Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del DZNE e un Marie Curie International Reintegration Grant (322120 a D.C.D.)

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui segnaliamo una metodologia per isolare gli aggregati altamente insolubili della proteina da invecchiamento di c. elegans sottoposti a RNAi per l'analisi mediante spettrometria di massa e Western blotting. Mostriamo che miglioramento proteostasis riducendo notevolmente IIS impedisce l'aggregazione proteica età-dipendente. Selezionando specifiche proteine di aggregazione-inclini a iperesprimono in c. elegans, è possibile sezionare ulteriormente i meccanismi che modulano l'aggregazione proteica inerente.
Aggregazione di inerente età-dipendente della proteina contro malattia-associated Protein Aggregation Questo lavoro attuale si basa sui risultati precedenti che l'aggregazione proteica non è limitato alle proteine specifiche aggregando in un contesto di malattia. Focalizzando l'attenzione su proteine endogene di aggregazione-incline, piuttosto che proteine associate malattia ectopically espressi, l'aspettativa è di fornire la comprensione romanzo nella regolazione fisiologica del processo di aggregazione. Come aggregati età-dipendente della proteina si trovano in luoghi diversi cellulari5, il loro studio dovrebbe anche fornire insight nel vano specifici meccanismi di controllo di qualità. Nel complesso, i meccanismi che controllano l'aggregazione proteica inerente anche potrebbero essere rilevanti nell'impedire l'aggregazione della proteina di malattia. Di nota, anche se assomiglia a aggregazione età-dipendente della proteina in aggregazione proteica di diversi aspetti malattia, resta ancora poco chiaro se questi aggregati contengono fibrille amiloidi, una caratteristica di molti aggregati di malattia.
Scelta di C. Elegans modello: vantaggi e limiti Rispetto a un modello di mammiferi, uno dei più grandi vantaggi dell'utilizzo di c. elegans per studiare una caratteristica di relazione con l'invecchiamento è la durata della vita molto breve. Parecchie centinaia di proteine diventano costantemente altamente-aggregazione-incline durante l'invecchiamento e questo grande aumento di insolubilità è facilmente rilevabile anche con un'estrazione di biochimica semplificata. Tuttavia, una limitazione importante dell'utilizzo di c. elegans per lo studio di aggregazione proteica età-dipendente è la necessità di isolare un numero elevato di animali invecchiati. Come c. elegans sono ermafroditi e producono circa 220 o più progenie durante loro riproduttiva fase19, è essenziale per prevenire la riproduzione o eliminare progenie al fine di una popolazione di età. Sono disponibili diverse opzioni per indurre sterilità: è possibile utilizzare la chimica fluorodeossiuridina (FUdR), un inibitore della sintesi del DNA. Tuttavia, FUdR porta a numerosi effetti collaterali, inclusi i cambiamenti proteostasis e ridotto l'aggregazione di proteine20,21,22. D'importanza, FUdR induce risposte specifiche per genotipo23. Un'altra opzione consiste nell'utilizzare mutanti sterili sensibili alla temperatura. Ad esempio, spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141) e gon-2(q388) sono stati utilizzati in precedenza per le analisi di spettrometria di massa delle età-dipendente aggregando proteoma5, 8.
