עבודה זו נתמכה על ידי ניו החוקר גרנט [2014R1A1A1005553] מן קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) כדי ג&#39;יל; ומענק אתגר העתיד אוניברסיטת Yonsei המנהיג [2015-22-0133] כדי ג&#39;יל

1. הכינו פתרונות עבור NGT-3D ו NGB-3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות סטרילי הבאים: 1 ליטר של 0.1454 פתרון M NaCl, 1 ליטר של 1 M CaCl 2, 1 ליטר של 1 M MgSO 4, מרק Lysogeny (LB), 1 ליטר של 1 M KPO 4 חיץ (108.3 גרם של KH 2 4 PO ו 35.6 גרם של K 2 HPO 4, ולמלא H 2 O ל L 1). הפקה של NGM באמצעות פתרונות אלה ניתן למצוא בפרוטוקול קודם 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות חיטוי ב 121 ° C, 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של פתרון 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כולסטרול סטרילי. בתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל, לערבב 0.25 גרם של כולסטרול ו -50 מ&quot;ל של אתנול 99.99% ומערבבים היטב. אל חיטוי. לעקר את הפתרון כולסטרול באמצעות מזרק 50 מ&quot;ל עם מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. זה יהיה גם להסיר כל כולסטרול שלא נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) הכן 10 מ&quot;ל של 150 מ&quot;מ של 2&#39;-deoxy-5-fluorouridine המניות (FUDR). בתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל, לערבב 0.3693 גרםשל FUDR ו -10 מ&quot;ל מים מזוקקים. נער היטב. </li></ol> 2. כן תרבות חיידקים עבור NGT-3D ו NGB-3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 מ&quot;ל מרק LB עם חיידקים. החיידקים הסטנדרטיים המשמשים עבור אלגנס האכלה הוא OP50 זן החיידק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות חיסון החיידקים על 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת דילול סדרתי, aliquot 9 מ&quot;ל של פתרון NaCl לתוך צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל סטרילי. לדוגמה, aliquot 9 מ&quot;ל לתוך סך של 7 צינורות לבצע דילול 10 -7 של E. coli זן OP50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 1,000 μl סטרילי, pipet 1 מ&quot;ל של תרבית החיידקים או התרבות חיידקים בדילול לתוך הצינור החדש סטרילי עם 9 מ&quot;ל של תמיסת NaCl ו מערבולת את התערובת 10 מ&quot;ל היטב. חזור על הפעולה עד דילול חיידקי הרצוי הוא הגיע. ההערה: דילול החיידקים הרצוי תלוי בסוג והמצב של חיידקים, כמו גם את תנאי ניסוי המדויקים.לדוגמה, 10 -6 - 10 -8 דילול של זן OP50 E. coli היה מספיק כדי להפיק מן 1 - 200 מושבות חיידקים לכל 6.5 מ&quot;ל צינור NGT-3D. תולעים שפותחו באופן מהימן ומתרבים בדרך כלל כאשר מספר מושבות היה מעל גיל 60, שאירע בשעת דילול של 10 -6 - 10 -7. לקבלת NGB-3D, השתמש דילול של 10 -8. </li></ol> 3. ביצוע NGT-3D ו NGB-3D (200 מ&quot;ל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנת תרבית החיידקים, לערבב 0.6 גרם NaCl, 1 גרם אגר מגורען, ו -0.5 גרם peptone בבקבוק 500 מ&quot;ל. הכנס בר ומערבבים מגנטיים לתוך הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 195 מ&quot;ל מים מזוקקים לכסות את הפה של הבקבוק עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C חיטוי 121 מעלות במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבקבוק autoclaved חם על צלחת ומערבבים, ומערבבים במהירות בינונית במשך שעה לפחות 2. מצננים את הבקבוק עד 40 ° C. הקפד לקרר מספיק כממשיך מכאן בטמפרטורות גבוהות עלול להוביל ערפול של אגר המוגמר.עם זאת, בטמפרטורות נמוכות עלולות לגרום התקשות המוקדמת של אגר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) כדי להאיץ את תהליך הקירור, הנח את הבקבוק בתוך 15 דקות באמבט מים 40 ° C לפני הצבת בצלחת ומערבבים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הטמפרטורה של התקשורת אגר מגיע 40 ° C, להוסיף 200 μl 1 M CaCl 2, 200 μl של 5 מ&quot;ג / פתרון כולסטרול מ&quot;ל, 200 μl 1 M MgSO 4 ו -5 מ&quot;ל 1 M KPO 4 חיץ כפתרון ממשיכה לעורר לריכוזים סופי של 1 2 מ&quot;מ CaCl, 5 כולסטרול מיקרוגרם / מ&quot;ל, 1 מ&quot;מ 4 MgSO, 1 מ&quot;מ KPO 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) עבור assay תוחלת החיים NGT-3D להוסיף 80 μl של 150 מ&quot;מ FUDR לריכוז סופי