מחקר זה נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (RO1 GM079351 כדי D.K.). אנו מודים דורותיאה מפציר על לה עצות מועילות על השחלה הגולמי והניתוחים בהתבסס על הפרוטוקול המקורי שלה. אנו מודים גם איימי Reilein לה סיוע והערות על כתב היד.

1. EggLaying
<ol><li>לשלב כ זכר עשר חמש עשרה הנשי דרוזופילה הזבוב הבוגר של גנוטיפ הרצוי בבקבוקון של אוכל עשיר לטוס רגיל בתוספת שמרים. כדי למנוע צפיפות יתר את המבחנה, לאפשר ובסיומה הנקבות להטיל ביצים לא יותר 2 – 4 h14.</li>
	<li>להעביר את המבוגרים מ המבחנה לתוך בקבוקון חדש על-ידי הקשה את המבחנה פתיחה נגד בקבוקון שונים עם אוכל לעוף. אפשר כי הביצים מתפתחות לזחלים בטמפרטורת החדר במשך 3-4 ימים.</li>
</ol>2. בחירת הזחלים הנשי
<ol><li>בעזרת מברשת לחה בסדר עם זיפים רכים, לבצע תנועה מתגלגל עם המברשת לאורך החומה של הבקבוקון כדי להעביר נודד הזחלים השלישי-לחלל המבחנה לכוס טוב מלא עד הקצה עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). לשטוף את פסולת המזון את הזחלים על ידי העברת אותם לשני טוב מלא 1 x PBS.</li>
	<li>הפרד את הזחלים זכר ונקבה באמצעות מלקחיים. זיהוי הזחלים זכר על-ידי זוג האשכים גדולות ועגולות, ולאחר שקוף מוטבע בתוך הגוף השמן על הצד הלטראלי של הגוף כשני שליש למטה מן הקצה הקדמי שלה15. הזחלים הנשי הן בממוצע יותר גדול, פחות שקוף מאשר גברים, יש גונדות קטן הרבה יותר, כי הם יותר קשה לזהות.</li>
	<li>בחר נגד הזחלים זכר כדי לאסוף את הזחלים הנשי. לאסוף לפחות עשרה נקבות מן הבאר. למקם את הזחלים נשית נפרדת טוב מלא 1 x PBS.</li>
	<li>שימוש מלקחיים להעביר את הזחלים הנשי בעדינות לתוך בקבוקון חדש של אוכל לעוף טרי בתוספת שמרים.</li>
	<li>מניחים את הצנצנת עם הזחלים הנשי במיקום כהה כדי להקל על pupariation16. לאורך כל היום, לנטר את הזחלים עבור pupariation. כל זחל עוצר, מתפתח prepupa, להקיף את prepupa נגד המבחנה, לרשום את הזמן המשוער מתי זה קודם מטופסי prepupa. לזהות prepupae על-ידי על בליטה של anterior spiracles והתזמון של היווצרות puparium17. אפשר את prepupae לפתח לנקודת הזמן הרצויים (נמדד בשעות לאחר היווצרות puparium, APF). הערה: כל חיה עוברים puparium היווצרות בתוך מרווח h כ 10 יכול להיחשב של prepupa. השלב הגולמי מתחיל כ 12 שעות לאחר היווצרות puparium אחרי הנשירה פנימי התרחש.</li>
</ol>3. הכנת הגלמים נוגדן מכתים
<ol><li>
טופס על pipet זכוכית אותה לשימוש מאוחר יותר שלבים, מרוקן את הגוף השמן הגולמי.
	<ol>
<li>ממיסים את קצה זכוכית pipet פסטר מעל מבער בונזן. הזכוכית נמס, להשתמש מלקחיים למשוך את הטיפ אופקית משאר pipet כדי ליצור טיפ דק יותר.</li>
		<li>לאחר קירור להתפרק רק חלק קטן של קצה pipet כדי ליצור חור עגול מסודר. לצרף נורה הקצה השני של pipet.</li>
		<li>טען את pipet עם 1 x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לקצור את הגלמים, אשר מודבקות לקיר של הבקבוקון, החל טיפת מים לאורך אזור קשר בין גולם בקבוקון קטן. לחכות 1 – 2 דקות כדי לתת החלבון הדבק מתמוסס ולהבהיר בעדינות הגולם מהקיר עם מברשת בסדר לח. העברת הגולם טוב לכוס מלאה 1 x PBS. להקדיש לבאר בודדת לכל גולם כדי למנוע צפיפות יתר הבאר.</li>
	<li>תוך אוחז בקצה האחורי של הגולם עם זוג מלקחיים, בזהירות לקרוע את החלק הקדמי של המקרה הגולמי עם זוג נוסף עד ראש הגולם יהיה גלוי.</li>
	<li>אחיזה בקצה הקדמי ביותר של הראש הגולמי עם מלקחיים ומשוך בעדינות את הגולם מהתיק הגולמי שלה. הערה: חלק של שומן הגוף יכול להישפך החוצה בתהליך זה.</li>
	<li>להפריד ולמחוק את החצי הקדמי של הגולם של החצי האחורי עד נשאר רק השק בטן.</li>
	<li>
לחלץ את תאי הגוף השמן מן השק בטן.
	<ol>
<li>לתפוס את השק בטן בתחתית הבאר עם מלקחיים ביד אחת תוך החזקת את pipet זכוכית מלאים 1 x PBS ביד אחר.</li>