Eppure ci sono diverse limitazioni associate all'utilizzo di questi mutanti. In primo luogo, come la sterilità è temperatura-dipendente, è necessario far crescere gli animali a 25 ° C, che costituisce uno sforzo delicato ed accelera l'invecchiamento, nonché l'aggregazione proteica. Al contrario, abbiamo osservato che i mutanti di gon-2, glp-1 e fem-1 sono più longevo rispetto al selvaggio-tipo quando mantenuta a 25 ° C (dati non mostrati). In secondo luogo, non ci sono limitazioni specifiche associate con ogni tipo di difetto riproduttiva. Uno svantaggio dell'utilizzo degli spermatozoi difettosi mutanti è la produzione di ovociti non fecondati (anche prodotta in invecchiato selvaggio-tipo ermafroditi). La qualità di questi ovociti diminuisce notevolmente con l'età e si accumulano nella gonade24,25. Analisi quantitativa spettrometria di massa dimostra che mutanti difettivi sperma hanno diversi livelli elevati di piega di proteine insolubili accumulando con l'età rispetto ai mutanti gonade-less o germinale-carenti. Questo indica misfolding proteico e aggregazione situato nella gonade5, in accordo con precedenti studi12,13 e in vivo esperimenti rivelanti aggregati proteici situati nell'ovocita anormale cluster5. Di conseguenza, l'aggregazione proteica eccessiva nella gonade sarebbe maschera più sottili cambiamenti nell'aggregazione di proteine nei tessuti somatici. Questo dovrebbe anche essere considerato quando si confrontano gli interventi che agiscono in misura diversa il tessuto riproduttivo e somatiche proteostasis. Pertanto, per valutare solo l'aggregazione proteica somatico, favoriamo usando mutanti gonade-meno gon-2 . Un'alternativa sarebbe quella di utilizzare mutanti di germline-carenti glp-1 . Tuttavia, notiamo che questi animali hanno meno inerente aggregazione proteica con l'età rispetto a gon-2 mutanti5. Probabilmente si tratta di una conseguenza del miglioramento proteostasis in tessuti somatici a causa di segnalazione dalla gonade di germline difettivi26,27,28. Un'altra alternativa è di utilizzare animali wild type e rimuovere progenie ogni giorno di sedimentazione. Tuttavia, questo è problematico a causa della difficoltà di rimuovere completamente tutta la progenie.
Un'altra limitazione generale dell'utilizzo di c. elegans è le dimensioni ridotte che rende impegnativo estrazioni tissutali specifici. Come tali estrazioni animale intero non forniscono informazioni rilevanti relazionate a come le diverse condizioni modulano l'aggregazione di proteine in tessuti specifici. Di nota, questo problema potrebbe potenzialmente essere aggirato utilizzando un metodo sviluppato di recente basato su ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule per isolare cellule specifiche da elegans del c.29. Ancora rimane essere determinato se questo metodo sarebbe stato adatto per ottenere sufficiente materiale per estrazione di proteine insolubili e se sia applicabile per gli animali di età compresa tra. In alternativa, l'aggregazione di proteine specifiche del tessuto e la sua regolamentazione possono essere studiate dagli esperimenti ulteriori in vivo . Come animali transgenici che esprimono una proteina di aggregazione-inclini con etichetta fluorescente di scelta può essere rapidamente generato e come gli animali sono trasparenti, è relativamente facile da esaminare l'aggregazione della proteina in situ.
Nel complesso, è essenziale seguire i risultati di proteomica con esperimenti in vivo in uno sfondo di tipo selvatico. La combinazione di una caratterizzazione biochimica e microscopia-based consente uno studio completo di aggregazione proteica e una valutazione del ruolo dei geni di interesse. Quest'ultimo è facilitato in c. elegans di RNAi mediata attraverso l'alimentazione e la disponibilità di librerie di RNAi intero genoma. Inoltre, un gran numero di mutanti caratterizzati esiste per confermare i risultati ottenuti da RNAi o per utilizzare invece di RNAi.
Coltura liquida e biochimici estrazione: vantaggi e limitazioni Come proteine molto aggregati costituiscono solo una piccola frazione delle proteine totali, è necessario avviare l'estrazione con un gran numero di animali. Con grandi quantità di proteine insolubili, quindi è possibile eseguire il frazionamento di peptide esteso per ridurre la complessità di campione per la spettrometria di massa e così migliorare l'identificazione di proteine abbondanti inferiore. Se solo piccole quantità di proteine insolubili sono necessari, un'alternativa è di crescere vermi sulle piastre e omogeneizzarle con perle in ceramica. Uno degli svantaggi di coltura liquida è che nel caso di una contaminazione, tutta la cultura è interessata e deve essere eliminata. In generale, c. elegans invecchiamento è fortemente influenzata dalla temperatura e questo parametro deve essere strettamente controllato in coltura liquida per evitare variazioni di aggregazione proteica età-dipendente. Controllo della temperatura è anche essenziale per ottenere una popolazione omogenea di gonade-meno animali quando usando i mutanti di gon-2(-) .
