이 작품은 DZNE와 마리 퀴리 국제 재통합 그랜트 (D.C.D.에 322120)에서 기금에 의해 지원 되었다

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저자는 공개 없다.

여기 우리는 매우 불용 성 단백질 질량 분석 및 서쪽 blotting에 의해 분석을 위한 RNAi를 받게 되는 선 충 C. 노화에서 집계를 분리 하는 방법을 보고 합니다. 우리는 그 연령에 따라 단백질 집계 방지 proteostasis IIS를 크게 줄임으로써 향상을 보여줍니다. 특정 집계 경향이 단백질 C. 선 충에서 overexpress을 선택 하 여 추가 고유의 단백질 집계를 변조 하는 메커니즘을 해 부 수는.
질병 관련 단백질 집계 대 고유의 연령에 따라 단백질 집계 이 현재 작업 단백질 집계는 질병의 맥락에서 집계 하는 특정 단백질을 제한 하는 이전 연구 결과 기반으로 합니다. Ectopically 표현된 질병 관련 단백질 보다는 내 생 집계 경향이 단백질에 집중 함으로써, 기대 집계 과정의 생리 규제에 새로운 통찰력을 제공 하는. 연령에 따라 단백질 집계는 서로 다른 세포 위치5에 발견, 그들의 연구 한다 또한 통찰력을 제공할 구획에 특정 품질 제어 메커니즘. 전반적으로, 고유의 단백질 집계를 제어 하는 메커니즘 또한 질병 단백질 집계 방지에 관련 된 수 있습니다. 메모의 연령에 따라 단백질 집계 여러 측면 질병 단백질 집계에서과 유사 하지만 그것은 아직도 남아 있다 불분명 이러한 집계 녹말 체 소, 많은 질병의 특성을 포함 하는 여부.
선택 C. 선 충 모델: 장점 및 제한 사항 C. 선 충 을 사용 하 여 노화 관련 특성을 공부 하는 가장 큰 장점 중 하나는 매우 짧은 수명은 포유류 모델에 비해. 몇 백 단백질 노화 기간 동안 높은 집계-발생 하기 쉬운 되 일관 되 게 고 용해성이 큰 증가 쉽게 단순화 된 생화학 적으로도 감지. 그러나, C. 선 충 을 사용 하 여 연령에 따라 단백질 집계 연구의 주요 한계 세 동물의 많은 수를 분리 하는 필요성 이다. C. 선 충 광고에 나온 것은 약 220을 생산 또는 그들의 생식 기간 동안 더 많은 자손 단계19, 복제 방지 또는 자손 인구 나이 순서 제거 필수적 이다. 몇 가지 옵션 무 균을 유도 하기 위해 사용할 수 있습니다: 하나의 옵션은 화학 fluorodeoxyuridine (FUdR), DNA 합성의 억제제를 사용 하. 그러나, FUdR 수많은 부작용 proteostasis에 변화를 포함 한 단백질 집계20,,2122감소에 지도. 중요 한 것은, FUdR 유전자 형 관련 응답23유도합니다. 또 다른 옵션은 온도 민감한 메 마른 돌연변이 사용 하는 것입니다. 예를 들어 spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141), 및 gon-2(q388) 사용 되었습니다 이전 연령에 따라 집계 프로테옴5, 질량 분석 분석 8.
그러나 이러한 돌연변이 사용과 관련 된 몇 가지 제한이 있다. 첫째,로 불 임 증은 온도 의존, 25 ° C, 구성 하는 가벼운 스트레스와 노화 단백질 집계 가속에 동물 성장 필요가 있다. 반대로, 우리는 관찰 야생-타입 25 ° C (데이터 표시 되지 않음)에서 유지 될 때에 비해 곤-2, glp-1 및 fem-1 돌연변이 최소로. 둘째, 생식의 각 유형과 관련 된 특정 제한이 있습니다. 정자-결함 돌연변이 사용 하 여 하나의 단점은 unfertilized oocytes (또한 세 야생-타입 광고에 나온 것에서 생산)의 생산. 이러한 oocytes의 품질은 크게 나이 거절 하 고 그들은 생식24,25에 축적. 양적 질량 분석 분석이 보여줍니다 정자 결함 돌연변이 생식 덜 또는 생식 불충분 한 돌연변이에 비해 나이 축적 하는 불용 성 단백질의 몇 배 더 높은 수준이 있다. 이 단백질 misfolding 및 생식5, 이전 계약에 집계 연구12,13 나타내고 vivo에서 비정상적인 oocyte에 공개 집계 된 단백질 실험 클러스터5. 따라서, 생식에 과도 한 단백질 집계 체세포 조직에서 단백질 집계에서 더 미묘한 변화를 마스크 합니다. 이것 또한 생식 및 체세포 조직 proteostasis에 다른 범위에는 개입을 비교 했을 때 고려 되어야 한다. 따라서,만 체세포 단백질 집계 평가 하 우리 생식 선-이 곤 2 돌연변이 사용 하 여 선호 합니다. 대신 생식 불충분 한 glp-1 돌연변이 사용 하는 것입니다. 그러나, 우리는이 동물이 덜 고유의 단백질 집계 곤 2 돌연변이5에 비해 나이 참고. 이것은 가능성이 체세포 조직 생식 결함 생식26,,2728에서 신호 때문에 향상 된 proteostasis의 결과 이다. 또 다른 대안은 야생-타입 동물을 사용 하 여 매일 침전에 의해 자손을 제거입니다. 그러나, 이것은 완전히 모든 자손을 제거의 어려움 때문에 문제입니다.