		<li>מטרת הטיפ pipet דק לכיוון הפתח של שק, לאט pipet 1 x PBS לתוך. חלל הבטן כדי לשטוף את תאי שומן הגוף סביב השחלות הגולמי. הערה: השחלות הן זוג מבנים קטנים, שקוף, מפוספס, מלבני שצריך להישאר בתוך השק בטן.</li>
		<li>לשטוף את שומן הגוף תאים עד לפחות שני שלישים של שומן הגוף נעלם או עד השחלות גלויים ליד הפתח של השק בטן. חשוב מאוד לבצע שלב זה לאט כדי לא לשטוף את השחלות מתוך הבטן בטעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבחון את הבאר כדי לבדוק אם השחלות שפכתי החוצה במהלך לשטוף תא את שומן הגוף. אם השחלות אינם גלויים בתוך הבאר, הם צריכים להישאר בחלל הבטן. אם השחלות יש לצאת, במקום גולם חדש בבאר, חזור על שלב זה.</li>
	<li>להעביר את הבטן לתוך תא coverglass ברור מלא עם קיבוע מאגר (1 x PBS, 4% paraformaldehyde) ומניחים את המכסה למעלה. כדי להבטיח מספר מספיק של השחלות לעמוד על צביעת ותהליך הרכבה, לנתח השחלות יותר מכפי הצורך. זהירות: החומר הממתן קיבוע מכיל paraformaldehyde אשר הוא רעיל. בבקשה ללבוש הגנות מתאימות כגון כפפות, בטיחות משקפיים, וכו '.</li>
</ol>4. אימונוהיסטוכימיה
<ol><li>לאורך כל התהליך מוכתמים, להשתמש מלקחיים לדחוף בעדינות את השחלות צף כל לתחתית הבאר כיסוי זכוכית כדי להבטיח כי השחלות שקועים לחלוטין בפתרון נוגדן.</li>
	<li>המקום רצועות סרט הדבקה דו-צדדי על גבי משטח שטוח של Nutator ולאחר מכן מקם את coverglass chambered על פני השטח דבק.</li>
	<li>דגירה השחלות במאגר קיבוע מהשלב 3.7 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את השחלות שלוש פעמים ב- PBS 1 x 1% טריטון X-100 עבור 5, 10 ו- 45 דקות (h 1 סה כ), בהתאמה, כדי לאפשר permeabilization יסודית.</li>
	<li>לחסום את השחלות בנסיוב עז נורמלי 10% ב- PBS 1 x עם 0.5% טריטון X-100 למשך 30 דקות.</li>
	<li>דגירה השחלות ללון ב- 600 µL של נוגדן ראשוני של בחירה מדולל לריכוז המתאימה ב- PBS 1 x עם 0.5% טריטון X-100 ב 4 º C.</li>
	<li>לשטוף את השחלות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- PBS 1 x עם 0.5% טריטון X-100.</li>
	<li>דגירה השחלות עבור 2 h ב- 600 µL של נוגדנים משניים של בחירה מדולל לריכוז המתאימה ב- PBS 1 x עם 0.5% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לשטוף את השחלות פעמיים במשך 5 דקות ב- PBS 1 x עם 0.5% טריטון X-100 ופעם אחת למשך 5 דקות ב- 1 x PBS.</li>
</ol>5. לנתח והרכבה השחלות הגולמי
<ol><li>במקום טיפה קטנה של PBS 1 x לשקופית מיקרוסקופ. מלקחיים להשתמש כדי להעביר את השק בטן מלוח coverglass chambered כוס טוב מלא 1 x PBS. להקדיש לבאר בודדת לכל גולם כדי למנוע צפיפות יתר הבאר.</li>
	<li>לקרוע לגזרים השק הבטן ואת כל הגוף השמן שנותרו עם מלקחיים. הערה: השחלות, אשר הם זוג של מבנים קטנים, שקוף, מפוספס, מלבני, צריך להיות גלוי בתוך הבאר. השחלות מוקפים לעיתים קרובות בחוזקה שומן הגוף, לכן חשוב לוודא כי כל הגוף השמן ביסודיות נקרע לגזרים.</li>
	<li>העברת השחלות מן הבאר לתוך הירידה של 1 x PBS בהמיקרוסקופ שקופית על-ידי אחיזה במרכז השחלות בין קצות המלקחיים. חשוב מאוד להשתמש אחיזה חזקה מבלי לסחוט את השחלות כדי לא להפסיד או להשמיד אותם במהלך ההעברה. הוסף מספר טיפות של PBS 1 x אל השקופית כאשר הפתרון מתייבש עם הזמן.</li>
	<li>לאחר כל השחלות גזור והעבירו אל השקופית מיקרוסקופ, pipet 40 µL של הרכבה בינונית על גבי coverslip 22 מ"מ x 22 מ"מ בעלת המקום coverslip בעדינות על השחלות. תן שקופית הלילה יבש לפני הדמיה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Stem+Cell+Niches:+A+Decade+of+Discovery+Suggests+a+United+View+of+Stem+Cell+Regulation.">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Germline+Stem+Cells+in+Drosophila.">The Development of Germline Stem Cells in Drosophila.</a> Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).