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ここで報告受ける RNAi 解析質量分析法および西部にしみが付くことによって線虫の老化から高い不溶性タンパク質凝集体を分離する手法を提案する.私達は、年齢依存した蛋白質の集合を防止する IIS を大幅に減らすことによってプロテオステイシスを向上させることを示します。線虫c.エレガンス ノザン特定の集計しやすいタンパク質を選択すると、さらに固有の蛋白質凝集を調節メカニズムを分析することが可能です。
疾患関連蛋白質の集合対固有の年齢依存性蛋白質の集合 この現在の仕事は蛋白質の集合ではない疾患において集約する特定の蛋白質に制限前の調査結果に基づいています。異所萌出へ表現された疾患関連蛋白質よりもむしろ内因性凝集しやすい蛋白質に焦点を当て、期待の凝集過程の生理学的な規則に新しい洞察力を提供することです。年齢依存性タンパク質凝集体は、異なる細胞場所5で発見されて、彼らの研究もありますコンパートメントへの洞察力品質管理の特定のメカニズム。全体的に、固有の蛋白質の集合を制御するメカニズムは、病気の蛋白質の集合を防ぐために関連する可能性があります。注記のうち、いくつかの側面病タンパク質凝集の年齢依存した蛋白質の集合に似ていますがまだ不明のままこれらの凝集体にアミロイド線維、多くの疾患の集合体の特性が含まれているかどうか。
選択線虫モデル: 利点と制限 寿命は非常に短い哺乳類モデルと比較して、高齢化関連の特性を研究する線虫を使用しての最大の利点の 1 つです。百いくつかのタンパク質が一貫して時効中における高度集約-しやすくなります、不溶性のこの大きい増加は簡略化された生化学的な抽出とも容易に検出できます。しかし、線虫を使用して年齢依存した蛋白質の集合を研究するための主要な制限は高齢動物の大規模な番号を分離する必要性であります。線虫 c. エレガンスの両性具有あり約 220 を生成または彼らの生殖器の中に多くの子孫相19複製を防ぐか、または人口を年齢のために子孫を除去が欠かせません。不稔を誘発するいくつかのオプションがあります: 1 つのオプションは化学フルオロデオキシウリジン (FUdR)、DNA 合成阻害剤を使用します。ただし、FUdR は多数の側効果プロテオステイシスの変更を含む、タンパク質凝集20,21,22の減少に します。重要なは、FUdR 遺伝子型固有の応答23を誘導します。別のオプションは、温度に敏感な不稔突然変異を使用することです。たとえば、 spe-9(hc88)、fer-15(b26)、 fem-1(hc17)、 glp-1(e2141)、およびgon-2(q388)従来使用されてきた年齢依存集約プロテオームの5、質量分析 8。
しかし、これらの突然変異体を使用してに関連付けられているいくつかの制限があります。まず、不妊は、温度依存性は、25 ° C は、軽度のストレスを構成し、蛋白質の集合と同様に高齢化の加速で動物を成長させるためです。逆に、我々 が観察した野生型 25 ° C (データは示されていない) で維持されるときと比較してゴン 2 glp-1および有限要素法 1の変異体は長寿命。第二に、生殖欠陥の各種類に関連付けられている特定の制限があります。精子欠損変異体を用いた 1 つの欠点は、(高齢野生型両性具有でも生産) 未受精卵子の生産です。これらの卵子の質は年齢とともに大きく低下し、生殖腺24,25内に蓄積します。定量的質量分析は、精子欠損株である生殖腺か生殖細胞欠損変異体と比較して年齢と共に蓄積不溶性タンパク質のいくつかの倍高いレベルを示します。これはタンパクを示しますを集約、生殖腺に5、前に一致してある研究12,13 ・体内異常卵母細胞にある暴露の集約されたタンパク質を実験クラスター5。したがって、生殖腺における過剰な蛋白質の集合は体細胞組織の蛋白質の集合のより微妙な変化をマスクします。これは、生殖器と体細胞組織プロテオステイシスの範囲が異なるために行動介入を比較するときにも考慮必要があります。したがって、体細胞蛋白質の集合だけを評価するために我々 は、生殖腺のないゴン 2変異体を用いた支持します。代替生殖細胞欠損glp 1突然変異体を使用すること。ただし、これらの動物がゴン 2突然変異体5加齢とともに少ない固有の蛋白質の集合をあります。これは生殖欠陥生殖巣26,27,28からシグナル伝達による体細胞組織の改善されたプロテオステイシスの結果である可能性が高い。別の方法としては、野生型の動物を使用し、沈降によって毎日の子孫を削除します。しかし、これは完全にすべての子孫を削除することの難しさによる問題です。