C. 선 충 을 사용 하 여의 또 다른 일반적인 한계 도전 특정 조직 추출 하 게 그것의 작은 크기입니다. 이러한 전체 동물 기사 어떻게 서로 다른 조건에 관련 된 관련 정보를 제공 하지 않습니다로 특정 조직에서 단백질 집계 변조. 메모의 선 충 C.29에서 특정 셀을 형광 활성화 된 세포 분류에 따라 최근 개발 된 메서드를 사용 하 여 잠재적으로이 문제를 피할 수 있는. 그러나이 방법은 불용 성 단백질 추출에 대 한 충분 한 자료를 적합 한 것과 동물 세에 적용 가능한 것이 지 여부 결정 남아 있습니다. 또는 조직의 특정 단백질 집계 및 그것의 규칙 추가 vivo에서 실험 하 여 조사 수 있습니다. 유전자 변형 동물 선택의 붙일 표시 된 집계 하기 쉬운 단백질을 표현 수 있습니다 신속 하 게 생성 되 고 동물 투명 한으로, 그것은 비교적 쉽게 단백질 집단에서 검사 현장에.
전반적으로, vivo에서 실험 야생-타입 배경에서 proteomic 결과 후속 조치를 필수적입니다. 생화학 및 현미경-기반 특성화를 단백질 집단의 포괄적인 연구와 관심의 유전자의 역할의 평가 있습니다. 후자는 C. 선 충 에 의해 촉진 RNAi 먹이 및 전체 게놈 RNAi 라이브러리의 가용성을 통해 중재. 또한, 특징이 돌연변이의 많은 RNAi에 의해 얻은 결과 확인 하거나 RNAi 대신 사용 하 여 존재 한다.
액체 문화 및 생 화 확 추출: 장점 및 제한 사항 단백질 높은 집계 총 단백질의 단지 작은 분수를 만들어, 그것은 동물의 많은 수와 추출을 시작 하는 데 필요한. 불용 성 단백질의 대량, 그것은 광범위 한 펩 티 드 분별 법 질량 분석에 대 한 샘플 복잡성을 절감 하 고 따라서 낮은 풍부한 단백질의 향상을 수행 가능. 불용 성 단백질의 적은 양을 필요 인 경우에 대신 접시에 벌레를 성장 하 여 세라믹 구슬을 가진 균질입니다. 액체 문화 단점 중 하나 이며 그의 경우에 오염 전체 문화 영향을 삭제 해야 합니다. 일반적으로, 선 충 C. 노화 강하게 온도 의해 영향을 하 고이 매개 변수는 밀접 하 게 연령에 따라 단백질 집계에 있는 변이 피하기 위해 액체 문화에서 제어 해야 합니다. 온도 제어 또한 gon-2(-) 돌연변이 사용 하는 경우 생식이 동물의 균질 성 인구를 얻기 위해 필수적 이다.
연구의 목표에 따라 다른 추출 방법을 고려 하는 중요 하다. 여기에 제시 된 생 화 확 추출 처음 질병 관련 집계11,,3031격리 프로토콜에서 적응 했다. 우리는 더 불용 성 집계를 0.5 %SDS 등 세제의 상대적으로 높은 농도 선택 했다. 또한 낮은 원심 속도 0.5 %SDS 불용 성 집계 판,이 프로토콜 것만 격리 큰 집계. 또는, 보다 적게 엄격한 프로토콜 최근에 출판 된10했다. 이 연구에서 더 많은 가용성과 작은 집계도 SDS를 생략 하 고 500000 x g에서 원심 매우 높은 속도 사용 하 여 추출 되었다. 다른 프로토콜의 비교7덜 엄격한 프로토콜 사용 하 여 집계 프로테옴에서 단백질의 수에 있는 일반적인 증가 보여줍니다. 우리는 효율적으로 신호 감소 daf-2 와 수명이 긴 동물 모두 SDS 가용성과 생식이 동물7에 SDS 불용 성 집계의 축적 방지 주의.
Vivo에서 연령에 따라 단백질 집단의 분석 다음 연령에 따라 단백질 집계에 대 한 유전자 변형 모델을 구축, 그것은 관심의와 식 수준을 집계 하기 쉬운 단백질을 overexpress 하는 조직에 고려 관련이 있다. 우리는 노화 소장에서 눈에 띄는 하는 autofluorescence, 간섭을 유발 하지 않도록 머리 지역에 위치한 조직에 식 부탁. 낮은 확대와 함께 형광 표시 된 집계를 시각화 하려면 상대적으로 높은 수준에서 집계 하기 쉬운 단백질을 표현 한다. 다른 한편으로, 너무 높은 식 하면 양식 집계에 집계 하기 쉬운 단백질 이미 젊은 동물에.
함께 찍은, 이러한 메서드는 우리 나이로 프로테옴의 일부 집계 하는 이유를 이해 하 고 궁극적으로 건강 한 노화를 촉진 하는 전략의 발전으로 이어질 도움이 됩니다.

