עבודה זו נתמכה על ידי פריז VI אוניברסיטת ומענק חדשנות פייר פאבר.

כל הנהלים בוצעו בהתאם לתקני הקהילה האירופית לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה, באישור ועדת האתיקה המקומית לניסויים בבעלי חיים (Ile de France-פריז-הוועדה, הרשאה 4270). 1. הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות מנה קטלנית של pentobarbital (עד 1 מ&quot;ג / 10 g משקל הגוף) intraperitoneally (מחט G27 עם מזרק 1 מ&quot;ל) לתוך עכברים בוגרים לפני הניתוח. </li></ol> זלוף כלי 2. הערה: אין צורך להחיל משחת וטרינר לעיניים במהלך זלוף כלי. הליך זה הוא מהיר (5-10 דקות) ומסתיים במותו של החיה. אשר את חוסר התגובה עם קמצוץ הבוהן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים איריס, עושים חתך, באורך של 4 ס&quot;מ, לתוך הקיר הצפק הבטן, ממש מתחת לצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן (בגודל כמה מילימטרים) ב הסרעפת ואז continuדואר החתך של הסרעפת לאורך כל אורכו של בית החזה כדי לחשוף את חלל פלאורלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את החזה משם מהדק את הקצה של עצם החזה עם hemostat; למקם את hemostat על הצוואר. בזהירות לחתוך את רקמת שומן חיבור עצם החזה אל הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את המחט זלוף 15-מד דרך החדר השמאלי לתוך הקודקוד של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להשתמש במספריים לחתוך אחד האונה של הכבד ליצירת פורקן. הערה: יציאה חלופית ניתן ליצור באמצעות מספרי איריס ליצור חתך אל העלייה הימנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse החיה עם 25 עד 50 מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS) עם משאבה ההפעלה בשיעור של 2.5 מ&quot;ל / דקה. הכבד צריך להלבין כשהדם מוחלף PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כחמש דקות, אחרי שהנוזל מהכבד ברור לחלוטין, להפסיק זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם immunostaining או מכתים קבוע מתוכנן, perfuse החיה עם 50 מ&quot;ל של paraformaldehyde(PFA; 4% ב PBS) במשך 15 דקות. הערה: שימו לב, אדי PFA רעילים. זלוף של החיה עם PFA צריך להתבצע במנדף מאוורר. </li></ol> 3. בידוד של המוח ואת המעגל ויליס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הראש עם זוג מספריים כירורגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו אמצע עם מספרי איריס, לאורך העור מהצוואר אל האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת ולהסיר כל שרירי שיורים ורקמות שומן עם איריס מספרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקצה החד של איריס מספריים לתוך מגנום foramen בצד אחד ובזהירות להחליק אותם על פני השטח הפנימי של הגולגולת אל meatus השמיעה החיצונית (הידוע גם בשם תעלת האוזן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את החתך מתואר 3.1.4 בצד הנגדי ולעשות קו אמצע לחתוך לאורך המשטח הפנימי של העצם בין הקודקודית תחילת תפר sagittal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתול הקשתיתמספרי העצם הפרונטלית, ישר בין העיניים, ב תפר sagittal ולאחר מכן לפתוח אותם לפצל את הגולגולת לשתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את המוח, תופס את נורות חוש הריח באמצעות מספרי איריס לנתק את הקשרים העצבים על פני שטח הגחון שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח ולמקם אותו בצלחת פטרי 60 מ&quot;מ המכיל PBS קר כקרח לבידוד פרה. לחלוטין לטבול את המוח PBS. אם המוח היה קבוע עם PFA 4% (עבור חתך עתידי immunostaining או מכתים רגיל), לשמור אותו באמבט של 4% PFA ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של המעגל ויליס הערה: מיקרוסקופ לנתח נדרש בידוד פרה. המוח צריך להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך כולו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את המוח במהופך (כלומר, על פני השטח הגבי שלה) כדי להמחיש את הפרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים קטנים לתפוס את עורקי המוחין הקדמיים (ACA) בבסיס של אונות הרחה ( <strאונג&gt; a, איור 1) ולהפעיל לחץ כדי לנתק אותם מרצף הכלי. השתמש באותו ההליך לחתוך את עורקי המוח האמצעיים (MCA) ב ב (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הקצוות החדים של מלקחיים כדי להרים ולהסיר את העורקים הגדולים להרכיב את הפרה מהקורטקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את תחילת עורקי תקשורת האחורית (PCA) לנתק אותם מהמוח, על ידי אחיזת עורקי המוח האמצעיים (MCA) עם המלקחיים. תרים את העורקים הקדמיים (ACA ו MCA) ולמשוך אותם בעדינויות על אופטיים התצלובת בכיוון קדמי-הגבה. כדי למנוע הפרעה של פרה, להפסיק את ההליך להתמודד עם העורקים האחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.2.2 ו 3.2.3 עבור העורקים במוח הקטנים המעולים אחוריים (SCA) / (PCA) (ג, איור 1) ו עבור עורק הבסיס (BA) (ד, איור 1), מושכים אותם dorsal- כיוון קדמי. תפסיק בסוף של i ההליך המתוארn 3.2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפרה כולה על ידי משיכת בעדינות עם מלקחיים. מניח את הפרה בצלחת 60 מ&quot;מ פטרי מלא PBS קר כקרח להסיר את כל רקמת מוח מצורפת הנותרים עם שני מלקחיים, מחזיק פרה במקום עם סיכות קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הפרה שנקטפו ב -80 ° C לעיבוד שלאחר מכן לטיהור RNA (תשואות מיצוי RNA כמויות גדולות של RNA - כ 500 ng) או מיצוי חלבון. הערה: ניתן לשמור את פרת vivo לשעבר למשך 24 שעות, על ידי התאמת מערכת אמבטית האיבר שפותחה עבור עורק הרחת עכבר מבודד 7. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> איור 1: תרשים סכמטי של צפה גחון של מוח עכבר הדגשה פרה פרה נוצר משני עורקי התרדמה הפנימיים (MCA), אשר נגזרים משני עורקי המוחין הקדמיים (ACA);. basilarעורק (BA) סניפים לתוך האחורי (PCA) מעולה (SCA) עורקים מוחיים, ושני עורקים בחוליות (VA).

