This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ צבירה (20 מ&quot;מ טריס, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). אחסן בRT, יציב במשך חודשים. להשלים dithiothreitol 1 מ&quot;מ (DTT) לפני השימוש. הערה: חיץ מבוסס HEPES (10 מ&quot;מ HEPES, pH 7.5, 0.1 מ&quot;מ EDTA, 5 מ&quot;מ DTT) גם מייצר תוצאות דומות בצבירת טאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן thioflavin T או thioflavin פתרון S המניה (3 מ&quot;מ, מומס חיץ צבירה), ולסנן לפי 0.22 מיקרומטר יחידת סינון סטרילי. חנות ב -20 ° C בצינור מכוסה על ידי רדיד אלומיניום, יציב במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות הפרין (300 מיקרומטר, מומס חיץ צבירה). חנות ב -20 ° C, יציבה במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן dithiothreitol מניות (DTT) (1 M, מומסים במים). Aliquot לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. לפני מבחני צבירה, להפשיר את הפתרון 1 M ב RT. מהמניות 1,000x זה, להכין aliquot של 100 מ&quot;מ עובדים המניה עם מים ללא יונים. השאר על קרחעד מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר טאו ממקפיא -80 מעלות צלזיוס. להפשיר על קרח. התאם טאו לריכוז שנקבע מראש עם חיץ הצבירה. ספין בmicrocentrifuge ב20,800 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר אגרגטים גדולים מראש יצרו. צעד מראש ספינינג זה מגדיל עקביות במדידת הקרינה שלאחר מכן של כל מנה של הכנת החלבון. מעביר את supernatant לצינור אחר; להשאיר על קרח עד מוכן להרכיב את תגובת הצבירה. </li></ol> 2. אין-צבע, Assay Terminal הערה: תגובת הצבירה של assay זה נעשה בהעדר הצבע פלואורסצנטי. לאחר ערבוב כל הרכיבים, התגובה מותר להמשיך לנקודות זמן שנקבע מראש. אז Aliquots לקוחים מתוך תגובת הצבירה ומעורבבת עם tht או THS לעמילואיד מחייב לפני קריאת הקרינה. הנפח הראשוני של תגובת הצבירה תלויה במספר נקודות זמן הדרוש. גישה זו עשויה requזעם כמות גדולה של חלבון טאו, אבל הוא מהיר, פשוט, וניתן לעשות זאת בfluorometer או קורא צלחת רב היטב (ראה דיון). להלן פעולת צעד-אחר-צעד, באמצעות spectrofluorometer הקומפקטי ISA SPEX FluoroMax-2 לכימות הקרינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תערובת הקיבוץ בצינורות 1.5 מיליליטר Eppendorf כמו בטבלה 1. כל עמודה מייצגת את המרכיבים דרושים לתגובת 100 μl, וזה מספיק למדידת נקודת זמן אחת. להתאים את הכמות לתערובת הצבירה כולו מבוססת על נקודות הזמן דרושות לניסוי המסוים. להוסיף 10% נוספים מכל רכיב לתת מקום לpipetting שגיאה. ניתן להחליף הפרין התגובה מכילה הטיפוסי מוצג כאן על ידי חומצה הארכידונית או חיץ צבירה. להוסיף DTT עד 1 מ&quot;מ לתערובת התגובה. אם כל התגובה נמשכת יותר מיום אחד, להשלים יומיומי DTT טרי (1 מ&quot;מ) כדי להבטיח סביבת הפחתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב. Plaהספירה כל תגובה באמבט חממה או מים 37 מעלות צלזיוס. תסיסה אינה נחוצה לצבירת טאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מדידת הקרינה, להדליק את spectrofluorometer (המנורה ראשונה, ולאחר מכן מחשב). הערה: מנורת קשת קסנון, שניתן להשתמש מייד. עם זאת, התוצאות הטובות ביותר עבור לאפשר להתקן להתחמם במשך כ -10 דקות לפני קריאת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה במחשב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר במצב בזמן אמת תצוגה במכשיר Control Center, גל עירור מוגדר 450 ננומטר (חריץ 2 ננומטר) ואורך גל פליטה 510 ננומטר (חריץ 5 ננומטר). מצב חלון תצוגה לסגור בזמן אמת כדי לחזור למרכז בקרת Instrument. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מפתח אורך גל ניתוח, הוספת עיתונות &gt;&gt; קבוע במסגרת העליונה להוסיף סטי אורכי גל. פרמטרים שנקבעו רכישת שגיאת תקן 1 וניסויים מרביים עד 3, ולאחר מכן לחץ על הוסף. לחץ על Go! כדי לפתוח את תצוגת נתוניםחלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון תצוגת נתונים, לחץ על התחל ACQ כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח מדגם החדשה. בחר &quot;לא ידוע&quot; לסוג מדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תערובת צבירה 100 μl, להוסיף 98 μl חיץ צבירה ו -2 μl 3 מ&quot;מ thioflavin מספר פעמים ט Pipet לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התערובת כולה לקובט (FCA3, ממד חיצוני, wxlxh = 12.5 מ&quot;מ x 12.5 מ&quot;מ x 45 מ&quot;מ). מניחים את קובט בבעל המדגם במדגם-התא ולסגור את המכסה. לחץ על הפעל כדי לאסוף את נתוני הקרינה. רשום את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קובט ולמזוג את הפתרון. יש לשטוף את קובט על ידי מים מזוקקים 3 פעמים. יבש על ידי נשיפת אוויר ובמחוץ לקובט. </li></ol> 3. עם צבעים, מתמשך המצב Assay על קורא צלחת SpectraMax M2 הערה: assay זו שונה מהקודמת שבצבע הניאון tht או THS כלול בaggregaתגובת tion. זה מאפשר מדידה רציפה של אותה הקבוצה של תגובות. בשל השימוש החוזר ונשנה של התגובה, שיטה זו טובה יותר לעשות עם קורא צלחת רב גם אוטומטי (כפי שמוצגת להלן הניתוח של SpectraMax M2). Fluorometer רגיל גם עובד, אבל תדירות מדידה של תגובות צבירה מהירות היא מוגבלת למדי, בשל האופי הידני של הפעולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את תמהיל הצבירה בצלחת 96-היטב (96-גם צלחת מוצקה שחורה, גם בנפח 360 μl, תחתית שטוחה) כמו בטבלה 2. כל עמודה מייצגת את המרכיבים דרושים לתגובת 200 μl, וזה מספיק לאחד מדידת נקודת הזמן. מערבבים היטב על ידי pipetting מספר פעמים. להשלים טרי 1 המ&quot;מ DTT בכל יום במהלך כל ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את צלחת 96-גם על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל נקודת זמן לפני מדידת הקרינה, להפעיל את קורא microplate מצב מרובה ומחשב. לאפשר מספיק זמן לmachine לייצב, כ -10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה במחשב. להגדיר טמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ולבחור עוצמת הקרינה מצב (FI-Top קרא), גל עירור להגדיר באורך גל ופליטה 450 ב 510 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת 96-היטב למגירה ולחץ על מקש READ להתחיל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקריאה, להסיר את הצלחת ולהחזיר אותו בחזרה לחממה 37 ° C. להעתיק את הנתונים ולהדביק לתוך גיליון אלקטרוני Excel לניתוח נתונים ומזימות. </li></ol> 4. עם צבעים, המתמשך המצב Assay על Spectrofluorometer קומפקטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תערובת הקיבוץ בצינורות 1.5 מיליליטר Eppendorf כבטבלה 3. כל עמודה מייצגת את המרכיבים דרושים לתגובת 200 μl, וזה מספיק למדידת נקודת זמן אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את spectrofluorometer ולהגדיר את התוכנה כבצעדים 