단백질 misfolding 및 집계 AD, PD, 루 경화 증 (ALS), frontotemporal 치 매 (FTD), 그리고 많은 다른 같은 여러 신경 퇴행 성 질환의 특징으로 인식 됩니다. 예를 들어, 녹말 체 소에 α-synuclein 어셈블리는 악화 모터 신경에 있는 양식 세포질 집계에 ALS 환자 TDP-43 또는 FUS misfold에 PD 환자의 substantia nigra에 특히 Lewy 몸으로 축적. 각 이러한 신경 퇴행 성 질환, 단백질 항상성 또는 proteostasis를 유지 하는 메커니즘 질병에 따라서 선도 misfolded 단백질의 축적을 방지 하기 위해 실패 합니다.
Proteostasis 세포 기능을 보장 하기 위해 중요 한 이며, 정상적인 조건 하에서 이러한 규제 메커니즘 단단히 단백질 합성, 접는, 그리고 성능 저하의 속도 제어 합니다. 여러 연구 결과 입증 노화, 수 많은 세포와 장기의 단백질 항상성 유지가 점차적으로 손상 된과 나이 proteostasis 네트워크의 생리 적 저하는에 대 한 중요 한 악화 요인 신경 퇴행 성 질병 (참조1,2,3검토). 사실 단백질 품질 관리 및 펼친된 단백질 스트레스 세포 응답 나이 손상 단백질 misfolding 및 집계 노화의 일반적인 결과 수 제안 합니다. 사실, 우리와 다른 증명 단백질 집계는 질병을 제한 하 고 대신는 프로테옴의 일부 세 동물4,,56,7 세제 불용 성 높게 된다 ,8,,910. 계산 그리고 vivo에서 분석 이러한 생리 연령 관련 집계 여러 측면5질병 집계 닮은 밝혔다. 내 인 성, 연령에 따라 단백질 집단의 발견 우리 ectopically 표현된 인간의 질병 관련 단백질을 사용 하지 않고 단백질 집계, 조절 분자 및 세포 메커니즘을 해 부를 기회를 제공 합니다. 현재, 제한 된 정보만 광범위 한 단백질 용해성의 규칙에 대 한 고 생물의 건강에이 dysregulation의 효과 대 한 존재합니다.
선 충 C. 선 충 이 동물 상대적으로 짧은 수명이 있고 더 높은 유기 체에서 관찰 된 많은 특성 에이징 기능을 표시 조사를 노화에서 가장 광범위 하 게 연구 모형 유기 체 중 하나입니다. 용해성 단백질에 노화의 효과 추출 질병 집계 neurodegeneration 연구11의 분야에서 널리 이용 되는 차동 용 해도에 따라 순차 생 화 확 적인 분류에 의해 C. 선 충 에서 연구 . 양이 많은 질량 분석에 의해 몇 백 단백질 집계-경향이 된다 C. 선 충 에 질병5의 부재를 보였다. 여기 우리가 자세히 설명 액체 문화와 서쪽 오 점 하 여 질량 분석 및 분석 하 여 정량화에 대 한 집계 된 단백질을 순차 추출에 벌레의 많은 수를 성장 하는 프로토콜. 집계 하기 쉬운 단백질을 misfolded 세에 축적 하기 때문에 다른 체세포 조직5,,1213에 선 충 C. 생식 선 및 마스크 변경, 우리를 사용 하 여 생식이 돌연변이 단백질 분석 초점 비 생식 조직에 용해성입니다. 제시 하는 방법에는 0.5 %SDS 불용 성 및 상대적으로 낮은 원심 속도 의해 수송과 매우 불용 성, 큰 집계 분석 수 있습니다. 또한 작고 더 녹는 집계 수집 하 덜 엄격한 추출 프로토콜 또는 되었습니다 다른 곳에서10출판. 또한, 집계에서 vivo에서 C. 선 충에 평가 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.
전반적으로, RNA 간섭 (RNAi)와 함께에서 이러한 메서드는 연령에 따라 단백질 집계 변조에 관심사의 유전자의 역할을 평가할 수 있다. 이 대 한 우리와 RNAi를 사용 하 여 관심사의 특정 단백질의 분해 없이 젊고 세 벌레에서 추출의 분석을 설명 합니다. 이러한 메서드는 단백질 용해성을 조절 하는 proteostasis 네트워크의 구성 요소를 결정 하는 강력한 도구 이어야 한다. 여러 중재와 같은 감소 인슐린/인슐린 같은 성장 인자 (IGF)을 극적으로 선 충 C. 노화14지연 표시 1 신호 (IIS). 장 수 경로 종종 단백질 품질 관리 메커니즘을 유발 하 고 따라서 이러한 경로 수 적극적으로 영향을 미치는 수 단백질 집단의 속도. 예를 들어, IIS 경로7의 억제에 따라 수명이 긴 동물에 감소 고유의 단백질 집합을 설명합니다.

