עבודה זו נתמכה על ידי המענקים של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31201086, 31470759 ו- 31671219) וקרן מדעי הטבע שנגחאי (12ZR1436900).

C57BL/6 עכברים מובאים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. כל שיטות ניסוי בבעלי חיים הם בהתאם להנחיות אושרה על ידי חיה אכפת ועדת האתיקה-השנייה הצבאי לרפואה של אוניברסיטת.
 1. דיסקציה של כמחנכת פיתוח בלוטת יותרת המוח <ol><li>לבצע הרדמה: במקום neonatal עכברים (P0 - P5) על קרח כתוש, כדי ליצור היפותרמיה. עבור עכברים יותר 5 ימים של גיל מבוגר, להזריק urethane 5% (30 µL/g של משקל הגוף) intraperitoneally כדי לגרום הרדמה. להעריך תגובות הזנב toe צובט. להמשיך רק לאחר העכבר אינו מגיב לגירויים יתמודד.</li>
	<li>לאבטח את העכבר במצב פרקדן (שוכבת על הגב עם הפנים כלפי מעלה) על ידי בעדינות מקליטה את forepaws ואת hindpaws על משטח העבודה כי הוא מסוגל להיות מוצמד (קרי, קלקר) בתוך ברדס fume כימי.</li>
	<li>לבצע זלוף transcardial.
	<ol><li>לחתוך את בית החזה של העכבר עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף את הלב (ואיברים אחרים בית החזה).</li>
		<li>לאבטח את הלב הפועם עם מלקחיים בוטה והכנס מחט 26G (0.45 מ מ) לתוך החדר השמאלי. המחט מחוברת מזרק 10 מ"ל מלא מלוחים heparinized פוספט buffered (PBS; בתוספת 5 מ"ג/מ"ל נתרן חנקיתי ו 10 הפארין U/mL, pH 7.4, לחמם עד 37 ° C לפני השימוש). מיד אטריום ימין עם מספריים בסדר גזורה להתחיל perfuse לגוף PBS חמים עד הנוזל יציאה אטריום ימין ברור. 
		הערה: משוער 5-10 mL PBS יש צורך עכברים neonatal ו- 10-20 מ ל PBS עבור עכברים בוגרים.</li>
		<li>להשאיר את המחט מקום ושנה נוספת מזרק מלא עם 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7.4). Perfuse 10 mL ו- 20 מיליליטר מקבע עבור neonatal ועכבר P21, בהתאמה. 
		התראה: PFA רעיל. הוא עלול לגרום לעור גירויים הנשימה ואת העין נזק. יש ללבוש כפפות ולעבוד תחת ברדס כימי.</li>
	</ol></li> <li>לערוף את העכבר מחברים-קבוע וחתך את הגולגולת עם מספריים.
	<ol><li>הרם בעדינות את hindbrain מבסיס הגולגולת עם מלקחיים קטנים. -הסימן הראשון אשר, להפסיק להרים אך להחזיק hindbrain, חותכים את גבעול יותרת המוח, סיבי עצב התחברות לבסיס של המוח עם מספריים משובחים. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כי בלוטת יותרת המוח לא יוסר משם עם המוח.</li>
		<li>לאחר מכן להרים את המוח, להסיר את זה. כדי לחשוף את בלוטת יותרת המוח באופן מלא. לחתוך את האזור כולו סלה כולל בלוטת יותרת המוח, העצבים המשולש לרוחב, ו מתחת עצם היתד עם מספריים (כ 3 x 5 מ מ 2).</li>
	</ol></li> <li>להכניס את הרקמה ביתור תבשיל 35 מ מ או אחד טוב של צלחת 6-ובכן המכיל 2 מ"ל קר 4% מחברים (pH 7.4). לתקן את הרקמה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות בשביל P0 - P7 pituitaries, 1h לציון P14 pituitaries, ה 1.5 עבור P21 - P28 pituitaries, ו- h 3 עבור מבוגרים pituitaries.</li>
	<li>נוסף דיסוציאציה של יותרת המוח <ol><li>לרחוץ הרקמה קבוע עם 10 מ"ל PBS, שינויים 5, 15 דקות כל אחד. בלוטת יותרת המוח neonatal יחד עם הרקמות הסובבות שלו ואת מתחת עצם היתד יעובד ישירות על התייבשות. עם זאת, צריך להיות הפומבית יותרת מן העכברים שגילן עולה על 5 ימים נוספים תחת מיקרוסקופ סטריאו.</li>
		<li>לשים את הרקמה קבוע לתוך תבשיל 35 מ מ המכיל 1 מ"ל PBS. P5 - P14 pituitaries, להסיר את הקרומים חיבור בין העצבים והעצם עם בסדר. מלקחיים ומספריים, בזהירות לבודד את בלוטת יותרת המוח יחד עם העצבים המשולש לרוחב שלם אלא עוזב את אשר. בלוטת מבודד ועצבים מחוברים באמצעות ממברנות חיבור עם &#34; H &#34;-אוהב את המראה ( איור 1B).</li>
		Pituitaries <li>עבור P21, מבוגר, להסיר את העצבים ואת ממברנות חיבור מסביב בלוטת יותרת המוח, חופשית בלוטת מן הרקמות הסובבות. עוטפים את רקמת יותרת המוח עם עדשה ניקוי נייר טישו ולשים אותו קלטת ההטבעה. 