2.3 ו -2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל התערובת tקובט OA. מניחים את קובט בבעל המדגם במדגם-התא ולסגור את המכסה. לחץ על הפעל כדי לאסוף את נתוני הקרינה. רשום את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך קריאה במרווחי זמן המתאים על-ידי לחיצה על הפעלה והקלטת נתונים. אם הצבירה היא להיות במעקב בתדירות גבוהה (לדוגמא, בכל שנייה 30 או 60), השאר את התגובה בקובט ובמכונה עד או המדידה סיימה, או כאשר יש מספיק זמן כדי להחליף תגובות או cuvettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קובט ולמזוג את הפתרון. יש לשטוף את קובט על ידי מים מזוקקים 3 פעמים. יבש על ידי נשיפת אוויר ובמחוץ לקובט. </li></ol>

We have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מדגים תנאי assay שונים ומכשירים המזהים קינטיקה צבירת טאו המהיר זירחון תלוי. בassay המסוף, צבע הקרינה tht מתווסף לחלק מהתגובה הוסרה מתערובת האמן בכל נקודת זמן. עמילואיד-induced כריכת הקרינה נמדדה 26 אז. במקרה השני, עם צבעי מצב, צבירת טאו מתבצעת בנוכחות tht או THS, טיוח זה סוג של תגובה מתאימה להערכה אוטומטית בזמן אמת של הצמיחה של מצרפי טאו. לכל אחת מהשיטות הללו יתרונות והחסרונות שלה. תגובת מסוף המצב מתנהלת רק עם אלה מרכיבים הדרושים לצבירת טאו. דילול וערבוב התגובה עם thioflavin T באופן דרסטי מאיטה את קצב גידול הקרינה, במהות עוצר את התגובה לכימות הקרינה. שיטה זו ובכך היא גם תואמת עם תפעול ידני. עם זאת, מכיוון שreaction הוא כמעט נפסק בנוסף tht, כמות גדולה של טאו עשויה להידרש לזוממת עקומת צבירה. עוד הערת אזהרה פוטנציאל לשיטה זו היא שגישה תכופה לתערובת התגובה עשויה להציג את החיידקים או זיהום מפרקי חלבונים, או חמצון חלבון. בניגוד לכך, המצב עם צבעים מאפשר את הדור של עמילואיד בנוכחות tht או THS. קידום הצבירה ניתן לנטר באופן רציף מבלי להפריע לתגובה. תכונה זו היא אטרקטיבית במיוחד בעת הקמת פלטפורמת assay אוטומטית. עם זאת, צבעים שונים עשויים לעורר תגובה מסוימת. ואכן, THT מעכב הצטברות טאו וp-טאו באופן משמעותי, אך יש THS השפעות קטנות (השווה איורים 3 ו -5). יש כמה צבעי הקרינה אחרים, כולל thiazines האדום וקונגו, אשר היו בשימוש במחקרים היסטולוגית וביולוגיה של תא ליצירת PHF. דו&quot;ח אחד לפחות הצהיר כי חלק מהצבעים אלה עלול לגרום להצטברות טאו ברקמהתאי תרבות 45. לכן, בעת בחירת תרכובות אלה ללימודי קינטיקה amyloidogenesis, זהירות תהיה מתורגלת ושצבעים שונים עשויים להיות בהשוואה. עם כל כבוד לבחירה של מכשיר, fluorometer היחיד המדגם המשמש בגישה הראשונה הוא אמין ביותר, אבל הפעולה עשויה להיות מייגע, כאשר יותר מכמה תגובות הן להיות בהשוואה. באמצעות cuvettes מרובה יכולה לעזור למנוע זיהום צולב בין תגובות, למרות שעלות cuvettes קוורץ השבירה אלה עשויה להיות מונעת מסוימים. לעומת זאת, קורא microplate רב גם יכול לבחון את התגובות מרובות באותו הזמן. השימוש ב96-גם צלחות חד פעמיות הוא יתרון גם כן. עם גוף חימום, קורא microplate יכול להיות מכשיר ייעודי לניטור תגובות מרובות על 37 מעלות צלזיוס במשך תקופה ארוכה של זמן. עם זאת, אידוי עשוי להיות מקור לדאגה. DiNitto et al. מעולף תגובה דומה עם שמן מינרלים כדי למנועאידוי 46. אמצעי זהירות מסוימים שיש לנקוט לפרוטוקולים לעיל כדי להבטיח תוצאות עקביות וכמותיים. ראשית, טאו וp-טאו באופן ספונטני ליצור אגרגטים עמילואיד לאורך זמן, במיוחד כאשר בריכוז גבוה. זהו אפוא הכרחיים