<table style="border-collapse:collapse;width:635pt" width="847">
	<colgroup>
		<col style="width:161pt" width="215" />
		<col style="width:92pt" width="122" />
		<col style="width:258pt" width="344" />
		<col style="width:125pt" width="166" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Fernbach culture flask&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Corning</td>
			<td class="xl19" style="width:258pt" width="344">4425-2XL</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Membrane Screw Cap&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Schott</td>
			<td class="xl19">1088655</td>
			<td class="xl17">GL45</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Nutating Mixer</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">VWR</td>
			<td class="xl19">444-0148</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Separatory funnel</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Nalgene</td>
			<td class="xl19">4300-1000</td>
			<td class="xl17">Capacity 1,000 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">1 ml syringe&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">BD Plastipak</td>
			<td class="xl19">300013</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Gray needle, 27 G x &#189; &#34;, 0.4 mm x 13 mm</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">BD Microlance 3</td>
			<td class="xl19">300635</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Membrane filters 0.025 &#181;M</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Millipore</td>
			<td class="xl19">VSWP04700</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">pH strip</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Machery-Nagel</td>
			<td class="xl19">92110</td>
			<td class="xl17">pH-Fix 0-14</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Roche</td>
			<td class="xl19">4693132001</td>
			<td class="xl16" style="width:125pt" width="166">Complete Mini EDTA-free tablets&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Octoxynol-9&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Applichem</td>
			<td class="xl19">A1388</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">M1317</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Nonylphenylpolyethylenglycol</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Applichem</td>
			<td class="xl19">A1694</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Nonidet P40 (NP40)</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">DNaseI</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Roche</td>
			<td class="xl19">04716728001</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">recombinant, RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">RNaseA</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Promega</td>
			<td class="xl19">A7973</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">solution</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Total protein blot staining</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermofisher</td>
			<td class="xl19">S11791</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Sypro Ruby protein blot stain</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Total protein gel staining</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermofisher</td>
			<td class="xl19">S12001</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Sypro Ruby protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Serva</td>
			<td class="xl19">36970</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Iodoacetamide</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Serva</td>
			<td class="xl19">26710</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Ammoniumbicarbonate</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">09830</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Promega</td>
			<td class="xl25" style="width:258pt" width="344">V5111</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Isobaric tags for relative and absolute quantitation</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sciex</td>
			<td class="xl19">4352135</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">iTRAQ Reagents Multiplex Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge Avanti J-26XP</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Beckmann Coulter</td>
			<td class="xl19">393126</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Ultracentrifuge Optima Max-XP</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Beckmann Coulter</td>
			<td class="xl19">393315</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge 5424R</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5404000413</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge 5702</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5702000329</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge Megafuge 40R</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75004518</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Concentrator Plus</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5305000304</td>
			<td class="xl17">Centrifugal evaporator</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Fluorescent stereo-microscope M165 FC&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Leica</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">With Planapo 2.0x objective</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Dissection microscope</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Leica&#160;</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17">Leica S6E</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="80" rowspan="2" style="width:161pt;height:60.0pt" width="215">High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td class="xl18" height="80" rowspan="2" style="width:92pt;height:60.0pt" width="122">Zeiss</td>
			<td class="xl19" height="80" rowspan="2" style="width:258pt;height:60.0pt" width="344"></td>
			<td class="xl16" height="80" rowspan="2" style="width:125pt;height:60.0pt" width="166">With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">Software</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl32"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Image analysis software</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">ImageJ</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Analysis of mass spectrometry data</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Protein Prospector</td>
			<td class="xl136" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl137">http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">E.coli strain</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">OP50</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">CGC</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">RNAi bacteria</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">L4440</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Julie Ahringer RNAi library</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">C. elegans mutants</td>
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122"></td>
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl17" height="42" style="height:31.5pt">CF2253</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">CGC, strain name: EJ1158&#160;</td>
			<td class="xl40" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl17">Genotype: gon-2(q388)</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">C. elegans transgenics</td>
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122"></td>
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">DCD214</td>
			<td class="xl25" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122">Della David&#39;s lab at DZNE T&#252;bingen</td>
			<td class="xl40" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl68" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166">Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">DCD215</td>
			<td class="xl87" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122">Della David&#39;s lab at DZNE T&#252;bingen</td>
			<td class="xl40" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl68" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166">Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study changes in inherent protein aggregation with age in caenorhabditis elegans