A seconda l'obiettivo dello studio, è importante prendere in considerazione metodi di estrazione differenti. L'estrazione biochimico qui presentata inizialmente è stato adattato da protocolli per isolare la malattia-collegati aggregati11,30,31. Abbiamo scelto le concentrazioni relativamente elevate di prodotti detergenti 0,5% SDS per isolare gli aggregati più insolubili. Anche di cubettatura aggregati insolubili 0,5% SDS con basse velocità di centrifuga, questo protocollo sarebbe solo isolare gli aggregati più grandi. In alternativa, un protocollo meno severa è stato recentemente pubblicato10. In questo studio, più solubili e più piccoli aggregati sono stati estratti anche omettendo SDS e utilizzando molto alte velocità centrifuga a 500.000 x g. Un confronto tra i diversi protocolli Mostra un aumento generale del numero di proteine nel proteoma aggregando utilizzando il protocollo meno rigorosi7. Notiamo che animali longevi con ridotto daf-2 segnalazione efficacemente ha impedito l'accumulazione di sia SDS-solubili e insolubili in SDS aggregati nella gonade-meno animali7.
In Vivo Analisi di aggregazione proteica età-dipendente Durante la costruzione di modelli transgenici per seguenti aggregazione di età-dipendente della proteina, è rilevante considerare in cui il tessuto ai overexpress l'aggregazione-incline proteina di interesse e a quali livelli di espressione. Favoriamo l'espressione in tessuti situato nella regione della testa per evitare interferenze con autofluorescenza, che è prominente nell'intestino invecchiamento. Per visualizzare con etichetta fluorescente aggregati con basso ingrandimento, deve essere espressa la proteina aggregazione-incline ad un livello relativamente elevato. D'altra parte, espressione troppo alto causerà la proteina aggregazione-inclini a formare aggregati già in animali giovani.
Presi insieme, questi metodi ci aiuterà a capire perché parte del proteoma aggrega con l'età e infine condurre allo sviluppo di strategie di promozione di un invecchiamento sano.

Misfolding e aggregazione sono riconosciuti come un marchio di garanzia di parecchie malattie neurodegenerative quali AD, PD, sclerosi laterale amiotrofica (ALS), la demenza frontotemporale (FTD) e molti altri. Per esempio, α-synuclein assembly in fibrille amiloidi che si accumulano come i corpi di Lewy specialmente nel nigra di substantia dei pazienti del Palladio, mentre in misfold di TDP-43 o FUS di pazienti ALS a formare aggregati citoplasmatici a degenerazione dei neuroni di motore. In ciascuno di questi disordini neurodegenerative, meccanismi di mantenimento omeostasi della proteina o proteostasis non riescono ad impedire l'accumulo di proteine misfolded, conseguenza che conducono alla malattia.
Proteostasis è fondamentale per garantire le funzioni cellulari e in condizioni normali questi meccanismi regolatori sotto stretto controllano il tasso di sintesi proteica, pieghevole e degradazione. Parecchi studi dimostrano che con l'invecchiamento, la capacità di molte cellule e organi per mantenere l'omeostasi della proteina è gradualmente compromessa e il deterioramento fisiologico delle reti proteostasis con l'età è un importante fattore aggravante per malattie neurodegenerative (rivisto in riferimenti1,2,3). Il fatto che il controllo di qualità di proteina e la risposta cellulare allo stress spiegata della proteina sono compromessi con l'età suggerisce che misfolding e aggregazione potrebbe essere una conseguenza di invecchiamento generale. Infatti, noi ed altri abbiamo dimostrato che l'aggregazione proteica non è limitato alla malattia e invece parte del proteoma diventa altamente detersivo-insolubili in animali invecchiati4,5,6,7 ,8,9,10. Analisi computazionale e in vivo ha rivelato che questi aggregati relativi all'età fisiologici simili aggregati di malattia in diversi aspetti5. La scoperta di aggregazione della proteina endogena, età-dipendente ci dà la possibilità di sezionare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano l'aggregazione proteica, senza l'utilizzo di ectopically espressi proteine umane di malattia-collegati. Allo stato attuale, solo informazioni limitate esistono circa il regolamento di insolubilità di proteina diffusa e circa gli effetti di questa disregolazione sulla salute dell'organismo.