כדי להקפיא את כל aliquots של preps חלבון, ולהפשיר את הנפח הדרוש רק לפני הניסויים. אף על פי כן, כמה אגרגטים, כוללים ביניים פרטניים לזיהוי על ידי tht 47 אולי נוצרו במהלך תקופת ההכנה של חלבונים רקומביננטי. קריאת הקרינה ראשונית ניכרת של תגובת צבירה אופיינית היא כך נפוצה. עם זאת, הוסיף צעד מראש ספינינג והעברת supernatant לצינור נפרד, אפילו בלי גלולה חלבון גלויה, יכול להפחית, ולשמור על הקרינה עולה בקנה אחד, ראשונית מאותו הקבוצה של הכנת טאו וp-טאו. שנית, פתרון מניות העבודה של tht (כלומר, 60 מיקרומטר) הוא יציב בRT עבור פחות משבוע לפני ההקרינה דואר פוחתת. הוא יעץ לכך מחדש לעשות 60 מיקרומטר tht כל כמה ימים. סיבה בולטת אחת שבסיס מחקרים של צבירת p-טאו היא הפיתוח של כלי אבחון לספירת רומן ותרופות. תרכובות המעכבות או לחזור צבירת טאו רקומביננטי זוהו ממסכי תפוקה גבוהה ובדיקות ממוקדות 18,40,41,48. יעילות של תרכובות אלה לצבירת p-טאו עדיין לא הובהרה. במסכים אלה בוצעו במצב סופני על ידי מחלק תמהיל צבירה משותף ללא צבע לבארות multiplate בודדות עם תרכובות שונות. בדרך כלל לאחר הדגירה O / N, THT או THS מתווסף למדידת הקרינה, חושף את הכח המעכב של תרכובות רבות. הגישה עם צבעים שהוזכרו לעיל ועל ידי אל רנקין ואח. 49 טרם התאגדו למסכי תפוקה גבוהה. כעת, עם טאו hyperphosphorylated זמין למחקרים הקינטית ותרופות של לזווגהיווצרות חוט סליל, גילוי התרופות למחלת אלצהיימר עשויה לקדם רחוק יותר. לבסוף, ראוי לציין כי המחקר של צבירת p-טאו הוא בעל חשיבות קריטית ללא רק tauopathies, אלא גם יכול להשפיע על אוכלוסייה רחבה עוד יותר. לדוגמא, ישנם דיווחים כי סבכי neurofibrillary הם לגילוי בחלק מהחולים של אנצפלופתיה הטראומטית הכרונית, כגון נגנים מקצועיים אמריקאים כדורגל ומתאגרפי 50-52. מתאם דומה דווח גם לפגיעה מוחית טראומטית בודדת או חוזר על עצמו כולל חיילים 53. פרוטוקולים שתוארו בעבודה זו עשויים לעזור לגילוי ופיתוח התרופות חדשות מיקוד אגרגטים p-טאו בתאים עצביים.

מחלת אלצהיימר (AD) היא אחד מאוסף גדול של הפרעות ניווניות הידועות כtauopathies. Tauopathy פתולוגיה שבבסיס המובהק הוא סבכי neurofibrillary, NFTS, בתאי עצב, האסטרוציטים ומיקרוגליה 1-4. צפיפות NFT האזור בקורלציה עם ליקוי קוגנטיבי 3.5 ונוירון הפסד 6. NFT האזור מכיל חלבון בעיקר hyperphosphorylated טאו (המכונה &quot;p-טאו&quot; מעתה ואילך) שיוצר חוטים ישרים או לזווג סליל (PHF) 7,8. טאו הוא חלבון הקשורים microtubule חשב כדי להקל על תחבורת axonal שהיא חיוני לאיתות וסחר 9,10 עצביות. כל מולקולת טאו מכילה 2 עד 3 פוספטים במוח נורמלי, אבל עליות תוכן phosphoryl על ידי כמה קפלים בחולי tauopathy 11. קינאז מרובים עשוי לתרום לhyperphosphorylation טאו כולל GSK3β (3β kinase synthase גליקוגן) וCDK5 (cyclin-dekinase התליון 5) 12,13, אבל ההדק הישיר לזירחון פתולוגי נשאר 14 חמקמקים. זירחון החריג בתוך או ליד המוטיבים מחייב microtubule dissociates טאו מmicrotubule 15, וגורם לטאו אי-לוקליזציה לתא somatodendritic, שבו p-טאו oligomerizes לחוטי סליל ישרים או לזווג שיכול בסופו פלמר לתכלילים NFT אזור. הקשר ההדוק בין hyperphosphorylation טאו, היווצרות NFT אזור, וניוון של מערכת עצבים הוביל להשערה הרווחת כי סבכי p-טאו לעורר תגובה ציטוטוקסיות אפופטוטיים ואחרת, ובכך הוא הגורם הבסיסי לניוון של מערכת עצבי tauopathy 16,17. מסכי סמים ובדיקות קליניות מוקדמות המבוססים על הנחה