		הערה: גלישת בלוטת יותרת המוח זעיר עם עדשה ניקוי נייר טישו מסייע למנוע אובדן פוטנציאלי של דגימות לשמר את שלמות רקמות בפרוצדורה הטבעה-פרפין הבאה. זה ייתכן שלא יהיה צורך לעטוף את בלוטת יותרת המוח אם היא מעובדת בבקבוקון קטן בהליך הטמעת הקפאה.</li>
	</ol></li></ol> 2. שעוות פרפין Embedding ו Sectioning <ol><li>מייבשים דגימות ב הטבעה קלטות עם 50%, 65%, 75% ו-95% אתנול פתרונות למשך 15 דקות כל אחד. לאחר מכן מייבשים עם 3 שינויים של כוהל טהור, 3 דקות כל עבור P0 - P4 בלוטות, 4 דקות לכל עבור P5 - בלוטות P14, ו 5 דקות כל עבור P21 ובלוטות בוגרים. מעונן חלקית עם קסילן, 3 משתנה, 3 דקות כל עבור P0 - P4 בלוטות, 4 דקות לכל עבור P5 - בלוטות P14, ו 5 דקות כל עבור P21 ובלוטות בוגרים. לחדור עם מותך פרפין, שינויים 3, 7 דקות כל עבור P0 - בלוטות P4, ואחריו 8 דקות פעמיים 6 דקות פעם עבור P5 ובלוטות מבוגר. 
	הערה: פרמטרים אופטימליים לעיבוד רקמות יכול להיות מדעית מותאם. כדי להשיג חלקים באיכות גבוהה, יש להימנע התייבשות לא מספיקות או נגמר. הדבר נכון עבור ניקוי הרקמה באמצעות קסילן.</li>
	<li>התמצאות בעת הטבעה <ol><li>על טישו הטמעת מערכת מסוף, להסיר את הדגימה הקלטת ומקם אותה לתוך תבנית הבסיס מלא למחצה עם מותך פרפין. כיוון נכון של בלוטת יותרת המוח ההטבעה חיוני סיפוק מקטעים הילתית.</li>
		בלוטות יותרת המוח <li>עבור P21, מבוגר, מקם את בלוטת יותרת המוח עם ציר קצר בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס (המטוס סעיף). להשתמש היתד עצמות ועצבים המשולש בתור ציוני אנטומיים P0 - P4, P5 - P14 pituitaries, בהתאמה. אוריינט דגימות עם המשולש העצבים או פרופריה חציה של היתד עצמות בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס שלהם.</li>
		עם מלקחיים בסדר ומחוממת, <li>החזק בעדינות את הרקמה במיקום הרצוי עד שהשעווה הופך מוצק למחצה על צלחת קירור. למעלה למעלה את התבנית עם מותך פרפין. לאפשר לבלוק פראפין להתקרר עד השעווה לחלוטין פני השטח למוצק. 