마지막 십 년간에서 Alzheimer의 질병 (광고) 등 파 킨 슨 병 (PD), 신경 장애의 보급은 성장 했다. 이 나이 관련 무질서는이 환자의 두뇌에 있는 fibrillary 구조 단백질의 모양 특징. 일반적으로 수용 성 단백질을 받을 이유는 정확 하 게 집계 프로세스를 제대로 이해 남아 있습니다. 발견 단백질 집계 질병 프로세스에 국한 되지 않습니다 정상적인 노화 과정의 일부 단백질 집계, ectopically를 사용 하지 않고 조절 분자 및 세포 메커니즘의 연구를 활성화 하는 대신 인간의 표현 질병 관련 단백질입니다. 여기는 상호 보완적인 접근 방식을 통해 꼬마 선 충 에서 고유의 단백질 집계를 검토 하는 방법론에 설명 합니다. 첫째, 우리 세 동물을 얻을 나이 동기화 C. 선 충 의 많은 성장 하는 방법을 검토 하 고 우리는 매우 불용 성-큰 집계 분리 하 생 화 확 적인 절차를 제시. 대상된 유전 최저와 함께, 그것은 홍보 또는 양이 많은 질량 분석 어느 포괄적인 분석을 사용 하 여 연령에 따라 단백질 집계 방지에 관심사의 유전자의 역할을 해 부 수 또는 후보-기반 항 체와 분석입니다. 이러한 결과 다음 형광 태그 집계 하기 쉬운 단백질을 표현 하는 유전자 변형 동물 vivo에서 분석에 의해 확인 됩니다. 이러한 메서드는 특정 단백질은 나 이와 함께 집계 및 궁극적으로 완전 한 기능이 단백질을 유지 하는 방법 하는 경향이 이유를 명확히 하는 데 도움이 됩니다.