Il nematode c. elegans è uno dei microrganismi più estesamente studiati nella ricerca di invecchiamento come questi animali hanno una durata relativamente breve e mostrano molte caratteristiche di invecchiamento caratteristica osservate negli più alti organismi. Gli effetti dell'invecchiamento sull'insolubilità di proteina sono stati studiati in c. elegans di frazionamento biochimico sequenziale basato sulla solubilità differenziale, che è ampiamente usato per estrarre aggregati di malattia nel campo della ricerca di neurodegenerazione11 . Mediante spettrometria di massa quantitativa, parecchie centinaia di proteine sono stati indicati per diventare incline aggregazione in c. elegans in assenza di malattia5. Qui descriviamo in dettaglio il protocollo per crescere un numero elevato di vermi in coltura liquida e l'estrazione sequenza per isolare aggregati proteici per quantificazione mediante spettrometria di massa e analisi mediante Western blot. Perché le proteine misfolded e aggregazione-incline si accumulano in età di c. elegans gonadi e maschere cambiamenti in altri tessuti somatici5,12,13, usiamo un mutante di gonade-meno mettere a fuoco l'analisi della proteina insolubilità in tessuti non riproduttiva. Il metodo presentato consente l'analisi di aggregati altamente insolubile, grandi, che sono insolubili in 0,5% SDS e pellettato di relativamente bassa velocità centrifuga. In alternativa, un protocollo di estrazione meno rigoroso a raccogliere anche aggregati più piccoli e più solubili è stato pubblicato altrove10. In più, descriviamo il metodo utilizzato per valutare l'aggregazione in vivo in c. elegans.
Nel complesso, questi metodi in combinazione con interferenza del RNA (RNAi) possono valutare il ruolo di un gene di interesse nel modulare l'aggregazione proteica età-dipendente. Per questo abbiamo descrivere l'analisi di estratti da vermi giovani e invecchiati con e senza atterramento di una specifica proteina di interesse mediante RNAi. Questi metodi dovrebbero essere un potente strumento per determinare quali componenti della rete proteostasis regolano insolubilità di proteina. Diversi interventi ridotti come fattore di crescita dell'insulina/insulino-simile (IGF) 1 segnalazione (IIS) hanno dimostrato di ritardare notevolmente c. elegans invecchiamento14. Vie di longevità spesso inducono meccanismi di controllo di qualità di proteina e così queste vie potrebbero essere attivamente influenzare il tasso di aggregazione della proteina. Ad esempio, dimostriamo l'aggregazione di proteine intrinseche ridotta in animali longevi all'inibizione del pathway IIS7.

