננומטר). בעלי חיים נמוכה (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta של הנורה בלוע האחורי), ביניים (יותר מ-10 puncta של הנורה בלוע האחורי), או רמות צבירה גבוהה (יותר מ-10 puncta של הנורה לועי הקדמי) מוצגים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) כימות של צבירת tagRFP::PAB שונים-1 רמות עם גיל wildtype, הדף היומי-2 רקע מוטציה מגלה tagRFP::PAB חריפה מושהית-1 צבירה עם הגיל בבעלי חיים ארוכים. יום 2 יום 5, יום 7 daf-2(-) לעומת wildtype רקע, נמוך בהשוואה לצבירת בחט רמות: בדיקה מדוקדקת של פישר, * * *p < 0.0001. לוח פרסום מחדש הפניה7. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פתרון מניות</td>
			<td>כמות</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
			<td>הערות/תיאור</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">תרבית נוזלית, הנפח הכולל 300 מ ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>S הבזליים (עבור 500 מ"ל: 5.9 גרם NaCl, 50 מ ל 1 מ' אשלגן פוספט pH 6)</td>
			<td>200 מ</td>
			<td></td>
			<td>1 מ' אשלגן פוספט pH 6: עבור 1 l: 129 גרם ח'2PO4 monobasic, 52 g K2HPO4 dibasic נטול מים</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 מ' אשלגן ציטרט pH 6 (400 מ ל: 13.1 g monohydrate חומצה ציטרית, 134.4 g tri-אשלגן ציטרט מונוהידראט)</td>
			<td>3 מ</td>
			<td>10 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>לאתר פתרון מתכות (עבור 1 l: 1.86 גרם חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA), g 0.69 מכל4 · 7 שעות2O, 0.2 גרם MnCl2 · 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 · 7 שעות2O, 0.025 g CuSO4 · 5 שעות2O)</td>
			<td>3 מ</td>
			<td></td>
			<td>פתרון מלאי החנות בחושך ב 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 מ' MgSO4 (עבור 500 מ"ל: 123.3 g)</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>3 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl 1 מ'2 (עבור 500 מ"ל: 73.5 g)</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>3 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Carbendazim µg/mL 200 (50 מ ל: 10 מ ג של מתנול)</td>
			<td>150 ΜL</td>
			<td>100 ננוגרם למ"ל</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל (עבור 100 מ ל: 0.5 גרם אתנול)</td>
			<td>300 ΜL</td>
			<td>µg 5/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">מאגר מלח גבוהה החילוץ ההרכבה (רב), 30 מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 מ' 4-Morpholineethanesulfonic חומצה (MES)</td>
			<td>3 מ</td>
			<td>100 מ מ</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ראב</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 מ' Ethyleneglycoltetraacetic חומצה (EGTA)</td>
			<td>60 ΜL</td>
			<td>1 מ מ</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ראב</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 מ' Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)</td>
			<td>6 ΜL</td>
			<td>0.1 מ מ</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ראב</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 מ' MgSO4
</td>
			<td>15 ΜL</td>
			<td>0.5 מ מ</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ראב</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl 5 מ'</td>
			<td>4.5 מ</td>
			<td>750 מ"מ</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ראב</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 מ' סודיום פלואוריד (NaF)</td>
			<td>600 ΜL</td>
			<td>20 מ מ</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ראב</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>להשלים עד סה עם ddH2O 30 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 x קוקטייל מעכב פרוטאז</td>
			<td>*</td>
			<td>2 x</td>
			<td rowspan="4">* להוסיף ריאגנטים לאחר לוקח כמות מאגר מניות ראב זה נדרש (על החילוץ עבור ספקטרומטר מסה 6 מ ל).</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 מ מ Phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) באלכוהול איזופרופיל,-20 ° C</td>
			<td>*</td>
			<td>1 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 U/µL DNaseI</td>
			<td>*</td>
			<td>200 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 מ"ג/מ"ל RNaseA</td>
			<td>*</td>
			<td>µg 100/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">ראב עם 1 מ' סוכרוז, 30 מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M סוכרוז (עבור 50 מ ל: 34.2 g)</td>
			<td>15 מ</td>
			<td>1 מ'</td>
			<td>הוסף את ריאגנטים מאגר ראב מלבד DNaseI, RNaseA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Radioimmunoprecipitation assay (ריפה) מאגר, 30 מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 מ' טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) pH 8</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>50 מ מ</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ריפה</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl 5 מ'</td>
			<td>0.9 mL</td>
			<td>150 מ מ</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ריפה</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 EDTA מ'</td>
			<td>0.3 mL</td>
			<td>5 מ מ</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ריפה</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות)</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ריפה</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% נתרן deoxycholate (SDO)</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ריפה</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40)</td>
			<td>0.3 mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>רכיב המניות מאגר ריפה</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>להשלים עד סה עם ddH2O 30 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 מ מ PMSF</td>
			<td>*</td>
			<td>1 מ מ</td>
			<td rowspan="2">* להוסיף ריאגנטים לאחר לוקח כמות מאגר מניות ריפה זה נדרש (על החילוץ עבור ספקטרומטר מסה 10 מ ל).</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 x קוקטייל מעכב פרוטאז</td>
			<td>*</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">מאגר שתנן/מרחביות, 10 מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>שתנן</td>
			<td>4.8 גרם</td>
			<td>8 מ'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10% מרחביות</td>
			<td>2 מ</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>77 מ ג</td>
			<td>50 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 מ' טריס pH 8</td>
			<td>0.5 mL</td>
			<td>50 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>להשלים 10 מ ל הכולל עם ddH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">מאגר דיאליזה, 1 ליטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריס</td>
			<td>6 g</td>
			<td>50 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DTT</td>
			<td>154 מ ג</td>
			<td>1 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>100 מ מ PMSF</td>
			<td>1 מ"ל</td>
			<td>0.1 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>להתאים את ה-pH 7.5 ושלמה על סך 1 ליטר עם ddH2O</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מאגרי תרבית נוזלית, מיצוי חלבונים לא מסיסים של דיאליזה.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

מטרת השיטה המובאת כאן היא לבחון חלבון צבירת במהלך הזדקנות נורמלית בתוך האורגניזם דגם C. elegans. הפרוטוקול מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד מצרפי גדול מאוד מסיסים היוצרים עם הגיל וכדי לקבוע כיצד משפיעים השינויים פרוטוסטאזיס חלבון צבירת.

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

8.4K Views.  German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE). מטרת השיטה המובאת כאן היא לבחון חלבון צבירת במהלך הזדקנות נורמלית בתוך האורגניזם דגם C. elegans. הפרוטוקול מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד מצרפי גדול מאוד מסיסים היוצרים עם הגיל וכדי לקבוע כיצד משפיעים השינויים פרוטוסטאזיס חלבון צבירת.

Video: Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...