של 120 מיקרומטר 12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מ&quot;ל של 10 מ&quot;ל מדולל תרבית החיידקים משלב 2.4 לתוך הבקבוק ישירות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) עבור NGT-3D, להסיר 6 מ&quot;ל של התקשורת אגר לפני שלב 3.6 ו לשמור אותו חם בנפרד. מדיה זה ישמש את החיידקים ללאשכבה עליונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת הליכים סטרילי, לוותר התקשורת לתוך תא תרבות סטרילי. ודא שהמכסה של החדר נסגרת בחוזקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) כדי למנוע מושבות חיידקים מ טביעה על פני השטח העליונים של אגר, ליצור שכבה של תקשורת אגרה חיידקים ללא משלב 3.6.1 בחלק העליון בפני התקשורת משלב 3.7 מתקשה לחלוטין. פעולה זו תיצור אזור חיידקים ללא בחלק העליון של NGT-3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת NGT-3D, יוצקים 6.5 מ&quot;ל התקשורת לתוך מבחנות פלסטיק 8 מ&quot;ל ברור ליצור שכבה אגר חיידקים, ובזהירות לוותר 200 μl של התקשורת חיידקים חינם על גבי מדיה 3D קשוח למחצה לעשות bacteria- דק שכבה חינם על העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת NGB-3D, יוצקים 65 מ&quot;ל של המדיה לתוך בקבוק תרבית תאים 25 ס&quot;מ 2 פלסטיק שקוף. סכום זה צריך למלא את הגוף של בקבוק תרבות 25 ס&quot;מ 2 תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר תאים אנכיים בטמפרטורת חדר למשך שבוע כדי לאפשר מושבות חיידקים לגדוללגודל ניכר מ&quot;מ קוטר 1 לפחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) עבור assay תוחלת החיים ב NGT-3D, תאי מכסים ברדיד אלומיניום כדי למנוע השפלה לאור FUDR. </li></ol></li></ol> 4. כושר מדוד אוכלוסין תולעת על NGT-3D (Assay גודל יחסית Brood) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תולעת L4 לבמה בעזרת חוט פלטינה לקטוף העברה בצלחת NGM חיידקים חינם. אפשר תולעת לנוע בחופשיות במשך כמה דקות כדי להסיר חיידקים מחוברים לגוף שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.1 וודא כי התולעת היא ללא חיידקים. באופן כללי, ולשני שידורים חוזרים של 4.1 הם מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום התולעת הנקיה על פני השטח של תקשורת 3D במכוש חוט פלטינה. התולעת צריכה בסופו של דבר להיכנס אגר לתוך המטריצה ​​אגר 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המכסה רופף המאפשר אוויר כלשהו להגיע לתוך הצינור, אבל מניעת ההתייבשות של התקשורת אגרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 96 שעות ב 20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 ימים, לסגור את העפעפיים בחוזקה והמקוםNGT-3D תא תרבות לתוך אמבט מים 88 ° C כדי להמיס את אגר. החום הורג תולעים אך גופם נותרו על כנן. הערה: שימוש 8 מ&quot;ל צינורות עבור NGT-3D, 20 - 30 הדגירה דקות בדרך כלל מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר את התקשורת מומסת על צלחת פטרי פלסטיק 9 ס&quot;מ. טפטפות פלסטיק לא מומלצות, כמו תולעים לעתים קרובות יכולים להידבק אליהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו שידור, לספור את מספר תולעים בבית L3, L4, ושלבי מבוגר. אל תסמכו תולעים כי הם בשלב L2 וצעיר, במרוצת הדורות F1 ו- F2 יכול להתבלבל כאן. לפיכך, assay זה הוא assay גודל להרהר ביחס ולא assay גודל גוזל הכולל. </li></ol> תמונה 5. והתנהגות תולעת שיא על NGB-3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תולעת L4 לבמה בעזרת חוט פלטינה לאסוף ולהסיר כל חיידקים תקועים אל פני השטח על ידי העברה לצלחת חיידקים ללא NGM ומאפשר לו לנוע בחופשיות במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.1 לוודא ווrm הוא ללא חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום התולעת הנקיה על גבי במרכז השטח אגר של NGB-3D ליד הצוואר של הבקבוק במכוש חוט פלטינה. התולעת צריכה בסופו של דבר להיכנס אגר לתוך המטריצה ​​אגר 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המכסה רופף המאפשר אוויר כלשהו להגיע לתוך הצינור, תוך מניעת ההתייבשות של התקשורת אגרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה או להקליט את התולעת תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו שידור. התאם את המיקוד כתולעת עוברת דרך מטריקס 3D. </li></ol>