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	<colgroup>
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			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Corning</td>
			<td class="xl19" style="width:258pt" width="344">4425-2XL</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Membrane Screw Cap&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Schott</td>
			<td class="xl19">1088655</td>
			<td class="xl17">GL45</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Nutating Mixer</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">VWR</td>
			<td class="xl19">444-0148</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Separatory funnel</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Nalgene</td>
			<td class="xl19">4300-1000</td>
			<td class="xl17">Capacity 1,000 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">1 ml syringe&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">BD Plastipak</td>
			<td class="xl19">300013</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Gray needle, 27 G x &#189; &#34;, 0.4 mm x 13 mm</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">BD Microlance 3</td>
			<td class="xl19">300635</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Membrane filters 0.025 &#181;M</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Millipore</td>
			<td class="xl19">VSWP04700</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">pH strip</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Machery-Nagel</td>
			<td class="xl19">92110</td>
			<td class="xl17">pH-Fix 0-14</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Roche</td>
			<td class="xl19">4693132001</td>
			<td class="xl16" style="width:125pt" width="166">Complete Mini EDTA-free tablets&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Octoxynol-9&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Applichem</td>
			<td class="xl19">A1388</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">M1317</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Nonylphenylpolyethylenglycol</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Applichem</td>
			<td class="xl19">A1694</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Nonidet P40 (NP40)</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">DNaseI</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Roche</td>
			<td class="xl19">04716728001</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">recombinant, RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">RNaseA</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Promega</td>
			<td class="xl19">A7973</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">solution</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Total protein blot staining</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermofisher</td>
			<td class="xl19">S11791</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Sypro Ruby protein blot stain</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Total protein gel staining</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermofisher</td>
			<td class="xl19">S12001</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Sypro Ruby protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Serva</td>
			<td class="xl19">36970</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Iodoacetamide</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Serva</td>
			<td class="xl19">26710</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Ammoniumbicarbonate</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">09830</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Promega</td>
			<td class="xl25" style="width:258pt" width="344">V5111</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Isobaric tags for relative and absolute quantitation</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sciex</td>
			<td class="xl19">4352135</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">iTRAQ Reagents Multiplex Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge Avanti J-26XP</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Beckmann Coulter</td>
			<td class="xl19">393126</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Ultracentrifuge Optima Max-XP</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Beckmann Coulter</td>
			<td class="xl19">393315</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge 5424R</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5404000413</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge 5702</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5702000329</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge Megafuge 40R</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75004518</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Concentrator Plus</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5305000304</td>
			<td class="xl17">Centrifugal evaporator</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Fluorescent stereo-microscope M165 FC&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Leica</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">With Planapo 2.0x objective</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Dissection microscope</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Leica&#160;</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17">Leica S6E</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="80" rowspan="2" style="width:161pt;height:60.0pt" width="215">High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td class="xl18" height="80" rowspan="2" style="width:92pt;height:60.0pt" width="122">Zeiss</td>
			<td class="xl19" height="80" rowspan="2" style="width:258pt;height:60.0pt" width="344"></td>
			<td class="xl16" height="80" rowspan="2" style="width:125pt;height:60.0pt" width="166">With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">Software</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl32"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Image analysis software</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">ImageJ</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Analysis of mass spectrometry data</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Protein Prospector</td>
			<td class="xl136" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl137">http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">E.coli strain</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">OP50</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">CGC</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">RNAi bacteria</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">L4440</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Julie Ahringer RNAi library</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">C. elegans mutants</td>
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122"></td>
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl17" height="42" style="height:31.5pt">CF2253</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">CGC, strain name: EJ1158&#160;</td>
			<td class="xl40" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl17">Genotype: gon-2(q388)</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">C. elegans transgenics</td>
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122"></td>
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">DCD214</td>
			<td class="xl25" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122">Della David&#39;s lab at DZNE T&#252;bingen</td>
			<td class="xl40" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl68" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166">Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">DCD215</td>
			<td class="xl87" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122">Della David&#39;s lab at DZNE T&#252;bingen</td>
			<td class="xl40" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl68" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166">Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study changes in inherent protein aggregation with age in caenorhabditis elegans

Negli ultimi decenni, la prevalenza dei disordini neurodegenerative, quali il morbo di Alzheimer (annuncio) e malattia di Parkinson (MDP), è cresciuta. Queste malattie età-associate sono caratterizzate dalla comparsa di aggregati di proteine con struttura fibrillare nei cervelli di questi pazienti. Esattamente perché normalmente solubili proteine subiscono un processo di aggregazione rimane capito male. La scoperta che l'aggregazione proteica non è limitato ai processi di malattia e invece parte del normale processo di invecchiamento consente lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano l'aggregazione proteica, senza l'utilizzo di ectopically espresso umano proteine associate a malattia. Qui descriviamo metodologie per esaminare l'aggregazione proteica inerente in Caenorhabditis elegans attraverso approcci complementari. In primo luogo, esaminiamo come far crescere un numero elevato di età-sincronizzato elegans del c. di ottenere animali invecchiati e presentiamo le procedure biochimiche per isolare altamente insolubile grandi aggregati. In combinazione con un atterramento di genetico mirato, è possibile sezionare il ruolo di un gene di interesse nel promuovere o prevenire l'aggregazione proteica età-dipendente utilizzando sia un'analisi completa con spettrometria di massa quantitativa o un analisi basata su candidati con gli anticorpi. Quindi, questi risultati sono confermati dall'analisi in vivo con animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti-etichettate aggregazione-incline. Questi metodi dovrebbero aiutare a chiarire perché alcune proteine sono inclini ad aggregarsi con l'età e, in definitiva, come mantenere queste proteine completamente funzionale.