		הערה: בלוטת יותרת המוח ביום עובריים 18.5 (E18.5) יכולים להיות מטופלים באופן זהה כמו בלוטת יותרת המוח neonatal. אבל pituitaries (ראת'קי &#39; s שקיות) יותר צעיר ממה צריך להיות מוטבע עם הראש כולו, מונחה עם הציר הסאגיטלי (מתוך הפה כדי occiput) בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס E16.5.</li>
	</ol></li> <li>להירגע לבלוק פראפין ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות ולאחר מכן לחתוך אותו לתוך דק לפרוסות (עובי 4 מיקרומטר הוא מועדף) עם מיקרוטום. כדי לקבל את המקטעים הילתית משביע רצון, לכוונן את המיקום של פרפין בלוקים במהלך חלוקתה. לטעון את הפרוסות רקמות על גבי זכוכית מצופים polylysine שקופיות כדי למנוע התנתקות של פרוסות בהליכים הבאים. 
	הערה: לחלופין, דגימות יכול להיות מיובש ב 15%, 30% (W/V) פתרונות סוכרוז (ב- PBS) ב 4 ° C עד הם שוקעים לתחתית, משובצים במתחם הטבעה-הקפאה באמצעות אותה שיטה שבה התמצאות, במהירות קפוא בקרח יבש. ואז חותכים את רקמת קפוא פרוסות של 8-10 מיקרומטר באמצעות cryostat. המורפולוגיה של הקפאה-מקטעים, עם זאת, לעיתים קרובות נחות הפרפין מקטעים.</li>
</ol> 3. H &#38; E מכתים ולקרוא Immunofluorescence <ol><li>חמים השקופיות על חום לחסום ב 55 ° C ו- dewax עם קסילן, 2 שינויים, 4 דקות כל אחד. מייבשים את הדגימות עם 95% אתנול פעמיים, 75% אתנול פעמיים, 3 דקות כל אחד. לשטוף את השקופיות עם מים מזוקקים למשך 5 דקות על מטרף.</li>
	<li>עבור H &#38; E מכתים, כתם בסעיפים אלום hematoxylin פתרון 6 דקות, לשטוף בשחקן פוטבול פועלing מי ברז למשך 2 דקות, להבדיל במים אמוניה 0.2% 45 s ו מחדש לשטוף במים למשך 2 דקות. לאחר מכן מייבשים הסעיפים עם אתנול 95% 1 דקות, הכתם עם אאוזין עבור 2 דק ברצף מייבשים, נקה, ואת הר-</li>
	<li>Immunofluorescence תיוג <ol><li>פנקו הסעיפים עם מתנול המכיל 3% H 2 O 2 ו- 0.01% נאן 3 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להשבית peroxidases אנדוגני. לאחזר אנטיגנים על ידי הרתחה ובסעיף המאגר אחזור (EDTA 1 מ"מ ו 1 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4) בסיר לחץ במשך 2 דק Incubate הסעיפים באמצעות מאגר חסימה (סרום עיזים 5% ב- PBS) במשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>דגירה מקטעים עם הארנב הורמון אנטי-גדילה (GH) נוגדנים (1:2, 000) או ארנב נוגדן anti-גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP) (1:2, 000) מדולל במאגר חסימה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>תקופת דגירה מקטעים עם נוגדנים משניים (עז נגד הארנב IgG-HRP, 1:300 במאגר חסימה) של 35 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להגביר את האותות באמצעות Biotinyl Tyramide (1:50 בתוך תמיסת מלח טריס באגירה מלאה המכילה 2 O 0.3% H 2) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, והמחש עם Streptavidin-Alexa594 או 488 (1:300 בחסימה מאגר, 30 דקות, 37 ° C).</li>
		<li>Counterstain הגרעינים עם דאפי (50 מ"ג/ליטר ב- PBS) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. 