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Consortium, C. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+natural+odor+attraction+between+lactic+acid+bacteria+and+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans.</a> ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).</li><li>Gaertner, B. E., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+molecular+quantitative+genetics+and+the+systems+biology+of+natural+variation.">Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation.</a> Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).</li><li>Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+evolution+in+the+wild.">Caenorhabditis evolution in the wild.</a> Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Felix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans.">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).</li><li>Barriere, A., Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+local+genetic+diversity+and+low+outcrossing+rate+in+Caenorhabditis+elegans+natural+populations.">High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations.</a> Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).</li><li>Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGT-3D:+a+simple+nematode+cultivation+system+to+study+Caenorhabditis+elegans+biology+in+3D.">NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D.</a> Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).</li><li>Lewis, J. A., Flemming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Culture+Methods.">Basic Culture Methods.</a> Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 4-27 (1995).</li><li>Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Violacein:+Properties+and+Production+of+a+Versatile+Bacterial+Pigment.">Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment.</a> Biomed Res Int. , 465056 (2015).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+worm+tracker+for+freely+moving+C.+elegans.">3-D worm tracker for freely moving C. elegans.</a> PLoS One. 8 (2), e57484 (2013).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).</li><li>Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+C.+elegans+behavioral+genetics+in+3-D+environments.">Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments.</a> Sci Rep. 5, 9564 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