Abbiamo usato i metodi presentati qui per valutare animali come longevi con IIS ridotta modulano l'aggregazione proteica età-dipendente. Mediante Western blot (Vedi punto 2.2, rapida estrazione di proteine insolubili per l'analisi Western blot), abbiamo analizzato il totale e il contenuto di proteina insolubile di young (3 giorno dell'età adulta) e dai vermi (giorno 18 di età adulta) sul controllo RNAi e su RNAi targeting l'insulina / Recettore IGF-1-like daf-2. Abbiamo non osservato nessun grande cambiamento nei livelli di proteina totale con l'età o tra controllo e daf-2 condizioni di RNAi (Figura 2A). Come previsto, abbiamo rilevato un forte incremento età-correlato nei livelli di proteine altamente insolubile negli animali di controllo (Figura 2B). In confronto agli animali longevi su daf-2 RNAi, propensione di aggregazione è stato notevolmente ridotto. Macchiatura della proteina intera degli estratti insolubili, ha rivelato un modello di banda proteina meno complesso in estratti da 18-giorno-vecchio worm su daf-2 RNAi rispetto ai comandi di pari età. Analisi quantitativa spettrometria di massa ha dimostrato che animali longevi con IIS ridotta hanno nel complesso meno aggregazione di età-collegato della proteina e d'importanza, daf-2 inibizione completamente ha abrogato l'insolubilità di età-dipendente di un sottogruppo specifico di proteine7. Al follow-up su questi risultati, ci siamo concentrati su una di queste proteine di aggregazione-inclini, PAB-1. PAB-1 è una proteina di RNA-binding con un dominio "del prion-like" previsto. Macchiatura dell'anticorpo ha confermato che animali longevi mantenuto PAB-1 solubile con l'età (Figura 2C).
Per l'analisi in vivo dell'aggregazione PAB-1, abbiamo prodotto animali transgenici che esprimono tagRFP::PAB-1 nei muscoli pharyngeal. Negli animali giovani, tagRFP::PAB-1 trovava principalmente diffuso in tutta la faringe (Figura 3A, livello di aggregazione "basso") ma con l'età, abbiamo osservato un progressivo accumulo in puncta luminoso a partire nel bulbo pharyngeal posteriore ( Figura 3A, livello di aggregazione "intermedi"). Durante l'invecchiamento, abbiamo osservato anche aggregazione nel bulbo della faringe anteriore (Figura 3A, livello di aggregazione "alta") in un numero crescente di animali. Dal raggruppamento di animali in queste categorie differenti, abbiamo segnato il tasso di aggregazione PAB-1 in una popolazione. Al 2 ° giorno dell'età adulta la maggior parte dei vermi (88%) aveva nessuno o pochissimi puncta e nessun animale con livelli di aggregazione alta sono stato rilevato. Già al giorno 5, 19% della popolazione ha mostrato intermedio e livelli di aggregazione alta 16%, mentre al giorno 7 oltre il 70% dei vermi presentato livelli di aggregazione intermedio ed alto. Per analizzare l'effetto della longevità all'aggregazione di età-dipendente di tagRFP:PAB-1, abbiamo generato transgenici tagRFP::PAB-1 worm con una mutazione di daf-2 . Questi animali hanno mostrato significativamente ridotta tagRFP:PAB-1 puncta formazione con l'invecchiamento, con meno del 15% della popolazione che esibiscono i livelli di aggregazione intermedio ed alto anche a giorno 7 (Figura 3B).