</li><li>Pearson, J., L&#243;pez-Onieva, L., Rojas-R&#237;os, P., Gonz&#225;les-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+Drosophila+stem+cell+biology.">Recent advances in Drosophila stem cell biology.</a> Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).</li><li>Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells,+wound+healing+and+cancer.">Epithelial stem cells, wound healing and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+myeloid+leukemia:+proving+ground+for+cancer+stem+cells.">Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells.</a> Cell. 119 (3), 314-316 (2004).</li><li>Reilein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+direct+stem+cell+derivatives+defined+by+stem+cell+location+and+graded+Wnt+signaling.">Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling.</a> Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).</li><li>Eliazer, S., Buszczack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+niche:+studies+from+the+Drosophila+ovary.">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).</li><li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+&#224;+brac.">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric &#224; brac.</a> Development. 121 (1), 173-187 (1995).</li><li>King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+female+Drosophila+reproductive+system.">The development of the female Drosophila reproductive system.</a> J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).</li><li>Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pak-regulated+cell+intercalation+event+leading+to+a+novel+radial+cell+polarity+is+involved+in+positioning+of+the+follicle+stem+cell+niche+in+the+Drosophila+ovary.">A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary.</a> Development. 142 (1), 82-91 (2015).</li><li>Irizarry, J., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+supports+Drosophila+fertility+by+regulating+development+of+ovarian+muscle+tissues.">FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues.</a> Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).</li><li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Staining+of+Drosophila+Larval+Ovaries.">Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries.</a> J Vis Exp. (51), e2537 (2011).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER.">The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Courdec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bric+&#224;+brac+locus+consists+of+two+paralagous+genes+encoding+BTB/POZ+domain+proteins+and+acts+as+a+homeotic+and+morphogenetic+regulator+of+imaginal+development+in+Drosophila.">The bric &#224; brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila.</a> Development. 129, 2419-2433 (2002).</li><li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INSECT+FAT+BODY:+ENERGY,+METABOLISM,+AND+REGULATION.">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li><li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+Body+Development+and+its+Function+in+Energy+Storage+and+Nutrient+Sensing+in+Drosophila+melanogaster.">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li><li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+Ovaries.">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52 (2006).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להכריז.