טיפוח המעבדה של C. elegans באמצעות צלחות תקשורת צמיחת נמטודות הקלסיות היה חיוני למאות תגליות חשובות כי המחקר ב C. elegans ספקה. כאן, אנו מציגים שיטות חדשות לטפח סי אלגנס בסביבה בצורה מדויקת יותר משקפת גידול תלת מימדי הטבעי שלהם. למרות שיטות אחרות שימשו להתבונן אלגנס ב 3D 13, זהו הפרוטוקול הראשון המאפשר טיפוח תולעים במטריצה 3D מוצק. שתי השיטות שמוצגות כאן, NGT-3D ו NGB-3D, לאפשר למדענים לשאול שאלות של כושר, התפתחות וצמיחה בטיפוח 3D, וגם תמונה ולהקליט את התולעים 3D. למרות NGT-3D ו NGB-3D יש כמה הבדלים על צלחות NGM 2D הרגילות, הם דומים שיטה מקורית זו ומותאם רק להוסיף טיפוח תולעת ציר z. לפיכך, אנו מוצאים כי פיתוח, פוריות תוחלת חיים להמשיך בדרך כלל בתנאים שלנו. ההמטרה היתה ליצור פרוטוקול שכל מעבדה יכול להעסיק למחקריהם. שיטות אלה פשוט מאוד, לשחזור בקלות ובעלות נמוכה מאוד, מאפשרות התאמה של פרוטוקולים כדי להתאים את הניסויים הספציפיים של המשתמשים. למרות כל הצעדים בפרוטוקול חשובים, הצעד הקריטי בהפיכת NGT-3D ו NGB-3D היא טמפרטורת הקירור של אגר לאחר מעוקר ב צעדי 3.4 כדי 3.6 בפרוטוקול. אם הטמפרטורה מתקררת נמוכות מדי (כמה מעלות מתחת ל -40 מעלות צלזיוס), אגר יתחיל להקשיח ואת הפתרונים הוסיפו לא יהיו לערבב היטב לתוך אגר. עם זאת, אם הקירור אינו מספיקות (כמה מעלות מעל 40 מעלות צלזיוס), החיידקים הוסיפו עלולות למות ופתרון הכולסטרול הוסיף עלולה להעיב על אגר אגר טיוח חסר התועלת עבור ניסויים. בנוסף, על שטח של זהירות הוא בשלב 4.6. כאשר המסת אגר NGT-3D באמבט מים, הקפד לסגור את העפעפיים בחוזקה כדי לסייע ההיתוך. עם זאת, החום עלול לגרוםכמוסות מסוכנות &quot;פופ&quot; מפעם לפעם להפוך קליע. למטרות בטיחות עדיף לכסות את באמבט מים. חלקים רבים של הפרוטוקול ניתן להתאמה למדי למשתמש. למשל, השתמשנו מבחנה פלסטיק ברורה NGT-3D ובקבוק תרבית תאים ברור 25 ס&quot;מ 2 (מחזיקה בסך הכל 65 מ&quot;ל) עבור NGB-3D. סוגים אחרים של צינורות ברורים או בקבוקי לרשות המשתמש צריכים גם לעבוד. כמו כן, התפתחות חיידקים היא מתכווננת. OP50 coli זן E. לוקח בדרך כלל כשבוע לגדול לפחות מ&quot;מ 1, אשר הועדף לניסויים שלנו. מניסיוננו, מעט קצרות ואפילו הרבה פעמי צמיחה כבר לחיידקים לא נראו להשפיע על צמיחת תולעת או פוריות. התאמת הריכוז אגר, עם זאת, תשפיע תנועת תולעת. ריכוזים נמוכים של אגר לגרום תולעים מראים תנועה שחייה דמוית, וריכוזים גבוהים יותר יכולים לעכב תנועה כוללת. מקור לדאגה אחד NGB-3D היה הנושא של עיבויוהצטברות מים. כמו אגר נוזלים חמים מתקשה, באופן בלתי נמנע כמה עיבוי מתפתח לאורך זמן, במיוחד על הממשק של הבקבוק ואת אגר. זה יכול להוות בעיה עבור התולעת, אשר מציגה התנהגויות שחיו בנוזלים 14 ואת התפתחותם של חיידקים, אשר יכול להתפשט ברחבי הבקבוק על ידי הנוזל. מניעת העיבוי קשה. שני פתרונות אפשריים קיימים לכך. ראשית, אנו מוודאים כי התולעת יכולה להיכנס אגרה בקלות על ידי הצבתו במרכז השטח אגר על צוואר הבקבוק. שנית, אנחנו בכוונה לשמור על ריכוז חיידקים נמוכים NGB-3D, ובכך מצמצמים את הסיכוי מושבה גדלה על הממשק של נוזלים אגרו. חשש נוסף הוא הדמיה של תולעים NGB-3D. כדי להגדיל את הבהירות ואיכות תמונות של תולעי 3D, מושבות צריכות להיות קרובות אל פני השטח אבל נשארות שקועות לחלוטין אגר. ניסינו לגדל מושבות מוטבעות רק ליד surface ידי צבת שכבה דקה של אגר חיידקים המכילים על פני השטח, ואת התקשורת הנותרת היה חיידקים חינם. עם זאת, הנושא לא נפתר במלואה על ידי שיטה זו. במקום זאת, החלטנו לייצר בקבוקי NGB-3D רבים בבת אחת, ולהשתמש רק את אלה המכילים מוטבעים מושבות קרובות לפני השטח, ובכך מגדיל את הסיכוי כי תולעת תעבור מושבה הקרובה לפני השטח. אפשרות אחת שאנחנו לא בחנו משנה את התקשורת המוצקה למטריצה ​​מלבד אגרתי המגורען אנחנו מעסיקים כאן. הדמית תולעים בכיוון ציר z יכול גם להיות מאתגרת. אנו עושים זאת על ידי העלאה ידנית והוריד להתמקד הגס, אבל אם תכנית מעקב אוטומטית קיימת לכך, זה יכול להיות מועיל למדי. התקווה היא כי הטכניקות שהוצגו כאן לגידול של C. elegans ב 3D יהיה בשימוש נרחב על ידי ביולוגים נמטודות. שאלות רבות נותרו על ביולוגית תולעת, כולל הזדקנות והתנהגויות ב -3 D, והאם מה שמדענים להתבונן ב2D רלוונטי עבור תולעת 3D. ואכן, במחקר קודם באמצעות NGT-3D הראה את ההשפעה על כושר רבייה שטיפוח 3D לבש מוטציה חושית מתרבה בדרך כלל בתנאי 2D 9. בנוסף, מחקר אחד הראה התנהגויות תנועה שינו ב -3 D לעומת 2D 15. לבסוף, מערכת זו יכולה לשמש כדי להתחיל לענות על שאלות של אם תנאים מסוימים, מוטציות או מניפולציות להעניק יתרונות כושר לבעל החיים בסביבת 3D המקורית שלו.