		הערה: לא יתכן צורך להגביר את האות באמצעות מערכת הגברה האות Tyramide (TSA). לחלופין, ניתן להשתמש נוגדנים משניים מצומדת פלורסצנטיות להמחיש את האות.</li>
	</ol></li> <li>רכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד דאפי, טקסס ואדום, מערכות סינון FITC, × 4/0.13 כדי × 40/0.75 יעדים, 5.0 מגה פיקסל מצלמה. השתמש ה-360, 488, 594 ננומטר לייזר אורכי גל עבור הדמיה דאפי, אלקסה 488 - ומקטעי שהוכתמו 594 אלקסה, בהתאמה. למטב את עוצמת הלייזר (0.8 היה משמש בדרך כלל), זמן החשיפה לרמות הרצויות לכל ערוץ. ללכוד את התמונה תחת השליטה של תמונה רכישת תוכנה, כיסוי הדימויים פלורסצנטיות לאחר מכן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה-</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+face+of+the+anterior+pituitary.">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li><li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines.">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li><li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+pituitary+development:+signaling+and+transcriptional+networks.">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li><li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+gland+development:+an+update.">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li><li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse.">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li><li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa.">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li><li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size,+shape,+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland.">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li><li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period.">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li><li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion:+proliferation,+progenitors,+and+cell+specification.">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li><li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis.">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks.">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li><li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+(lit)+mutant+mice.">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification.">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

לפיתוח מאתר pituitaries, עברו טכנית קשה להשיג מקטעים הילתית נכונה עקב שלהם תכונות זעירים, שברירית, מאפיינים אנטומיים ייחודיים6,8. כמה קבוצות מחקר ולכן בחרה מקטעים מאמצע-הווריד כדי לנתח את המורפולוגיה של עובריים ו neonatal יותרת המוח11,12. למרות המקטע מאמצע-הווריד של יותרת המוח הוא גם מסוגל להראות את הקדמי, ביניים, אונות האחורי בפרוסה אחת, המקטע הילתית מועדף מאוד מכיוון שהוא מאפשר להציג תצוגה המרבי של אלה משלוש אונות. בפרט, ללימודים כמת, כגון נחישות של אמצעי האחסון, שטח של בלוטת יותרת המוח, ספירת מספר אפופטוטיים להיפגע, מתרבים תאים, סעיפים הילתית נעלים על סעיפים מאמצע-הווריד במונחים של נציג שלהם. כאן, אנו מציגים שיטה שימושית לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.
כדי למנוע פגיעה בלוטות יותרת המוח במהלך התהליך, מספר טכניקות נעשה שימוש בפרוטוקול זה. ראשית, עכברים נפתרות על-ידי transcardial זלוף פורמלין לפני ניתוח. זה מקבע מסייע לא רק לשמר את הארכיטקטורה איברים אלא גם כדי להסיר תאי דם אדומים אשר לעיתים קרובות לגרום אוטומטי פלורסצנטיות13. שנית, האזור כולו סלה זה גזור כדי להימנע מלגעת בלוטת יותרת המוח עם כל כלי הקשה-ניתוח. הרקמות הסובבות לעזור לשמור את בלוטת יותרת המוח במצב המקורי גם לשמש ציוני דרך להטבעת התמצאות. באמצעות שיטות אלה המועסקים, יכול ניסויים קטנים כמחנכת pituitaries מבעלי חיים צעירים תוך הפחתת ההסתברות לנזק בלתי רצויה.
ההליך דיסקציה של פרוטוקול זה חל גם לבודד את יותרת המוח מאתר זה לא קדם תוקנה על ידי זלוף. במקרה הזה, יותר זהירות יש לנקוט כדי למנוע נזק בלתי רצויה, גם צריך להיות גזור בלוטת מהר ככל האפשר.
מאז pituitaries מאתר המתפתח הם מאוד קטנים בגודלם, עבר מאוד קשה להתמצא בהם כראוי בעת הטבעה. פרוטוקול זה משתמש את המשולש העצבים או עצמות היתד ציוני דרך, ביצוע השלבים התמצאות הרבה יותר קל. Pituitaries מונחה כראוי חיוניים להשגת סיפוק מקטעים הילתית.
לסיכום, אנו מספקים ניתוח יותרת המוח משופרת של הטמעת נהלים, אשר מתאים עכברים בשלבי התפתחות שונים. יישום של נהלים אלה ניתן להשיג סיפוק הילתית חלקים מאתר בלוטות יותרת המוח כדי לשמש לניתוח של היסטולוגיה שגרתית, אימונוהיסטוכימיה, בחיי עיר הכלאה מחקר התפתחותי14.

בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס1,2. מבחינה אנטומית, בלוטת יותרת המוח היא מבנה ' שני-in-one"הכוללת את neurohypophysis, את adenohypophysis. חלקים אלה יש מקורות עובריים שונים, פונקציה אחרת. Neurohypophysis נגזרת של האאקטודרם עצבית, מפריש אוקסיטוצין, הורמון antidiuretic. Adenohypophysis מקורו נרתיק של ראת'קי, אחראי על השחרור של הורמונים לרבות הורמון גדילה, פרולקטין, תירוטרופין, הורמון מגרה זקיק, הורמון מחלמן, הורמון אדרנוקורטיקוטרופי, ו מלנוציט – הורמון מגרה3,4,5.
בלוטת יותרת המוח נשענת על המשטח הגבי של עצם היתד (אשר) של הגולגולת העכבר ו מחוברת לרצפה של המוח על ידי גבעול שביר. המלון מוקף רוחבית על ידי המשולש העצבים ועל anteriorly ידי הצנטר6,7. בלוטת יש צורה של אליפסה מוארכת עם ציר זמן בניצב לראש. על השטח הגבי שלה, את neurohypophysis, את adenohypophysis יכול בקלות להיות התחום, עם לשעבר הכובש המדיאלי האזור הגבי ולהרחיב את האחרון רוחבית ולא ventrally. במהלך פיתוח כמחנכת, בגודל של יותרת המוח גדל במהירות בחודש הראשון לאחר הלידה8,9. בכל זאת, ההיפופיזה העכבר הוא עדיין קטן מאוד בגודלם במשקל ממוצע של 1.9 מ"ג, קוטר ציר זמן של ~ 3 מ מ למבוגרים10, קוטר ציר זמן של 2-2.5 מ"מ ביום כמחנכת 21 (P21), ולא רק 1-1.5 מ"מ P0.
מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר. עם זאת, כישורים טכניים נדרשים להשיג סיפוק הילתית חלקים ובלוטות יותרת המוח פיתוח עכברים בשל גודל קטן במיוחד שלה האנטומיה ברורה. במאמר זה וידאו, נדגים כיצד לנתח העכבר יותרת ולהכין מקטעים הילתית יותרת המוח בשלבי התפתחות שונים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tools/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors-straight</td>
			<td>JinZhong</td>
			<td>J21010</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors-strainght</td>
			<td>JinZhong</td>
			<td>WA1010</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>JinZhong</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td>for isolation of the pituitary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G (0.45mm) needle</td>
			<td>HongDa</td>
			<td></td>
			<td>for transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>300841</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning paper</td>
			<td>ShuangQuan</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomical microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX-ILLB2-200</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-272423</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding console system</td>
			<td>KEDEE</td>
			<td>KD-BM11</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HM315R</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost-Plus slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-543</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>BH2-RFCA</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.12H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71650</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>237213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection</td>
			<td>SPH</td>
			<td>H31022051</td>
			<td>for perfusion saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>8330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9627</td>
			<td>for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4009</td>
			<td>for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti growth hormone (GH)</td>
			<td>National Hormone</td>
			<td></td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody</td>
			<td>Pituitary Program</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse GFAP antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9269</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, HRP</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA system</td>
			<td>NEN Life Science Products</td>
			<td>NEL700</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S32356</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11090</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and coronal slice preparation of developing mouse pituitary gland

בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס. הוא מורכב שתי בלוטות עם המקורות עובריים נפרד פונקציות – את neurohypophysis ולא את adenohypophysis. בלוטת יותרת המוח המתפתח של העכבר הוא קטן ועדין עם צורה של אליפסה מוארכת. מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר.
המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג מקטעים הילתית יותרת המוח תקין עם רקמת שהשתמרו ארכיטקטורות מלפתח עכברים. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט כיצד לנתח ולעבד יותרת כראוי מלפתח עכברים. ראשית, עכברים נפתרות על-ידי transcardial זלוף פורמלין לפני ניתוח. אז שלוש טכניקות שונות ויבתר מוחלים כדי להשיג שלמות בלוטות יותרת המוח תלוי בגילו של עכברים. עבור עוברי עכברים מגיל 17.5 ימים עובריים (E)-18.5 ו- neonates עד 4 ימים, האזורים סלה כולו לרבות עצם היתד, בלוטה, המשולש העצבים הם גזור. עבור גורים בגילאי כמחנכת ימים (P) 5-14, בלוטות יותרת המוח הקשורים המשולש העצבים הם גזור בכללותה. עבור עכברים מעל בן 3 שבועות, בלוטות יותרת המוח הם בקפידה גזור ללא תשלום מן הרקמות הסובבות. אנחנו גם להציג כיצד להטביע את בלוטות יותרת המוח בכיוון הנכון באמצעות הרקמות הסובבות כמו ציוני דרך כדי להשיג סיפוק מקטעים הילתית. שיטות אלה שימושיים בניתוח תכונות ההתפתחותי היסטולוגית של בלוטות יותרת המוח בפיתוח עכברים.

פרוטוקול זה מציג שיטה לנתח יותרת מלפתח עכברים. עבור העכבר neonatal, האזורים סלה שלם המכיל את בלוטת יותרת המוח, העצבים המשולש, במסווה עצם היתד היו גזור החוצה מבסיס הגולגולת. בלוטת יותרת המוח קטן ועדין נותרו על כנן במהלך התהליך (איור 1 א'). בלוטות יותרת המוח קשורה העצבים המשולש לרוחב עכברים שגילן עולה על 5 ימים, היו אז מבודד. המבנה ברוטו של בלוטת יותרת המוח מבודד את P7 העכבר השתמר היטב (איור 1B). עבור העכבר P21, בגודל של בלוטת יותרת המוח היה גדל במידה ניכרת בהשוואה לזה של העכבר neonatal. בלוטת יותרת המוח הופרדה בהצלחה עם נזק בלתי נראה בעת הסרת הרקמות הסובבות שלו (איור 1C).
כדי להציג את האזור המרבי של adenohypophysis והן neurohypophysis בפרוסה אחת של בלוטת יותרת המוח, מקטע הילתית היא עדיפה. בלוטות יותרת המוח ביתור היו מכוונת כראוי כדי להשיג סיפוק מקטעים הילתית. H &#38; E מכתים הראה גם נשמר מורפולוגיה של adenohypophysis ושל neurohypophysis בלוטות יותרת המוח P0, P7 ו- P21 (איור 2).
הפרוסות מעובד היו גם תואם immunofluorescence תיוג. כדוגמה, את adenohypophysis ואת neurohypophysis הראה immunolabeling ספציפיים של GH ו- GFAP, בהתאמה (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig1.jpg"> 
איור 1: דיסקציה של בלוטות יותרת המוח המתפתח כמחנכת. נופים הגבי של ביתור בלוטות יותרת המוח ואת הרקמות הסובבות מ P0, P7 ו- P21 עכברים. A, קדמי; P, אחורי; L, משמאל; R, נכון; SB, עצם היתד; TN, העצב; אה, adenohypophysis; מלון NH, neurohypophysis. גודל ברים, 1 מ מ. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig2.jpg"> 
איור 2: היסטולוגיה של העכבר יותרת. נציג H &#38; E מכתים במקטעי הילתית יותרת המוח של עכברים P0, P7 ו- P21. (A, Bו- C) נשקף נוף הגדלה נמוכה של pituitaries הילתית. (D, Eו- F) הם הגדלה של האזורים ממוסגרות (A, Bו- C) בהתאמה. גודל ברים = 1 מ מ ב (A, B ו- C); ו- 20 מיקרומטר (D, E ו- F). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig3.jpg"> 
איור 3: צביעת immunofluorescent נציג על בלוטות יותרת המוח- GH (A) (אדום) בא במיוחד לידי את adenohypophysis מ- P7 עכברים. (B) Magnified תמונה של אזור מתוחם בא (ג) GFAP (ירוק) בא במיוחד לידי את neurohypophysis מ- P21 עכברים. (ד) Magnified תמונה של אזור מתוחם ב ג גרעינים היו מוכתמים דאפי (כחול). סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר (A ו- C); 30 מיקרומטר (B ו- D). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland at JoVE.com

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

17.1K Views.  Second Military Medical University. אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.

Video: Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

הכנה לרקמה וכתמים של רקמות הגולגולת והעצמות הבלתי מתויטות

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...