<ol>
	<li>Beckmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cerebrovascular+abnormalities+and+blood+flow+disturbances+in+APP23+mice+modeling+Alzheimer's+disease.">Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).</li><li>Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+factors+effecting+cerebral+aneurysm+pathophysiology.">Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology.</a> Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).</li><li>Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+mechanisms+of+intracranial+atherosclerosis.">Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis.</a> Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).</li><li>Tulamo, R., Fr&#246;sen, J., Hernesniemi, J., Niemel&#228;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+changes+in+the+aneurysm+wall:+a+review.">Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review.</a> J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).</li><li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+amyloid+angiopathy:+emerging+concepts.">Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts.</a> J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).</li><li>Oy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+atherosclerotic+stroke:+specific+focus+on+the+metabolic+syndrome+and+inflammation.">Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation.</a> Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).</li><li>Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+model+for+the+study+of+cerebrovascular+function+utilizing+isolated+mouse+olfactory+artery.">Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery.</a> J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).</li><li>Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+murine+intracranial+aneurysm+model:+aneurysm+formation+and+rupture+by+elastase+and+hypertension.">Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension.</a> J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).</li><li>Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebrovascular+cells+as+a+cell+culture+model+for+cerebral+amyloid+angiopathy:+isolation+of+smooth+muscle+and+endothelial+cells+from+mouse+brain.">Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain.</a> Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).</li><li>Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+vascular+endothelial+cells+from+mice.">Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).</li><li>Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transcript+analysis+in+small+quantitiesof+mRNA+by+SAGE-Lite.">Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite.</a> Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).</li><li>Badhwar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stanimirovic,+Hamel,+&amp;+Haqqani+The+proteome+of+mouse+cerebral+arteries.">Stanimirovic, Hamel, &amp; Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).</li><li>Castro, L., Brito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+neurones+have+a+specific+ability+to+respond+to+phasic+dopamine+release.">Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release.</a> J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).</li><li>H&#252;bscher, D., Nikolaev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+mice+expressing+FRET+biosensors.">Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors.</a> Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנו מתארים כאן פרוטוקול לשחזור עבור הבידוד של המעגל ויליס. הפרעות כלי הדם במוח ביותר הנפוצות הכוללות פרה הם vasculopathies CAA קשור, טרשת עורקים תוך גולגולתי מפרצה תוך-גולגולתי, שכולן משפיע על דפנות כלי דם העורקיים. גורמי הסיכון ידועים, אבל בפתוגנזה המולקולרי של הפרעות המוחין האלו נשאר ממעטים להבין וסמנים ביולוגיים ספציפיים לניבוי להתרחשותם חסרים. יש עניין רב בשיטות לבידוד הפרה מעכברים מהונדסים לקשר תצפיות מקרוסקופית עם שינויים מולקולריים. לדוגמה, על ידי גרימת מפרצת עקבית במודל של עכברים שבו גן מסוים הוא דפק החוצה (כפי שתואר על ידי Hosaka et al. 8) וניתוח פרה, זה צריך להיות אפשרי כדי לקבוע אם טיפולים מיקוד החלבון המקודד על ידי הגן הזה יכולים למנוע מפרצת תוך-גולגולתי ו / או דימומים תת-עכבישי. Obviouערמומי, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לנתח את ההשפעה של תרופה מסוימת על התקדמות vasculopathies הקשורים CAA במודלים של מחלת אלצהיימר העכבר המהונדסים השונים. קל יותר לבודד עורקי עכבר מאשר לטהר microvessels עכבר כולו, אבל דגימה כזה היא בכל זאת קשה יותר בעכברים מאשר בחולדות. אכן, פרת העכברוש מוטבעת קרומי מוח הרבה נוקשים, מה שהופך אותו ניתן לבודד את המבנה כולו בבת אחת. בנוסף לבעיית הגודל הקטן של כלי בעכברים, הליך זה הוא גם מסובך בשל השקיפות של כלי הבאים זלוף שלהם עם PBS לפני הרחקתו של המוח. לפיכך, אנו ממליצים להתאמן בלי עירוי, החל משלב 3 אחרי הרדמה כדי להקל להבחין בכלי הדם. לבסוף, כמו כלי מוחות עכבר הם מאוד עדינים לשבור בקלות, לנתיחה צריכה להתבצע בזהירות רבה, בלי למהר, כדי להבטיח כי המבנה כולומבודד בחתיכה אחת, על ידי גרירה של ACA הראשון. טוהר הכנת פרא יכול להיות מוערך על ידי השוואת רמות ביטוי של הגנים העצביים וכלי. בעזרת תרגול, פרה אחת מספקת RNA מספיק רק לחקר 5 - 10 ביטויי גנים. להקרנה בקנה מידה גדולה, פרות עכבר כמה צריכים להיות ונקווה. גוטייה et al. 9 תיאר שיטה לבידוד חתיכות קטנות של microvessels (מבוסס על השימוש collagenase / dispase לעכל שברי המוח של חרוזי זכוכית כדי ללכוד אותם) כי התשואות שריר חלק או תאי אנדותל שאפשר לקיים בתרבות כאשר להציב מדיום מתאים. היתרון של השיטה שלנו הוא שזה מבודד כלי גדול, מבלי לשנות מבנה כלי שיט. דיסקציה של ענפים ספציפיים של פרה יכולה להיות גם עניין, כדי לקבוע את הקשר בין פרופיל ביטוי גנים של סניף מסוים רגישות ניתן diseas כלי דם במוחes, כגון מפרצת תוך-גולגולתי. גישות אלה עשויות לספק הסבר באשר למה כמה וריאציות אנטומיות גנטיות ACA מתואמות עם שכיחות גבוהה יותר של מפרצת ACA. דיסקציה זה מחייב לחץ כדי להיות מופעל עם מלקחיים בבסיס של כל סניף מסוים, כדי לנתק אותה מן הרשויות האחרות, בתחילת הליך הבידוד פרה. לפיכך, בנוסף לעובדה שיהיה ניתן להפיק תאים מהפרה 10 או להקרין על ביטוי גנים 11 וחלבון ייצור 12 או שינויי חלבון posttranslational, שיטה זו יכולה לשמש למחקרי vivo לשעבר, פשוט על ידי התאמת מערכת אמבטית האיבר שפותחה עבור עורקי הרחת עכבר מבודד. 7 לאחר דגירה של הפרה השלמה אנטיביוטיקה המכילה בינוני התרבות, secretome שפורסם על ידי המבנה הספציפי הזה ניתן להשיג ונותח. מניתוח secretome זה בעכברי מודל של CAA יעשה את זה פוssible, למשל, כדי לקבוע את המצב הדלקתי הקשורות CAA מעורקים אלה. המדיום המותנה שייוצר תוכל לשמש גם כדי לקבוע את ההשפעות של secretome על כל הפנוטיפ סוג תא כלי קיר. הכנות פרה הפתולוגי גם יכולות לשמש כדי לזהות הבדלים אפשריים אותות ביוכימיים, כגון monophosphate guanosine המחזורי (cGMP), monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP), או Ca 2 + ריכוזים, לזיהוי עם תהודת העברת אנרגית פלואורסצנטי (סריג) biosensors המבוסס. Biosensors נמסר וירוס שנוצל על הכנות פרוסות מוח המכילות נוירונים חיים בוגרים נגישים באופן ניסיוני עם מורפולוגיה נשמרה, מה שמוביל לגילוי הבדלים עמוקים בתגובת D1 בין עצב פירמידליים בקליפת המוח ונוירונים קוצני בינוני striatal. 13 המודלים של ומחלות כלי דם במוח בעכברים טרנסגניים המבטאים חלבוני חיישן שליח שני מבוסס סריג 14עבור הדמיה של אותות ביוכימיים פרה מבודד צריך עוד לספק תובנה נוספת לתוך ביוכימיה, פתופיזיולוגיה, וטיפול תרופתי של מחלות אלו.