線虫を使用してのもう一つの一般的な制限は、特定の組織の抽出を困難になりますその小さなサイズです。このような全体の動物の抽出はどのように異なる条件に関連する情報を指定しないため、特定のティッシュの蛋白質の集合を調節します。注記のうち、この問題はc. の elegans29から特定のセルを隔離する蛍光活性化セルの並べ替えに基づいて最近開発されたメソッドを使用して可能性があります回避できます。それはまだこのメソッドは不溶性蛋白質の抽出のための十分な材料を得るに適しているだろうし、動物を高齢者に適用になるかどうかどうか決定します。また、組織特定蛋白質の集合とその制御は追加生体内で実験によって調べることができます。トランスジェニック動物として好みの蛍光標識した集計しやすい蛋白質を表現することができます急速に生成される、動物、透明、比較的簡単にタンパク質凝集原位置を調べる。
全体的にみて、野生型バック グラウンドで生体内で実験結果をプロテオームを従うことが不可欠です。生化学的および顕微鏡ベースの特性の組み合わせにより、蛋白質の集合の包括的な研究、および興味のある遺伝子の役割の評価。後者によって餌と全ゲノム RNAi ライブラリの可用性を介した RNAi線虫で促進されます。さらに、多数特徴付けられる突然変異体の存在 RNAi によって得られた結果を確認したり、RNAi の代わりに使用します。
液体培養・生化学的抽出: 利点と制限 蛋白質の高度集約は総蛋白質の小さい一部分だけ構成する、多数の動物を抽出を開始する必要です。不溶性タンパク質の大規模な量は、質量分析のためのサンプルの複雑さを軽減し、低い豊富なタンパク質の同定を向上させる広範なペプチド分画を実行することは不可能ですし。不溶性タンパク質の少量が必要な場合にのみ代替プレート ワームの成長し、セラミック ビーズとそれらを均質化することです。液体培養の欠点の一つは、汚染の場合全体の文化が影響を受けるし、破棄する必要があります。一般に、線虫の老化は温度による影響を強く、年齢依存した蛋白質の集合の変動を避けるために液体文化でこのパラメーターが厳密に管理する必要があります。温度制御もgon-2(-)変異体を用いたときに生殖腺のない動物の同種の人口を取得する重要です。
研究の目標に応じて、異なる抽出方法を検討することが重要です。ここで紹介する生化学的抽出当初、疾患関連集計11,30,31を分離するプロトコルから適応されました。比較的高濃度の洗剤より不溶性凝集体を分離する 0.5 %sds などを選びました。また低遠心速度 0.5 %sds 不溶性凝集体をペレット化、によりこのプロトコルより大きな凝集体をのみ分離でしょう。また、以下の厳しいプロトコル最近公開された10であった。本研究では、SDS を省略することで、500,000 × g で遠心力の非常に高速を使用してもより可溶性と小さい凝集体を抽出しました。異なるプロトコルの比較は、以下の厳しいプロトコル7を使用して集約プロテオーム タンパク質の数の一般的な増加を示しています。我々 は効率的に信号低下daf 2寿命の長い動物が SDS 溶解性と生殖腺のない動物7で SDS 不溶性凝集体の蓄積を防ぐ注意してください。
生体内で年齢依存性蛋白質の集合の解析 次の年齢依存した蛋白質の集合のトランスジェニック モデルの構築、ノザン関心の集計しやすいタンパク質の発現レベルをどの組織に考慮する関連です。体内老化腸で顕著である、蛍光との干渉を避けるために頭部にある表現を重視します。低倍率での集計の蛍光標識を可視化、集約しやすいタンパク質を比較的高いレベルで表現されるべき。一方、高すぎる表現は若い動物で既に集計しやすいタンパク質集合体を形成するを発生します。
一緒に取られて、これらのメソッドは、プロテオームの一部がなぜ年齢とともに集計を理解し、最終的に健康な老化の促進戦略の開発につながる私たちを助けます。