우리가 사용 하는 방법 여기 어떻게 수명이 긴 동물을 평가 하 여 감소 IIS 변조 연령에 따라 단백질 집계. 서쪽으로 오 점 (단계를 참조 하십시오 2.2, 빨리 서쪽 오 점 분석에 대 한 불용 성 단백질 추출), 우리는 총 영 (성년의 날 3)의 불용 성 단백질 함량을 분석 (성년의 날 18) 웜 제어 RNAi와 RNAi는 인슐린을 대상으로 세 / IGF-1-같은 수용 체 daf-2. RNAi 조건 (그림 2A) 총 단백질 수준의 나이 또는 제어와 daf-2 사이 큰 변경 없이 관찰합니다. 예상 대로, 우리는 제어 동물 (그림 2B) 매우 불용 성 단백질의 수준에 강한 나이 관련 된 증가 감지. Daf-2 RNAi에 수명이 긴 동물에 비교, 집계 성향 크게 감소 되었다. 전체 단백질의 불용 성 추출 물 얼룩 daf-2 나이 일치 하는 컨트롤에 비해 RNAi에 18 일 된 벌레에서 추출 물에 덜 복잡 한 단백질 밴드 패턴을 공개 했다. 양이 많은 질량 분석 분석 시연 감소 IIS와 수명이 긴 동물 덜 전체 나이 관련 된 단백질 집계 있고 중요 한 것은, daf-2 억제는 완전히의 연령에 따라 용해성을 폐지는 단백질7의 특정 하위 집합입니다. 이러한 결과에 후속, 하 우리는이 집계 하기 쉬운 단백질, PAB-1 중 하나에 집중. PAB-1 예측 "프리온-같은" 도메인 RNA 의무적인 단백질입니다. 수명이 긴 동물 PAB-1 나 (그림 2C)이 수용 성 유지 확인 항 체 얼룩이 지기.
분석에 대 한 vivo에서 PAB-1 집단의, 우리는 tagRFP::PAB-1 인 두 근육에 표현 하는 유전자 변형 동물 생산. 젊은 동물에 tagRFP::PAB-1 주로 만들어진다 (그림 3A, "낮은" 집계 수준) 인 두에 걸쳐 위치 했지만 나이, 밝은 puncta 후부 인 두 전구 ( 에서에서 시작에 진보적인 축적 관찰 그림 3A, "중간" 집계 수준). 노화, 하는 동안 우리는 또한 동물의 증가 수에 앞쪽 인 두 전구 (그림 3A, "높은" 집계 수준)에서 집계 관찰. 이러한 서로 다른 범주로 그룹화 동물 들, 우리는 인구에 PAB-1 집단의 속도 득점. 성년의 날 2에 벌레 (88%)의 대부분 또는 거의 puncta 졌고 아무 동물 높은 집계 레벨을 감지 했다. 이미 주 5, 중간을 보여주었다 인구와 벌레의 하루 7 70% 이상에서 16% 높은 집계 레벨의 19% 중간 및 높은 집계 수준을 제시. TagRFP:PAB의 연령에 따라 집계에 장 수의 효과 분석-1, 우리는 daf-2 돌연변이와 유전자 변형 tagRFP::PAB-1 웜 생성. 이 동물 보여 크게 감소 tagRFP:PAB-하루 7 (그림 3B) 에서도 중간 및 높은 집계 레벨을 전시 하는 인구의 15% 미만으로 노화와 1 puncta 형성.
여기 설명 하는 다른 접근을 사용 하 여 우리가 밝혀 감소 IIS 방지 다른 범위를 연령에 따라 단백질 집계 하 고 수명이 긴 동물 복원 PAB-17의 역학에 특히 효율적입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig1.jpg"> 그림 1 :의 워크플로 변경을 내재 단백질 집계에 나이 공부를 도식 C. 선 충.  주요 단계는 굵게 합니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig2.jpg"> 그림 2 : 제어 동물, 동물 감소 daf-2 신호에 나이 단백질 용해성 증가. (A) 총 단백질 3 일과 하루 18 gon-2(-) 돌연변이 제어 및 daf-2 RNAi (25 ° C에서 성장)에 복종에서 총 분수의 얼룩. (B) 총 단백질은 SDS 불용 성 3 일과 하루 18 gon-2(-) 돌연변이 제어 및 daf-2 RNAi (25 ° C에서 성장)에 복종에서 분수의 얼룩. 패널 참조7에서 재 공포 하 는입니다. (C) Immunoblot SDS 불용 성 분수, PAB-1를 감지 하 여 관련 단백질 밴드 빨간색 화살표로 표시. 패널 참조7에서 재 공포 하 는입니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig3.jpg"> 그림 3: 나 tagRFP::PAB-1 puncta의 축적을 방지 간단한 daf-2 신호. (A) 인 두 근육에 tagRFP::PAB-1 overexpression 가진 벌레의 대표 사진 (고배율 현미경, tagRFP 검색 설정: 여기 558 nm, 방출 583 nm). 동물을 낮은 (후부 인 두 전구에서 0-10 tagRFP::PAB-1 puncta), 중급 (후부 인 두 전구에서 10 개 이상의 puncta), 또는 높은 집계 수준 (앞쪽 인 두 전구에서 10 개 이상의 puncta) 표시 됩니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 다른 tagRFP::PAB-1 집단의 (B) 정량화 wildtype 나이 수준 및 daf-2 돌연변이 배경 밝혀 수명이 긴 동물 나이로 강하게 지연된 tagRFP::PAB-1 집계. 주 2, 하루 5, 및 7 일 daf-2(-) wildtype 배경, 대 중간과 높은 집계 수준에 비해 낮은: 피셔의 정확한 시험, * * *p < 0.0001. 패널 참조7에서 재 공포 하 는입니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>재고 솔루션</td>
			<td>금액</td>
			<td>최종 농도</td>
			<td>의견/설명</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">액체 문화, 총 볼륨 300 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>S (500 mL: 5.9 g NaCl, 50 mL 1 M 칼륨 인산 염 pH 6)에 대 한 기초</td>