מעגל עורקי המוח (cerebri arteriosus סירקולוס), הידוע גם בשם מעגל ויליס (פרה), הלולאה של מצולע Willisor וויליס) תואר לראשונה על ידי תומס וויליס 1664. זוהי השקת דם הממוקמת ברחבי האופטי chiasma וההיפותלמוס שיכולה להיחשב כמרכז באספקת הדם למוח ומבנים שמסביב. דם נכנס המבנה הזה דרך התרדמה הפנימית ועורק בחוליות והוא זורם אל מחוץ למעגל באמצעות באמצע הפנים ועורקי מוחות אחוריים. כל אחד העורקים האלה על ימין ועל שמאל סניפים משני צדי המעגל. יעביר basilar, פוסט, ו קדמי תקשורת עורקת לסגור את המעגל (איור 1 ואיור 2). הסיכון של זרימת דם לקויה בכל עורקי היצוא ממוזער על ידי המיזוג של דם הנכנסים למעגל מן התרדמה ועורק מוחות, דבר המבטיח כי דם מספק מסופק בגֶשֶׁם. מבנה זה משמש גם הנתיב העיקרי עבור זרימת הדם בטחונות במחלות occlusive חמורה של עורק התרדמה הפנימי. ישנם מספר סוגים של הפרעות כלי דם במוח יש מוצאם של פרה. הנפוצים ביותר הם angiopathy עמילואיד מוחין (CAA) vasculopathies -associated, טרשת עורקים תוך גולגולתי מפרצת תוך-גולגולתי. 1, 2, 3 הפרעות אלה עשויים להוביל hypoperfusion בשל התרחבות, וכן תוך-מוחי ו / או תת-עכבישי דימומים בסופו של דבר לתרגם שבץ איסכמי או המורגי או , במקרה הטוב, התקף איסכמי חולף. התקדמות בבדיקות אבחנתיות, כולל הדמייה, ואולי בשילוב עם אנגיוגרפיה, הפכה אותו ניתן לאבחן מחלות כלי דם במוח גדולות האלה קליניות, ללא הצורך בביופסית מוח. אף על פי כן, טיפולים יעילים וספציפיים (תרופתיים או endovascular) חסרים כיום ולכן יש צורך להגדיר חדשמטרות מולקולריות. זיהוי מטרות תרופה חדשנית למניעת מחלות אלה בבני אדם ידרוש במודלים של בעלי חיים ודרכי לבודד את כלי הדם Cerebro כולל פרה. מודלים כאלה צריכים לספק ראיות ורמזים על השינויים הספציפיים, כוללים שינויים דלקתיים, המתרחשים קירות הכלי הגדול במודלים של בעלי חיים של מפרצת עורקים תוך גולגולתי, CAA או טרשת עורקים תוך גולגולתי. 4, 5, 6 הקמנו שיטה לבידוד העכבר פרה כדי להקל מחקרים של דלקת בכלי במחלת האלצהיימר (AD) ומחלות הקשורות, כגון CAA. שיטה זו לבידוד פרה עכבר פותחתה עבור ההערכה של ביטוי גני כלי דם במוח דלקתי במהלך התקדמות מחלה. יחד עם זיהוי של בתצהיר עמילואיד בטא בתוך דפנות העורקים leptomeningeal ו pial, שיטה זו יכולה להקל להרתיעשלי הקשר האפשרי בין ביטוי גנים דלקתיים בקיר Cerebro-כלי הדם וצבירת Aβ-פפטיד. רשת כלי הדם של המוח, כולל leptomeningeal ו pial במרחב תת-עכבישי, הוא הרחבה של העורקים הגדולים ויוצרים מעגל ויליס. השיטה המתוארת כאן יכולה לשמש כדי לבודד את הפרה של כל שושלת עכבר יכולה לשמש לכל סוגי הקרנה (למשל, ביטוי גנים, ייצור חלבונים ושינויי חלבון posttranslational) על הכלי הגדול של כלי הדם-Cerebro עכבר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">D8537</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Dumont #55 Forceps</td>
			<td style="width:173px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:173px;">11295-51</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Hardened Fine Iris Scissors&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:173px;">14090-11</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Scissors - Straight / Sharp / Sharp&#160;&#160; 16.5 cm</td>
			<td style="width:173px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:173px;">14002-16</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Dumont #7b Forceps&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:173px;">11270-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Stereoscopic Zoom Microscope</td>
			<td style="width:173px;">Nikon</td>
			<td style="width:173px;">SMZ745T</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">CellBIND Surface 60mm Culture Dish</td>
			<td style="width:173px;">Corning</td>
			<td style="width:173px;">#3295</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Peristaltic Pump - MINIPULS 3</td>
			<td style="width:173px;">Gilson</td>
			<td style="width:173px;">M312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Pentobarbital Sodique</td>
			<td style="width:173px;">Ceva Sant&#233; Animale</td>
			<td style="width:173px;">FR/V/2770465 3/1992</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for isolating the mouse circle of willis