タンパクは、広告、PD、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、前頭側頭型認知症 (FTD)、および他の多くなどのいくつかの神経変性疾患の認刻極印として認識されます。例えば、運動ニューロンの変性の細胞質集合体を形成する ALS 患者 TDP 43 または FUS ミスフォールドタンパク中の PD 患者の黒質に特にレビー小体として蓄積するアミロイド線維に α シヌクレイン アセンブリ。それぞれのこれらの神経変性疾患、プロテオスタシス蛋白質の恒常性を維持するメカニズムが病気につながるそのため、誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積を防ぐために失敗しました。
通常の条件の下でこれらの調節機構を厳密に制御タンパク質合成、折りたたみ、分解の率および細胞機能を確保するためプロテオステイシスが欠かせません。いくつかの研究は、高齢化、蛋白質の恒常性を維持するために多くの細胞や臓器の機能が徐々 に低下、年齢とプロテオステイシス ネットワークの生理的な老朽化はの重要な悪化要因を示す神経変性疾患 (参照1,2,3で確認)。タンパク質の品質管理と小胞体ストレス ストレスに対する細胞の反応が年齢に侵害されているという事実は、タンパクが老化の一般的な結果であることを示唆しています。確かに、我々 と他の示されている蛋白質の集合は病に制限されない、その代り、プロテオームの一部なる高い洗剤-不溶性高齢動物4,5,6,7 ,8,9,10。計算とin vivoの解析では、これらの生理学的な年齢関連の集計がいくつかの側面5疾患集計を似ているを明らかにしました。内因性、年齢依存した蛋白質の集合の発見は私たちに異所萌出へ表現されたひと疾患関連蛋白質を使用せずタンパク質凝集を調節する分子・細胞メカニズムを解剖する機会を与えます。現時点では、限られた情報のみが存在するは、広範なタンパク質の不溶の規制とこの破綻の生物の健康への影響について。
線虫C. elegansは、老化研究のこれらの動物は比較的短い寿命を持っているし、高い生物にみられる多くの特徴的な高齢化機能を表示、もっとも広範囲に研究のモデル生物の一つです。不溶性タンパク質の加齢の影響線虫病神経変性研究11 のフィールドに集計を抽出するために用いられている微分の溶解度に基づく逐次生化学分画によって研究されています。.定量的質量分析によるいくつかの百のタンパク質は、集計しやすい線虫病5の不在になること示されていた。ここで我々 は液体文化と西部のしみによって質量分析法と解析法による定量化のための集約された蛋白質を分離する逐次抽出にワームの大規模な番号を成長するプロトコルの詳細に説明します。高齢者の変性、集計しやすいタンパク質蓄積されていくので他の体細胞組織5,12,13 c. の elegans生殖腺およびマスク変更蛋白質の分析の焦点に生殖腺のない突然変異体を用いて非生殖ティッシュに不溶。提示方法 0.5 %sds で不溶性と比較的低い遠心速度によって小球形にされた高い不溶性、大きい総計の解析が可能。 にします。またより小さくとより可溶性凝集体を収集するほど厳しくない抽出プロトコルとなっていますまた、10を他の所で出版しました。さらに、凝集体内線虫の評価に使用する方法をについて説明します。
全体的にみて、RNA 干渉 (RNAi) との組み合わせで、これらのメソッドは、年齢依存した蛋白質の集合を調節することの興味の遺伝子の役割を評価できます。この RNAi を使用して興味の特定の蛋白質のノックダウンと若齢および老齢のワームからの抽出物の分析について述べる。これらのメソッドは、プロテオステイシス ネットワークのコンポーネント調整不溶性タンパク質を決定するための強力なツールをする必要があります。いくつかの介入など減少インスリン/インスリン様成長因子 (IGF) 1 シグナル (IIS)線虫の加齢14を劇的に遅らせることが示されています。長寿経路はしばしばタンパク質品質管理機構を誘導し、こうしてこれらの経路が積極的に影響を与えられます蛋白質の集合の率。たとえば、IIS 経路7の阻害に寿命の長い動物で減らされた内在タンパク質凝集を示す.