זו כבר הושקו 18. עם זאת, השערה זו עומדת בפני אתגרים 19,20. לדוגמא, Santacruz et al. הראה כי תפקודים קוגניטיביים של עכברים הטרנסגניים ניתן לשפר על ידי דיכוי הביטוי של מוטציהטאו האנושי, למרות שNFTS המשיך ליצור ממולקולות טאו קיימות 21. במודל דרוזופילה, NFT אזור הוצגו לעקל טאו cytosolic הרעיל כדי להגן על תאי עצב שבבסיס 22,23. ברור, את התפקיד בפתוגנזה של NFT אזור, אם בכלל, ישפיע באופן משמעותי את הכיוון של פיתוח תרופות tauopathy. בריכוזים גבוהים, חלבון tau המוח רקומביננטי או נורמלי באופן ספונטני אבל לאט לאט polymerizes למבנה כמו PHF-במבחנה, כפי שצוין על ידי הקשירה של כמה צבעי β גיליון העדיפו ניאון, במיקרוסקופ אלקטרונים, וספקטרוסקופיה פיזור אור 24-27. הפרין הוספה או חומצה הארכידונית, חומצת שומן בשפע במוח אנושי, באופן דרסטי מאיצה היווצרות PHF בisoform- טאו ונימוסי ריכוז תלוי inducer 28-32. מעניין לציין, שטאו hyperphosphorylated מטוהר ממוח לספירה או שהוכן על ידי ממצה בתגובות זירחון מבחנהggregates מהיר ויעיל יותר 26,33-35. תוצאות אלו הן בהסכם מצוין עם התפקידים פתולוגית של p-טאו. מערכת במבחנה המבוססת על הצבירה של p-טאו ניתן אפוא לשמש ככלי רב עוצמה להקרנת סמים לספירה. לאור קשר ההדוק בין צבירת טאו והניוון של מערכת העצבים ההדרגתית של הספירה, כמו גם הכישלון האחרון בפיתוח תרופות מיקוד פלאק Aβ, עוד סמן היסטולוגית מפתח של הספירה 36-38, העניין בגילוי תרופות השולטות צבירת טאו עולה. ואכן, כמה קבוצות כבר החלו מסכי סמים בתפוקה שונה, תוך שימוש בתגובות צבירת טאו מבחנה, כמו assay העיקרי. מספר הכימיקלים נמצא להציג פעילויות מעכבות או היפוך על הצטברות טאו במבחנה 39-42. עם זאת, כל מסכים רגולטור צבירת טאו טאו הנוכחי להשתמש ללא שינוי שמחטיא את מטרת פתולוגי המפתח של זרחןylation, העלאת דאגה לייחודו ויעילותו של שימוש בתרכובות אלו בטיפול לספירה. אחד המכשולים העיקריים של פיתוח מבחני קיבוץ לאפיון ביוכימי והקרנת הסמים AD הוא הייצור של כמויות מספיקות של חלבון טאו hyperphosphorylated הרלוונטי pathophysiologically. שימוש במערכת קטליזה-Assisted הרוכסנים שבי איזופורם 1N4R של טאו וkinase GSK-3β הם שיתוף לידי ביטוי בE. coli כחלבוני היתוך רוכסן לאוצין, יש לנו להתגבר על האתגר הזה (. סוי et al, הוגש; ראה איור 1 עבור המוצרים הסופיים של טאו וp-טאו; ראה גם 43 לאפיון ספקטרומטריית מסה ראשוני של p-טאו). מהרכב של תשעה נוגדנים ספציפיים לאתרי זירחון שונים של טאו, אותות חיוביים נראו בשמונה עמדות (מידע לא מוצג). בהמשך, אנו מתארים פרוטוקולים וinstrumentations שיכול להבדיל ד הקינטית הצבירהifferences בין טאו ללא שינוי ומיני p-טאו. מבחני אלה שונה מפרוטוקולים שפורסמו שנמדדו העלייה של הקרינה של thioflavin T (THT) או thioflavin S (THS) על עמילואיד (מצרפי טאו) מחייב 26. ב&quot; המסוף &quot;הראשון, גישה לא-צבע, תגובות צבירה הם התאספו וטופחו בהעדר צבע עמילואיד. בנקודות זמן שונות, aliquot של כל תגובה מוסרת ומעורבב עם נפח שווה של חיץ tht המכיל לעצור צבירה ולאפשר tht להיקשר אגרגטים טאו. הקרינה נמדדת על ידי fluorometer IAP FluoroMax-2. במקרה השני &quot;עם צבעים&quot; assay מעקב הרציף, THT או THS כלול בתגובות הצבירה. הקרינה ניתן למדוד באופן רציף לאורך כל הניסוי באופן ידני או באמצעות קורא רב-צלחת. בנוסף, אנו מתארים assay המשתמש בריכוז ליד-פיסיולוגי של טאו וp-טאו לקיבוץ במו המדידה המתמשךדה. ההשפעה של זירחון נשארה