מעגל עורקי המוח (cerebri arteriosus סירקולוס) או המעגל ויליס (פרה) הוא השקת דם המקיפה את ראיית chiasma וההיפותלמוס המספק דם למוח והמבנים שמסביב. זה היה מעורב בכמה הפרעות כלי דם במוח, כולל angiopathy עמילואיד מוחין (CAA) vasculopathies -associated, טרשת עורקים תוך גולגולתי מפרצת תוך-גולגולתי. מחקרים של המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות אלו לזיהוי מטרות תרופה חדשניות למניעה שלהם דורשים במודלים של בעלי חיים. חלק מן המודלים האלה עשויים להיות מהונדס, ואילו אחרים יהיו כרוכים בידוד של כלי הדם-Cerebro, כולל שיטת CoW.The המתוארת כאן מתאים בידוד פרה בכל שושלת עכבר ויש לו פוטנציאל רב הקרנה (ביטוי של גנים, ייצור חלבונים, שינויי חלבון posttranslational, ניתוח secretome, וכו &#39;) מחקרים על הכלי הגדול של העכבר cerebro-כלי דם. זה יכול לשמש גם עבור מחקרי vivo לשעבר, על ידי התאמת מערכת אמבטית האיבר שפותחה עבור עורקי הרחת עכבר מבודדים.