<table style="border-collapse:collapse;width:635pt" width="847">
	<colgroup>
		<col style="width:161pt" width="215" />
		<col style="width:92pt" width="122" />
		<col style="width:258pt" width="344" />
		<col style="width:125pt" width="166" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Fernbach culture flask&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Corning</td>
			<td class="xl19" style="width:258pt" width="344">4425-2XL</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Membrane Screw Cap&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Schott</td>
			<td class="xl19">1088655</td>
			<td class="xl17">GL45</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Nutating Mixer</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">VWR</td>
			<td class="xl19">444-0148</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Separatory funnel</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Nalgene</td>
			<td class="xl19">4300-1000</td>
			<td class="xl17">Capacity 1,000 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">1 ml syringe&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">BD Plastipak</td>
			<td class="xl19">300013</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Gray needle, 27 G x &#189; &#34;, 0.4 mm x 13 mm</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">BD Microlance 3</td>
			<td class="xl19">300635</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Membrane filters 0.025 &#181;M</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Millipore</td>
			<td class="xl19">VSWP04700</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">pH strip</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Machery-Nagel</td>
			<td class="xl19">92110</td>
			<td class="xl17">pH-Fix 0-14</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Roche</td>
			<td class="xl19">4693132001</td>
			<td class="xl16" style="width:125pt" width="166">Complete Mini EDTA-free tablets&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Octoxynol-9&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Applichem</td>
			<td class="xl19">A1388</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">M1317</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Nonylphenylpolyethylenglycol</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Applichem</td>
			<td class="xl19">A1694</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Nonidet P40 (NP40)</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">DNaseI</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Roche</td>
			<td class="xl19">04716728001</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">recombinant, RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">RNaseA</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Promega</td>
			<td class="xl19">A7973</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">solution</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Total protein blot staining</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermofisher</td>
			<td class="xl19">S11791</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Sypro Ruby protein blot stain</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Total protein gel staining</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermofisher</td>
			<td class="xl19">S12001</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Sypro Ruby protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Serva</td>
			<td class="xl19">36970</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Iodoacetamide</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Serva</td>
			<td class="xl19">26710</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Ammoniumbicarbonate</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">09830</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Promega</td>
			<td class="xl25" style="width:258pt" width="344">V5111</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Isobaric tags for relative and absolute quantitation</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sciex</td>
			<td class="xl19">4352135</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">iTRAQ Reagents Multiplex Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge Avanti J-26XP</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Beckmann Coulter</td>
			<td class="xl19">393126</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Ultracentrifuge Optima Max-XP</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Beckmann Coulter</td>
			<td class="xl19">393315</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge 5424R</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5404000413</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge 5702</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5702000329</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge Megafuge 40R</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75004518</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Concentrator Plus</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5305000304</td>
			<td class="xl17">Centrifugal evaporator</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Fluorescent stereo-microscope M165 FC&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Leica</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">With Planapo 2.0x objective</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Dissection microscope</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Leica&#160;</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17">Leica S6E</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="80" rowspan="2" style="width:161pt;height:60.0pt" width="215">High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td class="xl18" height="80" rowspan="2" style="width:92pt;height:60.0pt" width="122">Zeiss</td>
			<td class="xl19" height="80" rowspan="2" style="width:258pt;height:60.0pt" width="344"></td>
			<td class="xl16" height="80" rowspan="2" style="width:125pt;height:60.0pt" width="166">With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">Software</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl32"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Image analysis software</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">ImageJ</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Analysis of mass spectrometry data</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Protein Prospector</td>
			<td class="xl136" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl137">http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">E.coli strain</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">OP50</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">CGC</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">RNAi bacteria</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">L4440</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Julie Ahringer RNAi library</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">C. elegans mutants</td>
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122"></td>
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl17" height="42" style="height:31.5pt">CF2253</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">CGC, strain name: EJ1158&#160;</td>
			<td class="xl40" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl17">Genotype: gon-2(q388)</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">C. elegans transgenics</td>
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122"></td>
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">DCD214</td>
			<td class="xl25" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122">Della David&#39;s lab at DZNE T&#252;bingen</td>
			<td class="xl40" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl68" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166">Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">DCD215</td>
			<td class="xl87" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122">Della David&#39;s lab at DZNE T&#252;bingen</td>
			<td class="xl40" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl68" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166">Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study changes in inherent protein aggregation with age in caenorhabditis elegans