לזיהוי בקלות. להלן, נתאר נהלי פעולת צעד-אחר-צעד, ולהראות תוצאות נציג של מבחני אלה. דיון בכמה מהיתרונות והחסרונות של כל גישה, כמו גם יישומי הקרנת סמים פוטנציאליים יבוא בעקבותיו. בריכוז גבוה, טאו אגרגטים למבנים דמויים-עמילואיד באופן ספונטני. עם זאת, במעבדה, fibrillization טאו מואץ בדרך כלל על ידי מעוררים כגון הפרין (משקל מולקולרי ממוצע, 6,000 g / mol) וחומצה הארכידונית. דוגמאות שמוצגים במסמך זה כוללים 30 מיקרומטר הפרין. ההיווצרות של אגרגטים עמילואיד טאו מנוטרת על ידי הקרינה הנובעת מעמילואיד הכריכה בthioflavin T (THT) או thioflavin S (THS). על כריכה למצרפי טאו, THT מציג משמרת אדומה בקרינה (עירור: 450 nm; פליטת שיא: 485 ננומטר). THS, לעומת זאת, יש פליטה חלשה ב 510 ננומטר (עירור ב 450 ננומטר) לפני עמילואיד מחייב, אבל fluorescenc זהעליות דואר באופן משמעותי בנוכחות של חלבון עמילואיד כגון טאו מצטבר 44. שני הצבעים לעבוד גם באיתור צבירת טאו וp-טאו. בגלל שיא הפליטה החזק ורחב יחסית של tht (ראה איור 2), יש הפחתת% רק 30 ביחידת הקרינה ב 510 ננומטר. לנוחיותכם, אנו משתמשים באותו שילוב של אורכי גל עירור / פליטה (כלומר, 450 nm / 510 ננומטר) כדי לפקח על צבירת טאו בעת שימוש או צבע. צבירת טאו ניתן לעשות זאת בנוכחות או עדר של הצבע, בהתאם למטרה של assay ואת הזמינות של חלבון טאו. שני המצבים של תגובות מוצגים להלן. בנוסף, אנו מדגימים את פעולתם של שני מכשירים שונים - fluorometer יחיד מדגם (ISA-SPEX FluoroMax-2) וקורא רב-צלחת (SpectraMax M2). קוראים צריכים להיות מסוגלים להתאים את הפרוטוקולים הללו כדי להתאים לצרכימים הספציפיים שלהם וזמינות מכשיר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="449">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:103px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Trizma&#160;base</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1503</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">MAL-7581-06</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15576-028</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T3516</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin S</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1892</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:116px;">heparin</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">H3393</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D9779</td>
			<td style="width:103px;">Stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">96-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">3917</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">ISA SPEX FluoroMax-2</td>
			<td style="width:128px;">Horiba</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:116px;">SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td>
			<td style="width:128px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:128px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:103px;">MAB3494</td>
			<td style="width:103px;">Stored at &#8211;80&#176;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