Utilizzando i diversi approcci descritti qui, abbiamo rivelato che IIS ridotta impedisce l'aggregazione di età-dipendente della proteina in misura diversa e animali longevi sono particolarmente efficienti nel ripristinare le dinamiche di PAB-17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig1.jpg"> Figura 1 : Schematica del flusso di lavoro per studiare i cambiamenti in aggregazione proteica inerente con l'età in Elegans del c.  Passaggi principali sono in grassetto. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig2.jpg"> Figura 2 : Insolubilità di proteina aumenta con l'età negli animali di controllo, ma non negli animali con segnalazione ridotta daf-2 . (A) proteine totali macchiatura della frazione totale dal giorno 3 e giorno 18 gon-2(-) mutanti sottoposti a controllo e daf-2 RNAi (cresciuto a 25 ° C). (B) proteine totali macchiatura della frazione insolubile in SDS dal giorno 3 e giorno 18 gon-2(-) mutanti sottoposti a controllo e daf-2 RNAi (cresciuto a 25 ° C). Pannello ripubblicato da riferimento7. (C) Immunoblot rilevazione PAB-1 nella frazione insolubile in SDS, bande proteiche pertinente indicato dalla freccia rossa. Pannello ripubblicato da riferimento7. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig3.jpg"> Figura 3: Ridotto daf-2 segnalazione impedisce l'accumulo dei puncta tagRFP::PAB-1 con l'età. (A) immagini rappresentative di vermi con sovraespressione di tagRFP::PAB-1 nei muscoli pharyngeal (microscopio ad alto ingrandimento, le impostazioni di rilevamento tagRFP: eccitazione 558 nm, emissione 583 nm). Animali con bassa (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta nel bulbo pharyngeal posteriore), intermedio (più di 10 puncta nel bulbo pharyngeal posteriore), o livelli di aggregazione alta (più di 10 puncta nel bulbo della faringe anteriore) sono mostrati. Barra della scala = 20 µm. (B) quantificazione dell'aggregazione di diverse tagRFP::PAB-1 livelli con l'età in wildtype e sfondo mutante daf-2 rivela aggregazione fortemente ritardato tagRFP::PAB-1 con l'età negli animali longevi. Giorno 5, giorno 2 e giorno 7 daf-2(-) versus wildtype sfondo, basso rispetto ai livelli di aggregazione intermedio ed alto: test esatto di Fisher, * * *p < 0,0001. Pannello ripubblicato da riferimento7. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluzione di riserva</td>
			<td>Importo</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Commenti/Descrizione</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Coltura liquida, volume totale 300 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>S basale (per 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M potassio fosfato pH 6)</td>
			<td>200 mL</td>
			<td></td>
			<td>1 M potassio fosfato pH 6: per 1 l: 129 g KH2PO4 monobasico, 52g K2HPO4 bibasico anidro</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M potassio citrato pH 6 (per 400 mL: 13,1 g acido citrico monoidrato, 134,4 g tri-potassio citrato monoidrato)</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di metalli traccia (per 1 l: 1.86 g acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, g 0,025 CuSO4 · 5 H2O)</td>
			<td>3 mL</td>
			<td></td>
			<td>Conservare la soluzione di riserva al buio a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4 (per 500 mL: 123,3 g)</td>
			<td>900 Μ l</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M CaCl2 (per 500 mL: 73,5 g)</td>
			<td>900 Μ l</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>200 µ g/mL Carbendazim (per 50 mL: 10 mg in metanolo)</td>
			<td>150 Μ l</td>
			<td>100 ng/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Colesterolo di 5 mg/mL (per 100 mL: 0.5 g in etanolo)</td>
			<td>300 Μ l</td>
			<td>5 µ g/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Tampone di estrazione del alto-sale del rimontaggio (RAB), 30 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acido 4-Morpholineethanesulfonic di 1 M (MES)</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>Componente di buffer stock di RAB</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 acido di Ethyleneglycoltetraacetic di M (EGTA)</td>
			<td>60 Μ l</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Componente di buffer stock di RAB</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td>
			<td>6 Μ l</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td>Componente di buffer stock di RAB</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>15 Μ l</td>
			<td>0,5 mM</td>
			<td>Componente di buffer stock di RAB</td>
		</tr>
<tr>
<td>5m NaCl</td>
			<td>4,5 mL</td>
			<td>750 mM</td>
			<td>Componente di buffer stock di RAB</td>
		</tr>
<tr>
<td>1m di fluoruro di sodio (NaF)</td>
			<td>600 Μ l</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>Componente di buffer stock di RAB</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Completare a 30 mL totale con ddH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 x Cocktail di inibitore della proteasi</td>
			<td>*</td>
			<td>2 x</td>