最後の十年では、神経変性疾患、アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) などの有病率は成長しています。これらの加齢に伴う疾患はこれらの患者の頭脳の線維性構造タンパク質凝集体の出現によって特徴付けられます。通常水溶性タンパク質を受けるまさに、集計プロセスは不十分な理解のままになります。蛋白質の集合は病気プロセスに限定されない代わりに、正常な老化プロセスの一部により異所萌出へを使用せずタンパク質凝集を調節する分子・細胞メカニズムの研究発見表現人間疾患関連タンパク質。ここで相補的なアプローチを通じてカエノラブディティス ・ エレガンスにおける固有の蛋白質凝集を調べるための方法論について述べる。まず、高齢の動物を取得する時代同期のc. の elegansの大量に成長する方法について説明、提案する高い不溶性-大きな凝集体を分離する生化学的なプロシージャ。ターゲット遺伝子ノックダウンと組み合わせて、促進またはいずれか包括的な分析を用いた定量的質量分析法によって年齢依存した蛋白質の集合を防ぐことの興味の遺伝子の役割を分析することが可能だか、抗体の候補者ベースの分析。これらの調査結果、集計しやすい蛋白質の蛍光タグを表現するトランスジェニック動物を体内分析によるに確認します。これらのメソッドは、ある特定の蛋白質が加齢とともに集計と最終的にどのようにこれらの蛋白質を完全に機能しやすい理由を明確に役立つはずです。