השלב הקריטי ביותר וקשה של פרוטוקול זה כרוך הכנה הגולמי השחלות לפני קיבוע. כדי להבטיח השחלות, קטן והיא קבורה על-ידי תאי שומן הגוף בבטן הגולמי, מוכתמים מספיק נוגדנים, חשוב לא רק תקרע חור גדול בתוך השק בטן עם מלקחיים, אבל גם לחלץ תאי שומן הגוף ההגנתיים החוסמים השחלות של הנוגדנים. ביצוע מוצלח של שלב זה דורש הפעלת לחץ עדין על הנורה pipet פסטר בעת שטיפת תאי שומן הגוף מתוך השק בטן (למשל 1-2 תאי שומן הגוף צריך להשאיר את הבטן לשניה במהלך שלב זה). כשל להשתמש בכוח עדין יגרום כנראה השחלות לשפוך מתוך הבטן, לתוך הכוס טוב. מכיוון השחלות בכוחות עצמם הם קטנים, שקוף, וקשה לתפוס עם מלקחיים, הם חייבים להישאר בתוך השק בטן לאורך כל תהליך צביעת. לפיכך, אם השחלות לצאת הבטן במהלך השלב הכנה לפני קיבוע, זה יהיה קשה מאוד לאחזר, כתם לטעון אותם בצורתם מבודד במהלך הפרוטוקול.
תאי שומן הגוף, שכוללים בעיקר השומנים טיפות, הם הטריגליצרידים אחסון organelles נפוץ למצוא חרקים כולל דרוזופילה melanogaster19,20. מאז כמה תאי שומן הגוף נשארים בבטן הגולמי על קיבעון, פרוטוקול זה מנצל ריכוזים גבוהים יחסית של טריטון X-100 ב שטיפות PBS שלושת לחלץ ליפידים רבים ככל האפשר בין שני cell membranes בשחלה בכל שארית שומן רקמות המקיפים את השחלות. כפי שמגלה את נוגדן בהיר של חלבון קרום התא השלישי Fasciclin מכתים איור 3, באמצעות 1 x PBS עם 1% טריטון X-100 במהלך שלוש שטיפות עובד היטב כדי מקסימאלית תמצית ליפידים תוך שמירה על שלמות התא ממברנה.
ברגע שומן הגוף חולץ, השלב השני הקריטי ביותר הוא לוודא שהשחלות יישארו בתוך השק בטן ברחבי קיבוע נוגדן מכתים. זה עוזר למקם אותם בתוך coverglass ברור, תאיים ולא צינור microcentrifuge עבור ניראות יותר ברור הבטן הגולמי במהלך צביעה. להשתמש מלקחיים לדחוף בעדינות את השקים בטן לחלק התחתון של החדר, כך הרקמות בטן בתוך השק מלא נבלע נוגדן פתרון.
לבסוף, זהירות רבה יש לנקוט כדי להעביר את השחלות השק בטן השקופית מיקרוסקופ במהלך תהליך הרכבה. למרות שהשחלות קטן וקשה לתפוס עם מלקחיים ללא בצביטה, הדרך הטובה ביותר להעביר אותם אל השקופית הוא בכך בחוזקה המרכז של השחלות. הם יישארו מבנית מהרגע ששמים על השקופית. ניתן לנתח את השחלות מהבטן ישירות על גבי השקופית מיקרוסקופ כדי להימנע מאובדן השחלה, אבל זה עלול להוביל כמות מוגזמת של הרכבה בינונית בשקופית עלול לסבך את תהליך ההרכבה.
המגבלות של פרוטוקול זה לערב את כמות הזמן תהליך ניתוח כולו עשוי לארוך, התשואה פוטנציאל נמוך של השחלות היטב מוכתם, ומיומנות הדרושים כדי להשלים בהצלחה את כל שלב. מכיוון השחלות הגולמי דורשים הגוף השמן נרחב החילוץ, הכנת גולם אחד קיבוע יכולה לקחת בין 10 ל 20 דקות. יתר על כן, כדי להבטיח מספר מספיק של השחלות לעמוד כולו מכתים הליך, מומלץ לנתח הגלמים יותר מאשר לצורך הניסוי. משמעות הדבר היא כי כמות גדולה של זמן עשוי להיות בילה בפשטות על הכנת הגלמים עוד לפני שלב קיבוע.
השחלה הגולמי והניתוחים שונים במידה רבה מן הפרוטוקולים עבור זחל14 ולמבוגרים21 השחלה והניתוחים. למטרתו של השחלה בתוך תיק הגולמי מציג אתגרים ייחודיים הם נפגשו על ידי הכלים המשמשים פרוטוקול זה. שיטות אלה עשויים להיות מוחל על שושלת היוחסין ניסויים העקיבה כדי לקבוע מתי FSCs, ליווי תאים צוינו השחלה הגולמי לאורך זמן. גירסה שונה של פרוטוקול זה מעורבים תא חרקים תרבות המדיה יכול לשמש גם פוטנציאל לנתח השחלות הגולמי לניתוח שמחוץ בשידור חי הדמיה.