			<td rowspan="4">* Aggiungere reagenti dopo prendendo la quantità di buffer stock RAB che è necessario (per l'estrazione per spettrometria totale 6 mL).</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mM Phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) in isopropanolo,-20 ° C</td>
			<td>*</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 U / µ l DNaseI</td>
			<td>*</td>
			<td>200 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mg/mL RNaseA</td>
			<td>*</td>
			<td>100 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">RAB con saccarosio di 1 M, 30 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M saccarosio (per 50 mL: 34,2 g)</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>2.</td>
			<td>Aggiungere i reagenti di buffer RAB oltre DNaseI e RNaseA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Radioimmunoprecipitation tampone del saggio (RIPA), 30 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1m Tris (idrossimetil) amminometano (Tris) pH 8</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>Componente di buffer stock di RIPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>5m NaCl</td>
			<td>0,9 mL</td>
			<td>150 mM</td>
			<td>Componente di buffer stock di RIPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 EDTA M</td>
			<td>0,3 mL</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>Componente di buffer stock di RIPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% sodio dodecil solfato (SDS)</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>0,50%</td>
			<td>Componente di buffer stock di RIPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% sodio desossicolato (SDO)</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>0,50%</td>
			<td>Componente di buffer stock di RIPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40)</td>
			<td>0,3 mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>Componente di buffer stock di RIPA</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Completare a 30 mL totale con ddH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mM PMSF</td>
			<td>*</td>
			<td>1 mM</td>
			<td rowspan="2">* Aggiungere reagenti dopo prendendo la quantità di RIPA buffer stock che è necessario (per l'estrazione per spettrometria di massa 10 mL).</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 x Cocktail di inibitore della proteasi</td>
			<td>*</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Tampone di urea/SDS, 10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Urea</td>
			<td>4,8 g</td>
			<td>8 M</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ditiotreitolo (DTT)</td>
			<td>77 mg</td>
			<td>50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl pH 8</td>
			<td>0,5 mL</td>
			<td>50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Portare a 10 mL totale con ddH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Buffer di dialisi, 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>7 F</td>
			<td>50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DTT</td>
			<td>154 mg</td>
			<td>1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mM PMSF</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Regolare il pH 7,5 e completa a 1 L totale con ddH2O</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Buffer per coltura liquida, estrazione della proteina insolubile e dialisi.

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Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di esplorare l'aggregazione di proteine durante l'invecchiamento normale nell'organismo modello di c. elegans. Il protocollo rappresenta un potente strumento per studiare i grandi aggregati altamente insolubili che formano con l'età e per determinare l'impatto di cambiamenti nel proteostasis aggregazione proteica.

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

8.4K Views.  German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE). L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di esplorare l'aggregazione di proteine durante l'invecchiamento normale nell'organismo modello di c. elegans. Il protocollo rappresenta un potente strumento per studiare i grandi aggregati altamente insolubili che formano con l'età e per determinare l'impatto di cambiamenti nel proteostasis aggregazione proteica.

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Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solida piastra a base di restrizioni alimentari, Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Ricerca

Biologia

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandina estrazione e l&#39;analisi in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

In Vitro aggregazione Assays Utilizzando iperfosforilata Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

La coltivazione di<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In tre dimensioni in laboratorio

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Combinato di nucleotidi e proteina estrazioni in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Quantificazione del declino proteostatico tessuto-specifico nella Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...