どのように長寿命の動物を評価するここに示される方法を用いて削減 IIS は年齢依存した蛋白質の集合を調節します。西部のしみの (参照手順 2.2 簡易西部のしみの分析のための不溶性蛋白質の抽出)、我々 は合計とヤング (成人の日 3) の不溶性のタンパク質含有量を分析し、(成人の日 18) ワーム コントロール RNAi と RNAi ターゲットにインスリンを高齢者/ような IGF-1 受容体daf 2。認められなかった時代またはコントロールとdaf 2間の全体蛋白質のレベルに大きな変化 RNAi 条件 (図 2A)。予想通り、対照動物 (図 2B) の高い不溶性蛋白質のレベルで強力な加齢に伴う増加を検出した.Daf 2 RNAi に寿命の長い動物に比較して、集約傾向は大きく減った。全体蛋白質の不溶解性の抽出物の汚損daf 2 RNAi 年齢をマッチさせたコントロールと比較して 18 日古いワームからの抽出物でより複雑な蛋白質バンド パターンを明らかにしました。定量的質量分析を実証、減らされた IIS と長寿命の動物以下の全体のタンパク質の加齢に伴う集計および重要なは、 daf ‐ 2阻害活性は完全の年齢依存した不溶性を廃止、タンパク質7の特定のサブセット。これらの調査結果のフォロー アップには、これらの集約しやすい蛋白質、PAB 1 の 1 つに焦点を当てた。PAB 1 は予測される「プリオンのような"ドメインと RNA 結合タンパク質です。抗体の汚損を確認した長寿命の動物は年齢 (図 2C) と可溶性 PAB 1 を維持します。
PAB 1 凝集体内分析、咽頭筋の tagRFP::PAB 1 を表現するトランスジェニック動物を制作しました。若い動物 tagRFP::PAB 1 だった主にびまん性咽頭 (図 3Aの「低」の集約レベル) に各地が年齢とともに後部咽頭電球 (で始まる明るい点の漸進的な蓄積を観察図 3は、「中間」集約レベル)。高齢化の中にも動物数の増加で前方咽頭電球 (図 3Aの「高」の集約レベル) で集計を観察しました。これらさまざまなカテゴリにグループ化の動物によって人口で PAB 1 集約率を獲得しました。成人期の 2 日目でワーム (88%) のほとんどがなしまたは非常に少数の涙点と高い集約レベルを持つ動物は検出されませんでした。すでに 5 日目、中間を示した人口の 16% 高い集約レベルは、ワームの 70% 以上の 7 日間で 19% は、中間および高い集約レベルを発表しました。TagRFP:PAB の年齢依存性凝集長寿の効果を分析する-1、 daf 2突然変異と遺伝子組換え tagRFP::PAB 1 ワームを生成しました。これらの動物を示した大幅に削減 tagRFP:PAB-7 (図 3B) の日も出展中高集約レベルの人口の 15% 未満で、加齢に伴う 1 涙点形成。
ここで説明されているさまざまなアプローチを使用して、減らされた IIS 異なるエクステントに年齢依存した蛋白質の集合を防ぐ、長寿命の動物特に PAB 17のダイナミクスを復元する際の効率的なを明らかにします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig1.jpg"> 図 1: 年令固有の蛋白質凝集の変化を勉強するワークフローの図線虫 。主な手順は太字です。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig2.jpg"> 図 2: 不溶性タンパク質が減少daf 2シグナルを持つ動物ではなくコントロール動物で年齢とともに増加します。(A) 総蛋白は 3 日目から一日 18 gon-2(-)変異体コントロールとdaf 2 (25 ° C で栽培) RNAi を受ける総分数の染色。(B) 総蛋白質は SDS 不溶性画分 3 日目とコントロールとdaf 2 (25 ° C で栽培) RNAi を受ける日 18 gon-2(-)変異体の染色。パネル参照7から再刊されました。(C) イムノブロットの赤い矢印で示した関連タンパク質のバンド SDS 不溶性画分に PAB 1 を検出します。パネル参照7から再刊されました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56464/56464fig3.jpg"> 図 3:年齢と tagRFP::PAB 1 点の蓄積を防ぐことができます減少daf 2シグナリングします。(A) 咽頭筋における tagRFP::PAB 1 発現のワームの代表的な写真 (高倍率顕微鏡、tagRFP 検出の設定: 励起 558 nm、発光 583 nm)。動物の低 (後部咽頭球 0 10 tagRFP::PAB 1 点)、中間 (後部咽頭球以上 10 点)、または高い集約レベル (前方咽頭球以上 10 点) が表示されます。スケール バー = 20 μ m。 別 tagRFP::PAB 1 凝集の定量化を (B) は野生型の年齢とレベルとdaf 2変異の背景を明らかに寿命の長い動物で年齢とともに強く遅延 tagRFP::PAB 1 集計。2 日目、5 日目と 7 日目daf-2(-)野生型背景対低中高の集約レベルと比較して: フィッシャーの正確確率検定 * * *p < 0.0001。パネル参照7から再刊されました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56464/56464fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>原液</td>
			<td>量</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>コメント/説明</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">液体培養、容量 300 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>S (500 mL: 5.9 g 塩化ナトリウム、50 mL 1 M カリウム リン酸塩 pH 6) の基底</td>
			<td>200 mL</td>
			<td></td>
			<td>1 M カリウム リン酸塩 pH 6: 1 l: 129 の g KH2PO4塩基性、52 g K2HPO4塩基無水</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M カリウム クエン酸 pH 6 (400 mL: 13.1 g クエン酸一水和物、134.4 g トライ カリウム クエン酸一水和物)</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>微量金属ソリューション (の 1 l: 1.86 g エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、0.69 g FeSO4 · 7 H2O、0.2 g MnCl2 · 4 H2O、0.29 g ZnSO4 · 7 H2O、0.025 g CuSO4 · 5 H2O)</td>
			<td>3 mL</td>
			<td></td>
			<td>4 ° C で暗闇の中で原液を保存します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4 (500 mL: 123.3 g)</td>
			<td>900 Μ L</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M CaCl2 (500 mL: 73.5 g)</td>
			<td>900 Μ L</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>200 μ g/mL カルベンダジム (50 mL: 10 mg にメタノール)</td>
			<td>150 Μ L</td>
			<td>100 ng/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(エタノール 100 mL: 0.5 g) 用 5 mg/mL コレステロール</td>
			<td>300 Μ L</td>
			<td>5 μ g/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">再構築 (RAB) 高塩抽出バッファー、30 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M 4 Morpholineethanesulfonic 酸 (MES)</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>ラブ在庫バッファー コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 M Ethyleneglycoltetraacetic 酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)</td>
			<td>60 Μ L</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>ラブ在庫バッファー コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td>
			<td>6 Μ L</td>
			<td>0.1 mM</td>