מחקר תאי הגזע באמצעות דרוזופילה השחלות התרחב נרחב מאז התיעוד הראשון של תאי גזע נישה1,2,3,4. בעקבות הפיתוח של שושלת היוחסין מעקב גנטי כלים, השחלה דרוזופילה והניתוחים שימשו נפוץ לחקר תאי הגזע שושלות, איתות המסלולים המסדירים תאי גזע תחזוקה, התפשטות, גורל גומחת תאי גזע. הידע של איתות המסלולים האלה עשוי להניב תובנות סיבות פוטנציאליות של סרטן שמקורן בתאי גזע aberrant פעילות5,6,7. גם לאחרונה הוכח כי תאי גזע סומאטית בשחלה דרוזופילה , המכונה בתאי גזע זקיק (FSCs), חריפה דומים בתרבית של תאי גזע מעיים בהיבטים רבים של הארגון שלהם8. מסיבה זו, דרוזופילה שהשחלות מערכת מודל שימושי מאוד ללמוד התנהגות תאי גזע.
בעוד השחלות זחל, למבוגרים מציעים רמזים כדי התפתחות תאי גזע מוקדמת וארגון תאי גזע הסופי של הגומחה, בהתאמה, השחלה הגולמי הוא מבנה ביניים שבו germline ותאים סומטיים לארגן מחדש ולהקים את זהותם 9 , 10. על פי מספר מחקרים בחנו היבטים של התפתחות רקמת השחלה הגולמי10,11,12,13, שאלות נותרו לגבי בידול ו הארגון המרחבי של סוגי תאים השחלות במהלך הפיתוח הגולמי. בפרט, המפרט של FSCs מתרחשת בתקופה זו. פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, צביעת השחלות הגולמי בנקודות הזמן הרצוי — טכניקה יכול לשמש בניסויים כמובן זמן לנתח התפתחות שחלה הגולמי בפירוט הזחל מ לבמה למבוגרים.
לקחת בחשבון גודל קטן, טבלתי, הנגישות של השחלה הגולמי בתוך הבטן הגולמי, פרוטוקול זה מנצל כלים כגון מחוייט דק-היטה פסטר pipet כדי להסיר רקמות הגוף השמן בבטן חוסם גישה נוגדן השחלות. ברור, תאיים coverglass בשימוש במהלך הנוגדן מכתים הצעות הניראות של הגלמים, פלטפורמה עדינה נדנדה השחלות על "Nutator". בהתבסס על פרוטוקול עבור השחלה זחל יחליט על ידי מימון, גלבוע14, ריכוז גבוה יחסית של טריטון X-100 ננקטה השלבים הראשונים של התהליך מכתימים כדי למקסם את קרום התא permeabilization נוגדנים גישה תאים בשחלות.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Forceps, biology</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen</td><td></td></tr><tr><td>9 Depression Glass Spot Plates</td><td>Pyrex</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet bulb</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm glass coverslips No 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine brush #0, #3-#5</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman Starter Kit</td><td>Thomas Scientific</td><td>F167300</td><td>Contains p20, p200, p1000 pipettors</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Dilute to 1x PBS</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>5000121</td><td>Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)</td><td>Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)</td><td>Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Fly vials</td><td>Denville Scientific</td><td>V9406</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Balls, For Wide Vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-102W</td><td></td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>101400</td><td></td></tr><tr><td>Fly food</td><td>Produced in laboratory</td><td></td><td>Mixture of water, brewer&#039;s yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid</td></tr><tr><td>Male and female &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and staining of drosophila pupal ovaries