באמצעות טאו רקומביננטי וp-טאו (איור 1), שהקמנו שני פרוטוקולים שונים כדי להשוות קינטיקה של צבירה של טאו וp-טאו, מנצל את פליטת הקרינה החזקה של tht וTHS על מחייב לamyloidal אגרגטים חלבון, טאו כולל וp-טאו (איור 2). עם או בלי צבע הניאון בתגובת הצבירה, אנו נצפו שיפור של צבירת טאו עקבי על ידי hyperphosphorylation (איורים 3-5). גירוי זה אינו תלוי בהפרין (מידע לא מוצג). בoligomerize טיפוסי תגובה, טאו וp-טאו בקצב מהיר בתוך 30 דקות הראשונות לפני ההאטה משמעותית (איורים 3 ו -5), עם p-טאו מציג יחידות הקרינה גבוהות יותר בכל מהלך הניסוי. כולל tht בתגובות הצבירה גורם פיגור משמעותי בשיעור של צבירה (איור 4). isoforms שני plat התקרבמי טואלט 160 שעות לאחר התגובות שנכתבו על. THS, לעומת זאת, אינו גורם להאטה ניכרת של צבירה (איור 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51537/51537fig1highres.jpg" /> איור 1. מטוהרי טאו טאו וhyperphosphorylated (p-טאו) שימש במחקר זה. דוגמאות נפתרו על ידי 10% ג&#39;ל SDS-PAGE, ומוכתמות על ידי Coomassie הכחול R250 (משמאל) או נחקרו על ידי נוגדנים חד שבטיים נגד טאו (מימין פנל). ליין M, סמן משקל מולקולרי; נתיבי 1 ו -3, טאו unphosphorylated; lane2 ו -4, טאו hyperphosphorylated. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51537/51537fig2highres.jpg" /> איור 2. ספקטרום פליטה לtht (30 מיקרומטר) עם או בלי מחייב אגרגטים טאו. היה של רכישת הפליטה<html> שימורים מננומטר 460 עד 600 ננומטר (ננומטר תוספת 1; אינטגרציה 0.1 שניות, 5 רוחב חריץ ננומטר), עירור ב 450 ננומטר. אגרגטים טאו התקבלו על ידי המאפשר צבירת טאו 50 מיקרומטר כדי להמשיך על 37 מעלות CO / N (ראה פרוטוקול 2 לפרטים נוספים). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51537/51537fig3highres.jpg" /> איור 3. עקומות צבירה לטאו וp-טאו בassay המסוף. צבירה של 50 מיקרומטר טאו וp-טאו הושלמו עם 30 מיקרומטר הפרין כinducer. בזמנים שונים לאחר תחילת התגובה, תגובת 100 μl הוסר ומעורבב עם נפח זהה של 60 מיקרומטר tht לפני מדידת הקרינה. הקרינה נמדדה ב 450 ננומטר עירור, 510 פליטת ננומטר. , יחידות שרירותיות &quot;au&quot;. שים לב שציר הזמן הוא בדקות. <img alt="&lt;/ Html"><html> src = /&gt; &quot;/ קבצים / ftp_upload / 51,537 / 51537fig4highres.jpg&quot; &quot;איור 4&quot; איור 4. עקומות צבירה לtht לבד, טאו וp-טאו במצב המדידה המתמיד בנוכחות tht. כל תגובה היו מורכבים מטאו 0 או 50 מיקרומטר או p-טאו, 30 מיקרומטר הפרין, ו -30 מיקרומטר tht במאגר צבירה . תגובות הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס בצלחת 96-היטב. בנקודות זמן שונות, הצלחת הוסרה מהחממה והעמיסה על צלחת הקורא לקרינת קריאה (ננומטר עירור 450, פליטה 510 ננומטר). בין קריאות, הצלחת נשמרה בחממה ללא תסיסה תחת כיסוי. הנוכחות של tht האטה באופן משמעותי את הצטברות, אבל חשוב מכך, טאו hyperphosphorylated עדיין הציג קצב מהיר יותר של צבירה מאשר מקבילו ללא שינוי. שים לב כי בקנה מידה של הזמן הוא בשעות. טען / 51,537 / 51537fig5highres.jpg &quot;/&gt; איור 5. מבחני צבירת טאו בקנה מידה קטנה בנוכחות THS. במבחנה צבירה מושרה הפרין של טאו 6 מיקרומטר וp-טאו הוערך במצב המדידה המתמשך עם thioflavin S כצבע המחוון. בנוסף לחלבון, כל תגובה הכילה 30 מיקרומטר הפרין ו -20 מיקרומטר THS במאגר צבירת HEPES (10 מ&quot;מ HEPES pH 7.5, 5 מ&quot;מ DTT, 0.1 mM EDTA). כל החומרים מלבד הפרין היו מעורבים וequilibrated ב RT. לאחר הוספת הפרין, התגובה הועברה לקובט והניחה בבעל המדגם. הקרינה נרשמה מייד כT 0, ונמשכה כשעה 2 או עד עליית הקרינה האטה כמעט לאפס. בגלל התקופה הקצרה יחסית התגובה, כל התגובה בוצעה ב RT באותו קובט. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td&gt; <td> טאו </td><td> p-טאו </td></tr><tr><td> טאו 100 מיקרומטר - 60 </td><td> 50 μl </td><td> 0 μl </td></tr><tr><td> p-טאו 100 מיקרומטר - 60 </td><td> 0 μl </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> הפרין 300 מיקרומטר </td><td> 10 μl </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> מאגר צבירה </td><td> 39 μl </td><td> 39 μl </td></tr><tr><td> 100 מ&quot;מ DTT </td><td> 1 μl </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מרכיבי תערובת הצבירה ללא-צבע, assay מסוף. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> טאו </td><td> p-טאו </td><td> לצבוע לבד </td></tr><tr><td> טאו 100 מיקרומטר - 60 </td><td> 50 μl </td><td> 0 μl </td><td> 0 μl </td></tr><tr><td> p-טאו 100 מיקרומטר - 60 </td><td> 0 μl </td><td> 50 μl </td><td&gt; 0 μl </td></tr><tr><td> הפרין 300 מיקרומטר </td><td> 20 μl </td><td> 20 μl </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ thioflavin T </td><td> 2 μl </td><td> 2 μl </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> מאגר צבירה </td><td> 126 μl </td><td> 126 μl </td><td> 176 μl </td></tr><tr><td> 100 מ&quot;מ DTT </td><td> 2 μl </td><td> 2 μl </td><td> 2 μl </td></tr></tbody></table> רכיבי 2. תערובת צבירת שולחן, assay המתמשך עם צבעים על קורא צלחת. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> טאו </td><td> p-טאו </td><td> לצבוע לבד </td></tr><tr><td> טאו 100 מיקרומטר - 60 </td><td> 5 μl </td><td> 0 μl </td><td> 0 μl </td></tr><tr><td> p-טאו 100 מיקרומטר - 60 </td><td> 0 μl </td><td> 5 μl </td><td> 01; l </td></tr><tr><td> הפרין 300 מיקרומטר </td><td> 20 μl </td><td> 20 μl </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ thioflavin S </td><td> 1.5 μl </td><td> 1.5 μl </td><td> 1.5 μl </td></tr><tr><td> מאגר צבירה </td><td> 171.5 μl </td><td> 171.5 μl </td><td> 176.5 μl </td></tr><tr><td> 100 מ&quot;מ DTT </td><td> 2 μl </td><td> 2 μl </td><td> 2 μl </td></tr></tbody></table> רכיבי 3. תערובת צבירת שולחן, assay המתמשך עם צבעים על spectrofluorometer קומפקטי.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein at JoVE.com

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

חלבוני טאו ללא שינוי וhyperphosphorylated שמשו בשני מבחני צבירה במבחנה כדי לחשוף את קינטיקה הצבירה מהירה hyperphosphorylation תלוי. מבחני אלה יסללו את הדרך למסכים בעתיד לתרכובות שיכולות להשפיע על הנטייה של טאו hyperphosphorylated כדי ליצור סיבים העומדים בבסיס ההתקדמות של מחלת אלצהיימר.

במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

18.3K Views.  Michigan State University.  חלבוני טאו ללא שינוי וhyperphosphorylated שמשו בשני מבחני צבירה במבחנה כדי לחשוף את קינטיקה הצבירה מהירה hyperphosphorylation תלוי. מבחני אלה יסללו את הדרך למסכים בעתיד לתרכובות שיכולות להשפיע על הנטייה של טאו hyperphosphorylated כדי ליצור סיבים העומדים בבסיס ה?...

Video: In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...