			<td>ラブ在庫バッファー コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>15 Μ L</td>
			<td>0.5 mM</td>
			<td>ラブ在庫バッファー コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M の NaCl</td>
			<td>4.5 mL</td>
			<td>750 mM</td>
			<td>ラブ在庫バッファー コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M フッ化ナトリウム (NaF)</td>
			<td>600 Μ L</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>ラブ在庫バッファー コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30 mL ddH2O で合計を完了します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロテアーゼ阻害剤カクテル × 50</td>
			<td>*</td>
			<td>2 x</td>
			<td rowspan="4">* ラブ在庫バッファーの量を撮影が必要な後に試薬を追加 (質量分析法のための抽出 6 mL)。</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mM イソプロパノール、-20 ° C の特異純度 (PMSF)</td>
			<td>*</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 U/μ L DNaseI</td>
			<td>*</td>
			<td>200 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mg/mL RNaseA</td>
			<td>*</td>
			<td>100 μ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">1 M ショ糖、30 mL とラブ</td>
		</tr>
<tr>
<td>(50 mL: 34.2 g) の 2 M ショ糖</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>1 M</td>
			<td>DNaseI RNaseA ほかラブ バッファー試薬を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファー、30 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) pH 8</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>RIPA バッファー在庫コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M の NaCl</td>
			<td>0.9 mL</td>
			<td>150 mM</td>
			<td>RIPA バッファー在庫コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 M の EDTA</td>
			<td>0.3 mL</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>RIPA バッファー在庫コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>RIPA バッファー在庫コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% デオキシ コール酸ナトリウム (SDO)</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>RIPA バッファー在庫コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40)</td>
			<td>0.3 mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>RIPA バッファー在庫コンポーネント</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30 mL ddH2O で合計を完了します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mM PMSF</td>
			<td>*</td>
			<td>1 mM</td>
			<td rowspan="2">* RIPA 在庫バッファーの量を撮影が必要な後に試薬を追加 (質量分析法のための抽出 10 mL)。</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロテアーゼ阻害剤カクテル × 50</td>
			<td>*</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">尿素/SDS バッファー、10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>尿素</td>
			<td>4.8 g</td>
			<td>8 M</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ジチオトレイトール (DTT)</td>
			<td>77 mg</td>
			<td>50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M トリス pH 8</td>
			<td>0.5 mL</td>
			<td>50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mL ddH2O で合計を完了します。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">透析バッファー、1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリス</td>
			<td>6 g</td>
			<td>50 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DTT</td>
			<td>154 mg</td>
			<td>1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mM PMSF</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>0.1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PH 7.5、ddH2O で合計 1 L に完全に調整します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 液体文化・不溶性タンパク質の抽出・透析用バッファー。

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Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

ここで紹介した方法の目的は、線虫モデル有機体の正常な老化中タンパク質凝集を探索することです。プロトコルは、年齢を形成する非常に不溶解性の大きな凝集体を研究し、プロテオステイシスの変化により蛋白質の集合がどのような影響を与えるかを決定するための強力なツールを表します。

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

8.4K ビュー.  German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE). ここで紹介した方法の目的は、線虫モデル有機体の正常な老化中タンパク質凝集を探索することです。プロトコルは、年齢を形成する非常に不溶解性の大きな凝集体を研究し、プロテオステイシスの変化により蛋白質の集合がどのような影響を与えるかを決定するための強力なツールを表します。

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Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

生物学

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

の栽培<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;ラボにおける三次元で

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

結合されたヌクレオチドおよび線虫のタンパク質抽出

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

カエノハブディティス・エレガンスにおける組織特異的プロテオスタティック低下の定量化

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...