בניגוד למבוגרים דרוזופילה שחלות, השחלות הגולמי קשים יחסית לגשת ולבדוק עקב שלהם קטן בגודל, טבלתי ו בפסליו בתוך תיק הגולמי. האתגר של לנתח השחלות הגולמי טמון גם המיקום הפיזי שלהם בתוך הגולם: השחלות מוקפים תאי שומן הגוף בבטן הגולמי, ויש להסירו תאי שומן אלה כדי לאפשר נוגדן המתאים מכתים. כדי להתגבר על האתגרים הללו, פרוטוקול זה מנצל pipets פסטר מותאם אישית כדי לחלץ את תאי הגוף שומן מהבטן הגולמי. יתר על כן, coverglass chambered משמש במקום צינור microcentrifuge במהלך תהליך צביעת כדי לשפר את הראות של הגלמים. עם זאת, למרות אלה, יתרונות נוספים של הכלים המשמשים פרוטוקול זה, ביצוע מוצלח של טכניקות אלה עשוי עדיין לכלול מספר ימי תרגול בשל גודלו הקטן של השחלות הגולמי. השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה יכול לחול על זמן הקורס ניסויים שבהם מנותחים השחלות בשלבים שונים של פיתוח הגולמי.

ביצוע מוצלח של הליך זה צריך לגרום נוגדן ברור מכתים החושפת את המבנה ואת הארגון הסלולר של השחלה הגולמי דרוזופילה . אימונוהיסטוכימיה המתוארות ב פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות סוגי תאים בדרך כלל צבעונית של השחלות זחל ומבוגרים. תאים של הקנה הגולמי המופק נחיל תאים18 (שתואר על ידי Fasciclin השלישי בלבן) מוצגים באיור3. בנוסף סימון הארגון הסלולר של השחלות הגולמי, נוגדן מכתים ספיציפית התפשטות תאים (כגון פוספו-היסטון H3 צביעת איור 3, מוצגים בירוק) יכול לשמש כדי ללמוד דפוסי חלוקת התא של תאי גזע ועוד סוגי תאים mitotically פעיל. אם הנוגדן פלורסנט אותות חלשים כאשר בחן תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, סביר להניח כי השחלות לא מספיק נחשפו הנוגדנים בשל החילוץ לא מספיק שומן הגוף בבטן הגולמי. אפשרות אחרת ייתכן כי הפתח שק הגולמי קרס במהלך ההכתמה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56779/56779fig1.jpg"> איור 1: השוואה Side-by-side של זכר מול נקבה הזחלים. (א) זחל זכר בפתרון PBS המזוהה על-ידי זוג האשכים שקופה, מלבני ממוקם כשני שליש במורד מסופה הקדמי. (B) הנקבה זחל בפתרון PBS המזוהה על-ידי העדר של האשכים גדולים, שקוף. גודל ברים = 2 מ מ. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56779/56779fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56779/56779fig2.jpg"> איור 2: ניתוח של השחלות הגולמי לאחר אימונוהיסטוכימיה. (א) תמונה של זוג מפוספס, שקוף הגולמי שחלות (עיגולים אדומים) הוסרה מן השק בטן בעת אימונוהיסטוכימיה מכתים. השחלות הגולמי היו גזור כ 48 שעות APF. תאי שומן הגוף הנותרים (חץ שחור) זה לא חולצו בשלב 3.6 מופצים ב- PBS פתרון. (B) דימוי השחלה הגולמי יחיד בפתרון PBS גזור כ 48 שעות APF. גודל ברים = 100 מיקרומטר. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56779/56779fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56779/56779fig3.jpg"> איור 3: ויטראז'ים פראי-סוג השחלה הגולמי גזור 48 שעות APF. תמונה נרכשה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. הכתב מסלול ונ ט, Fz3 RFP8 (אדום), מתבטא בתאים סומטיים הקדמי. נוגדנים ביים לתאים מתאר (לבן) Fasciclin השלישי של הקנה הגולמי. הגרעינים היו counterstained עם דאפי (כחול). פוספו-היסטון H3 מכתים (ירוק) מדגיש תאים עוברים מיטוזה. קווים לבנים אלכסוניים מציינים את הקצוות של התמונה המקורית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56779/56779fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries at JoVE.com

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

dissection-and-staining-of-drosophila-pupal-ovaries

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

9.3K Views.  Columbia University. השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.

Video: Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection of Drosophila Ovaries

Dissection של תסיסנית השחלות

Biology

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי<em&gt; תסיסנית</em&gt; שחלות

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video