			<td>200 mL</td>
			<td></td>
			<td>1 M 칼륨 인산 염 pH 6: 1 l: 129 대 g KH2포4 이수소, 52 g K2HPO4 염기 무수</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M 칼륨 구 연산 염 pH 6 (400 mL: 13.1 g 구 연산 산 성 일 수화물, 134.4 g 트라이-칼륨 시트르산 일 수화물)에 대 한</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>10 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>추적 금속 솔루션 (에 대 한 1 l: 1.86 g Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 0.69 g FeSO4 · 7h2O, 0.2 g MnCl2 · 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 · 7h2O, 0.025 g CuSO4 · 5 H2O)</td>
			<td>3 mL</td>
			<td></td>
			<td>4 ° C에서 어둠 속에서 재고 솔루션을 저장</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4 (500 mL: 123.3 g)</td>
			<td>900 Μ L</td>
			<td>3 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M CaCl2 (500 mL: 73.5 g)</td>
			<td>900 Μ L</td>
			<td>3 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>200 µ g/mL Carbendazim (50 mL: 10 mg에 메탄올)</td>
			<td>150 Μ L</td>
			<td>100 ng/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mg/mL 콜레스테롤 (에 에탄올 100 mL: 0.5 g)에 대 한</td>
			<td>300 Μ L</td>
			<td>5 µ g/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">리어셈블리 (랩) 높은 소금 추출 버퍼, 30 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M 4-Morpholineethanesulfonic 산 (MES)</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>100 m m</td>
			<td>랩 재고 버퍼 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 M Ethyleneglycoltetraacetic 산 (EGTA)</td>
			<td>60 Μ L</td>
			<td>1mm</td>
			<td>랩 재고 버퍼 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)</td>
			<td>6 Μ L</td>
			<td>0.1 m m</td>
			<td>랩 재고 버퍼 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>15 Μ L</td>
			<td>0.5 m m</td>
			<td>랩 재고 버퍼 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M NaCl</td>
			<td>4.5 mL</td>
			<td>750 mM</td>
			<td>랩 재고 버퍼 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M 나트륨 불 화물 (NaF)</td>
			<td>600 Μ L</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>랩 재고 버퍼 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30 ml ddH2O 총 완료</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 50</td>
			<td>*</td>
			<td>2 x</td>
			<td rowspan="4">* 추가 시 약 필요 하 랩 재고 버퍼의 양을 복용 후 (질량 분석에 대 한 추출에 대 한 6 mL).</td>
		</tr>
<tr>
<td>100mm 소 프로 파 놀,-20 ° C에에서 Phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF)</td>
			<td>*</td>
			<td>1mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 U / µ L DNaseI</td>
			<td>*</td>
			<td>200 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mg/mL RNaseA</td>
			<td>*</td>
			<td>100 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">1 M 자당, 30 mL와 랩</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M 자당 (50 mL: 34.2 g)에 대 한</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>1 M</td>