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades1. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 19982, and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level3-5. 
C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria6. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory. 
To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short9. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates10. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ. 
In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>224620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>DAEJUNG</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td>58.44 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, dihydrate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CD0050</td>
			<td>2*H2O; 147.02 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CD0122</td>
			<td>386.67 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>B&#38;J</td>
			<td>RP090-1</td>
			<td>99.99%; 46.07 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, anhydrous</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>MN1988</td>
			<td>120.37 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic, anhydrous</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0445</td>
			<td>136.09 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#39;-Deoxy-5-fluorouridine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>D2235</td>
			<td>246.19 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic, anhydrous</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0447</td>
			<td>174.18 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Purpose Test Tubes</td>
			<td>Stockwell Scientific</td>
			<td>ST.8570</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Tube Closures</td>
			<td>Stockwell Scientific</td>
			<td>ST.8575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>SPL Lifescience</td>
			<td>70125</td>
			<td>25 cm^2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Definition Color Camera Head</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Fi2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-Based Control Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-U3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS32000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of caenorhabditis elegans in three dimensions in the laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

בניית NGT-3D היא פרוטוקול פשוט וברור שתוצאתה הוא מבחנה המלאה אגרה עם מושבות חיידקים קטנות במרווחים לאורך (איור 1 א) אגר. תולעים יכולים לנוע בחופשיות דרך מטריקס אגר, מציאה וממצים את מושבות חיידקים. כדי לברר האם אלגנס יכולים להתרבות ולגדול בדרך כלל NGT-3D, השווינו פוריות התפתחות הזחל ב -3 D עם צלחות 2D NGM סטנדרטיים. ב assay הגודל גוזל יחסית, מבוגר C. elegans הרמפרודיטים ב NGT-3D לשחזר בדיוק כמו הרמפרודיטים צלחות NGM 2D הרגילות כאשר מושבות חיידקים נמצאות בשפע עם 60 מושבות לפחות (איור 1B). יתר על כן, התפתחות זחל ב NGT-3D גם ממשיכה בדרך כלל כאשר יש שפע של מושבות חיידקים עם רוב התולעים במדינת המבוגר לאחר 96 שעות (איור 1 ג). עם זאת, אם מושבות חיידקים הם דלילותבמטריצה 3D, הן בגודל גוזלים יחסית (איור 1B, בר משמאל) התפתחות הזחל (תרשים 1C, בסרגל הימני) מושפעים באופן שלילי. כדי לבדוק אם למגורי ב -3 D יש השפעה כלשהי על הפיזיולוגיה לטווח ארוך של התולעת, ערכנו assay תוחלת החיים השוואת NGT-3D ו NGM צלחות. תוחלת החיים הממוצעת של תולעים על NGT-3D היה 15.6 ± 3.6 ימים לעומת 14.8 ± 3.1 ימים עבור צלחות NGM סטנדרטיים. עקומות תוחלת החיים עבור תולעים חיים על NGT-3D ו NGM היו כמעט זהות. לפיכך, נראה כי תולעים לשרוד באותה מידה בתנאי 3D ו 2 ד. ייצור NGB-3D הוא גם לא קשה וצריך לגרום בקבוק תרבות ברור, מלא אגר כזה שניתן לראות באיור 2 א. כדי בקלות להציג את מושבות החיידקים, שהבענו deoxyviolacein, מטבוליט חיידקים סגול כהה 11, ב OP50זן E. coli (איורים 2A, 2B; זן זמין על פי בקשה). תולעים חי יכול להיות צילמו תחת מיקרוסקופ סטריאו לנתח הילוכים (תרשים 2B, משלימה סרט 1). אחסון של NGT-3D ו NGB-3D בטמפרטורת החדר הוא מספיק כדי לשמור על שניהם לתאי תרבות אלה עד חודש 1. התייבשות של אגר אינה חשובה לאף NGT-3D או NGB-3D אם כובע תוספת סוג או בורג-סוג שמתאים הצינור או הבקבוק מוחל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55048/55048fig1.jpg" /> איור 1: פיתוח, פוריות ואת תוחלת חיים של סי אלגנס טפח NGT-3D להתחרות בעלות של NGM 2D הסטנדרטי. תמונות (א) של NGT-3D בכמה דילולים של חיידקים. שמאלההימני מכיל דילול 5 x 10 -7, ואת האמצעי הוא דילול 1 x 10 -7. (ב) גודל גוזל יחסית של wild-type תולעים ב NGT-3D כדי פחות מ -60 מושבות OP50 (n = 24), גדול או שווה ל 60 מושבות (n = 14), או על צלחות 2D NGM (n = 29). ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן. (ג) אחוז תולעים F1 דור ב L3, L4 או לשלב ההתפתחותי הבוגרת NGT-3D עם פחות מ -60 מושבות OP50, גדול או שווה ל -60 מושבות, או על צלחות NGM 2D. (ד) עקומת הישרדות של elegans wild-type ג בצלחות NGT-3D או NGM. NS מצביעה לא מחושב שונה באופן משמעותי על ידי מבחן log-rank. דמות זו שונתה מ- Lee 9. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55048/55048fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src = &quot;/ files / ftp_upload / 55,048 / 55048fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2: הדמיה C. elegans ב 3D באמצעות NGB-3D. (A, B) תמונות של NGB-3D; תמונות (C) של elegans מבוגר ג ליד מושבה של זן OP50 E. coli המבטא את deoxyviolacein פיגמנט סגול כהה. בר סולם הוא 500 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55048/55048fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55048/55048supmov.jpg" /> סרט 1 משלים: elegans למבוגרים ג להתקרב E. coli OP50-violace במושבה ב NGB-3D. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55048/Jove_Mov_1.mp4">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory at JoVE.com