<html> העכבר PBS-perfused נהרג והפרה מבודדת כמפורט בסעיף 3.2 של הפרוטוקול. כאשר לנתיחה מבוצעת כהלכה, פרה צריך לצאת בחתיכה אחת צריך להיות שקוף מעט בשל היעדר הדם שיורית בכלי הדם. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> איור 2: פרה העכבר לאחר בידוד. (א) סקירה של הפרה בצלחת 10 ס&quot;מ פטרי. (ב) פירוט הענפים השונים של פרה. MCA לעורקי המוח אמצעיים, ACA עבור מעורקים קדמיים, BA עבור עורק בסיס, PCA עבור האחורי העורקים מוחות SCA עבור מעורקים מעולים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54352/54352fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> אוהל. &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; ניתן לבדוק על ידי הבטחה כי גנים וסקולרית ספציפיים מתבטאים בחריפות ואילו הביטוי של גנים עצביים ניתן לגילוי באופן ספציפי יותר, ניקה פרה צריך טוהר ההכנה פרה במיוחד להביע סמני תא שריר חלק בכלי דם, כגון יקטין שריר חלק (SMA), שרשרת כבדת שריר-שרירן חלק (SM-MHC) ו smoothelin. סמנים אלה באים לידי ביטוי בקושי בחלקים אחרים של המוח. דפוס מול הביטוי צריך להיות המתקבל עבור גנים עצביים, עם סמנים עצביים (ש&quot;א, MAP2) רק בקושי מורגשים על פרה. רמות של mRNA ניתן להעריך על ידי RT-qPCR עם יחסי נורמליזציה תמליל הגן התייחסות (כאן, כי של GAPDH). תוצאות אופייניות מוצגות באיור 3A ו- B. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig3.jpg" /&gt; איור 3:. ביטוי של עצב התכווצות גני עכבר המעגל ויליס מוח תוצאות RT-qPCR היו מנורמלים נגד אלה עבור גן התייחסות (GAPDH). הם באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית התקן של 6 עד 12 ניסויים בלתי תלויים; השוואה של פרה עם המוח: ns, לא משמעותי, *, P &lt;0.05, **, P &lt;0.005, ו ***, P &lt;0.001 (א) ביטוי של גני התכווצות:. SMA (יקטין שריר חלק), smoothelin, SM-MHC (שרשרת כבדת שריר-שרירן חלק 11) ו- E-selectin (B) ביטוי של גנים עצביים:. ש&quot;א (גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין) ו MAP2 (חלבון microtubule הקשורים 2). דפוס הביטוי של E-selectin סמן אנדותל במוח חסר הפרה דומה מאוד לזו המתקבלת עבור דגימות פרה, שכנראה משקפת את קיומה של רשת נימי המוח. <strong&gt; טבלת 1 מפרט את מספרי Cp הממוצעים עבור כל תמליל. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> א. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> Cp Mean </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> SMA </td><td colspan="3"> Smoothelin </td><td colspan="3"> SM-MHC </td><td colspan="3"> E-Sel </td></tr><tr><td> מתכוון </td><td> SD </td><td> N </td><td> מתכוון </td><td> SD </td><td> N </td><td> מתכוון </td><td> SD </td><td> N </strong&gt; </td><td> מתכוון </td><td> SD </td><td> N </td><td> מתכוון </td><td> SD </td><td> N </td></tr><tr><td> פָּרָה </td><td> 20.86 </td><td> 0.93 </td><td> 12 </td><td> 22.02 </td><td> 0.67 </td><td> 12 </td><td> 25.29 </td><td> 1.89 </td><td> 12 </td><td> 23.37 </td><td> 0.80 </td><td> 12 </td><td> 30.56 </td><td> 1.66 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> מוֹחַ </td><td> 18.71 </td><td> 0.72 </td><td> 6 </td><td> 33.91 </td><td> 2.06 </td><td> 6 </td><td> 31.08 </td><td> 3.17 </td><td> 6 </td><td> 26.05 </td><td> 0.73 </td><td> 6 </td><td> 28.45 </td><td> 0.63 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> ב </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> Cp Mean </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> MOG </td><td colspan="3"> MAP2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מתכוון </td><td> SD </td><td> N </td><td> מתכוון </td><td> SD </td><td> N </td><td> מתכוון </td><td> SD </td><td> N </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> פָּרָה </td><td> 21.04 </td><td> 0.41 </td><td> 6 </td><td> 32.13 </td><td> 1.63 </td><td> 6 </td><td> 30.21 </td><td> 0.85 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מוֹחַ </td><td> 19.09 </td><td> 0.49 </td><td> 6 </td><td> 26.43 </td><td> 0.88 </td><td> 6 </td><td> 23.30 </td><td> 0.99 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1:. Mean נקודה מעבר עבור הביטוי של גנים עצביים ואת ההתכווצות של עכבר המעגל ויליס מוח חישובים מבוססים על השוואה של המחזור המדויק שקבע מעברים (CP) ברמה קבועה של קרינה. נקודת המעבר היא מספר המחזור המתאים נגזר השנייה המקסימלי של עקומת ההגברה. ערכי Cp גבוהים קשורים עם רמות נמוכות יותר של ביטוי. עבור גן מסוים, נחשב ביטוי שלא היה ניתן להבחין אם Cp עולה 35. (א) Cp של גן ההתייחסות: GAPDH; ושל גני התכווצות: SMA, smoothelin, SM-MHC ו- E-selectin (B) Cp של הגן התייחסות:. GAPDH; וגנים עצביים: MOG ו MAP2.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis at JoVE.com