			<td>DNaseI와 RNaseA 외 랩 버퍼 시 약 추가</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Radioimmunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 버퍼, 30 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 8</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>RIPA 버퍼 재고 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M NaCl</td>
			<td>0.9 mL</td>
			<td>150 mM</td>
			<td>RIPA 버퍼 재고 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>0.3 mL</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>RIPA 버퍼 재고 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>RIPA 버퍼 재고 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% 나트륨 deoxycholate (SDO)</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>RIPA 버퍼 재고 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40)</td>
			<td>0.3 mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>RIPA 버퍼 재고 구성 요소</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30 ml ddH2O 총 완료</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 밀리미터 PMSF</td>
			<td>*</td>
			<td>1mm</td>
			<td rowspan="2">* 추가 시 약 필요는 RIPA 재고 버퍼의 양을 복용 후 (질량 분석에 대 한 추출에 대 한 10 mL).</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 50</td>
			<td>*</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">우 레 아/SDS 버퍼, 10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>우 레 아</td>
			<td>4.8 g</td>
			<td>8 M</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>77 밀리 그램</td>
			<td>50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris pH 8</td>
			<td>0.5 mL</td>
			<td>50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ml ddH2O 총 완료</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">투 석 버퍼, 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td>트리 스</td>
			<td>6 g</td>
			<td>50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DTT</td>
			<td>154 mg</td>
			<td>1mm</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>100 밀리미터 PMSF</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>0.1 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PH 7.5 고 ddH2O 1 l 총 완전 한 조정</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 액체 문화, 불용 성 단백질 추출 및 분리에 대 한 완충기.

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Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

8.4K 조회수.  German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE). 여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

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Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

연구

생물학

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

생체 외 분석에서 집계 Hyperphosphorylated 타우 단백질을 사용하여

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

의 재배<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 실험실에서 세 가지 차원에서

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

결합 된 뉴클레오티드와 꼬마 선 충 의 단백질 추출

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...