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

אנו מציגים שיטה פשוטה לבנות מערכות טיפוח נמטודות 3D נקרא NGT-3D ו NGB-3D. אלה יכולים לשמש כדי לחקור כושר נמטודות והתנהגויות בבתי גידול, כי הם יותר דומים לאזורים מחית elegans Caenorhabditis הטבעית מאשר צלחות תרבות elegans המעבדה ג 2D הסטנדרטיות.

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

cultivation-caenorhabditis-elegans-three-dimensions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

17.7K Views.  Yonsei University.  אנו מציגים שיטה פשוטה לבנות מערכות טיפוח נמטודות 3D נקרא NGT-3D ו NGB-3D. אלה יכולים לשמש כדי לחקור כושר נמטודות והתנהגויות בבתי גידול, כי הם יותר דומים לאזורים מחית elegans Caenorhabditis הטבעית מאשר צלחות תרבות elegans המעבדה ג 2D הסטנדרטיות. 

Video: Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual documentation of vocal fold vibration is challenging, particularly in non-human mammals. As an alternative, excised larynx experiments provide the opportunity to investigate vocal fold vibration under controlled physiological and physical conditions. However, the use of a full larynx merely provides a top view of the vocal folds, excluding crucial portions of the oscillating structures from observation during their interaction with aerodynamic forces. This limitation can be overcome by utilizing a hemi-larynx setup where one half of the larynx is mid-sagittally removed, providing both a superior and a lateral view of the remaining vocal fold during self-sustained oscillation.
Here, a step-by-step guide for the anatomical preparation of hemi-laryngeal structures and their mounting on the laboratory bench is given. Exemplary phonation of the hemi-larynx preparation is documented with high-speed video data captured by two synchronized cameras (superior and lateral views), showing three-dimensional vocal fold motion and corresponding time-varying contact area. The documentation of the hemi-larynx setup in this publication will facilitate application and reliable repeatability in experimental research, providing voice scientists with the potential to better understand the biomechanics of voice production.

This paper introduces a protocol for the preparation of hemi-larynx specimens facilitating a multi-dimensional view of vocal fold vibration, in order to investigate various biophysical aspects of voice production in humans and non-human mammals.

חמי-בגרון ההתקנה ללמוד לקפל ווקאלית רטט בשלושה ממדים

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

פרוטוקול עבור המעבדה דיור של טורקיז דגים גמבוזיים (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...