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

פרוטוקול בידוד לחוג עכבר של וויליס

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

protocol-for-isolating-the-mouse-circle-of-willis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.0K Views.  Sorbonne Universités. We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Video: Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

התקן TMS NeuroStar: ניהול ה-FDA פרוטוקול מאושר לטיפול דיכאון

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

בידוד באף גזע תאים חוש הריח של מכרסמים או בני אדם

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex three-dimensional retinal blood vessels and capillaries by creating a two-dimensional flat-mount of the interconnected vascular channels after digestion of the non-vascular components of the retina. This allows one to study various pathologic vascular changes, such as microaneurysms, capillary degeneration, and abnormal endothelial to pericyte ratios. However, the method is technically challenging, especially in mice, which have become the most widely available animal model to study the retina because of the ease of genetic manipulations 6,7. In the mouse eye, it is particularly difficult to completely remove the non-vascular components while maintaining the overall architecture of the retinal blood vessels. To date, there is a dearth of literature that describes the trypsin digest technique in detail in the mouse. This manuscript provides a detailed step-by-step methodology of the trypsin digest in mouse retina, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Trypsin digest is one of the most commonly used methods to analyze retinal vasculature. This manuscript describes the method in detail, including key alterations to optimize the technique and remove the non-vascular tissue while preserving the overall architecture of the vessels.

טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, hippocampus, and the associated parahippocampal regions (perirhinal, entorhinal,&#160;and parahippocampal proper). Unlike most other tracing protocols available, typically focusing on certain MTL areas (e.g., amygdala and/or hippocampus), the integrative perspective adopted by the present tracing guidelines allows for clear localization of all MTL subregions. By integrating information from a variety of sources, including extant tracing protocols separately targeting various MTL structures, histological reports, and brain atlases, and with the complement of illustrative visual materials, the present protocol provides an accurate, intuitive, and convenient guide for understanding the MTL anatomy. The need for such tracing guidelines is also emphasized by illustrating possible differences between automatic and manual segmentation protocols. This knowledge can be applied toward research involving not only structural MRI investigations but also structural-functional colocalization and fMRI signal extraction from anatomically defined ROIs, in healthy and clinical groups alike.

The present work provides a comprehensive set of guidelines for manually tracing the medial temporal lobe (MTL) structures. This protocol can be applied to research involving structural and/or combined structural-functional magnetic resonance imaging (MRI) investigations of the MTL, in both healthy and clinical groups.

מקיף פרוטוקול לפילוח ידני של מבנים המדיאלי Temporal האונה

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to perform receptor autoradiographic mapping.
Tissue specimens are harvested and stored at -80 &#176;C. A cryostat is used to coronally section the tissue (brain) and thaw-mount the sections onto charged slides. The slide-mounted tissue sections are incubated in 125I-SI-Ang II to radiolabel Ang II receptors. Adjacent slides are separated into two sets: &#39;non-specific binding&#39; (NSP) in the presence of a receptor saturating concentration of non-radiolabeled Ang II, or an AT1 Ang II receptor subtype (AT1R) selective Ang II receptor antagonist, and &#39;total binding&#39; with no AT1R antagonist. A saturating concentration of AT2 Ang II receptor subtype (AT2R) antagonist (PD123319, 10 &#181;M) is also present in the incubation buffer to limit 125I-SI-Ang II binding to the AT1R subtype. During a 30 min pre-incubation at ~22 &#176;C, NSP slides are exposed to 10 &#181;M PD123319 and losartan, while &#39;total binding&#39; slides are exposed to 10 &#181;M PD123319. Slides are then incubated with 125I-SI-Ang II in the presence of PD123319 for &#39;total binding&#39;, and PD123319 and losartan for NSP in assay buffer, followed by several &#39;washes&#39; in buffer, and water to remove salt and non-specifically bound radioligand. The slides are dried using blow-dryers, then exposed to autoradiography film using a specialized film and cassette. The film is developed and the images are scanned into a computer for visual and quantitative densitometry using a proprietary imaging system and a spreadsheet. An additional set of slides are thionin-stained for histological comparisons.
The advantage of using receptor autoradiography is the ability to visualize Ang II receptors in situ, within a section of a tissue specimen, and anatomically identify the region of the tissue by comparing it to an adjacent histological reference section.

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control neuroplastic processes and correct abnormal function, or even shift functions from damaged tissue to physiologically healthy brain regions, hold the potential to dramatically improve overall health. Of the current neuroplastic interventions in development, neurofeedback training (NFT) from functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) has the advantages of being completely non-invasive, non-pharmacologic, and spatially localized to target brain regions, as well as having no known side effects. Furthermore, NFT techniques, initially developed using fMRI, can often be translated to exercises that can be performed outside of the scanner without the aid of medical professionals or sophisticated medical equipment. In fMRI NFT, the fMRI signal is measured from specific regions of the brain, processed, and presented to the participant in real-time. Through training, self-directed mental processing techniques, that regulate this signal and its underlying neurophysiologic correlates, are developed. FMRI NFT has been used to train volitional control over a wide range of brain regions with implications for several different cognitive, behavioral, and motor systems. Additionally, fMRI NFT has shown promise in a broad range of applications such as the treatment of neurologic disorders and the augmentation of baseline human performance. In this article, we present an fMRI NFT protocol developed at our institution for modulation of both healthy and abnormal brain function, as well as examples of using the method to target both cognitive and auditory regions of the brain.

The ability to induce and/or control neural plasticity may be critical in future treatments for neurologic disorders and the recovery from brain injury. In this paper, we present a protocol on the use of neurofeedback training with functional magnetic resonance imaging to modulate human brain function.

פרוטוקול עבור fMRI ניהול בזמן אמת Neurofeedback אימונים

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...