This work was supported by NIH Grant HL-113905

הנהלים כל חיה שהתקיימו לצורכי מחקר זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש של נובה אוניברסיטת מזרח בהסכמה עם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, 8 מהדורה עשירית (סוכנות הידיעות האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 2011 ). 1. סעיפי רקמות הכנות לקראת קולטן autoradiography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הקרבה, רקמות המוח הקציר טרי, ועוטפים בנייר אלומיניום ומכניסים -20 ° C במקפיא בהקדם האפשרי. כדי לשמור על הצורה הנכונה, למקם את המוח בתוך תבנית המוח המדמה את החלק הפנימי של הגולגולת, לעטוף בנייר אלומיניום ומכניסים - 20 ° C במקפיא. לאחר 30 דקות, רקמות מקום בתוך שקית אחסון במקפיא סגר ולעבור במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח ארוך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את דגימת רקמות הקפואה של עניין מן המקפיא -80 מעלות צלזיוס, ולהעביר cryostat להגדיר עד למינימום של 10 מעלות צלזיוס לכל היותר -18 ° C, כדי למנוע הפשרה. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הדגימה על מרקמם הר עם גליקול ובינוני הטבעה מבוססת שרף, הטמעה רק חלק קטן של הדגימה לתוך המדיום. עבור מוח, המוח הוא רכוב אנכי כדי לאפשר חתך במישור העטרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רקמת הר על microtome בתוך cryostat והדק במקומו. ודא צד שמאל וימין של המוח נמצאים באותו הקואורדינטות אנטרו-postero, וכי הציר dorso- הגחון הוא בניצב אטלסים המוח נפוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין חיתוך ב לעובי הרצוי (20 מיקרומטר מומלץ) ולהפשיר הר בסעיפים גבי שקופיות מיקרוסקופ בכיוון אנכי יש שטח פנים גדול יותר של שטח בשקופית. אסוף חלקים על גבי שקופיות בסטים רציפים של חמש, כלומר את הסט הראשון של שקופיות מסומנים 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, ו 1-5 (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מילוי קבוצה של שקופיות עם קטעים, לאפשר שקופיות לייבוש באוויר עד שעה 1, ולאחר מכן למקם את SLIdes בתיבת שקופיות פלסטיק בשקית אחסון במקפיא עצמית איטום, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. קולטן autoradiography זהירות: רדיואקטיביות. השתמש לבוש מגן לטפל רדיואקטיביות. המיועדת לסילוק תלוי ממסד, והן חייב לציית להנחיות להירקב כמו שצריך (זמן מחצית חיים 60 ימים) או להיות נטל על ידי חברה מוסמכת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את &quot;-1&quot; ו &quot;-2&quot; שקופיות של עניין מהמקפיא -20 ° C ו הר לתוך אוחז שקופיות (איור 5). הר השקופיות &quot;-1&quot; יחד לטיפול &quot;הלא ספציפי&quot;, ואת השקופיות &quot;-2&quot; לטיפול &quot;הכולל&quot;. &#39;שאינן ספציפיות &quot;צנצנות תכלנה 10 מיקרומטר ריכוזיות סופי של PD123319 AT 2 אנטגוניסט R, ו Losartan AT 1 אנטגוניסט R, במאגר בינוני assay (AM5) (טבלה 1), את&#39; הכוללים &#39;צנצנות מחייב תכלנה רק 10 מיקרומטר PD123319 ב AM5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את השקופיתאוחז למקם את השקופיות לתוך צנצנות Coplin מראש הדגירה מלאים 35-40 מ&quot;ל של AM5, ומעכבי בהתאמה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. התחל סטים עוקבים באמבט טרום הדגירה שלהם ב 4 מרווחי דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר שקופיות מפתרון הדגירה מראש כדי הדיוורים שקופיות הדגירה, המכיל 10 מ&quot;ל של AM5, בתוספת ריכוז קבוע מראש של 125 I-SI-אנג השנייה (מחושב באיור 4) עם מעכבי בהתאמה, עבור 60-90 דקות ב חדר טֶמפֶּרָטוּרָה. אם יש radioligand מספיק, 10 מגלשות ניתן למקם (BACK TO BACK) ב אוחז שקופיות שונה וטופחו עם 125 I-SI-אנג השנייה בצנצנות Coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מחליק בחזרה לתוך אוחז שקופיות (במידת הצורך), כתם, ולשטוף ידי מתערבל בעדינות במשך 1-2 שניות ב -400 מ&quot;ל מים מזוקקים בשני מיכלים נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות ברצף לארבע צנצנות Coplin המכיל 35-40 מ&quot;ל של AM5 בדיוק 1 דקות כל אחד (כפי שמודגם באיור 4 &lt;/ Strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה 1 דק &#39;האחרון, בעדינות מערבולת בסעיפים 1-2 שניות בארבעה שינויים של מים מזוקקים קרים כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את השקופיות עם אוויר קריר (זהירות: אוויר חם volatizes במתחם רדיואקטיבי) באמצעות ארבעה מייבשי שיער להגדיר מזוויות שונות למשך 4 דקות (איור 5), עד שכל החלקים יבשים, ואז למקם על מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שקופיות עם רקמות פונות כלפי מעלה על גבי קרטון עבור פרד לסרטו רנטגן באמצעות סרט דו צדדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר אחד לפחות, כיול יוד 125 שקופית סטנדרטית על כל קרטון (איור 6). הערה: סטנדרטים כיול מורכב להדביק המוח מעורב באופן יסודי עם 125 יוד חייב תרכובת המכילה טבעת פנול, נדחס על ידי צנטריפוגה בתוך מזרק טוברקולין 1 מ&quot;ל, כי הם cryostat מחולק באותו עובי כמו חלקים במוח להפשיר רכוב על גבי מיקרוסקופ שקופיות. לחלופין, 125 תקנים כיול לי בשרף פלסטיק מחולק על 20 עובי מיקרומטר ניתן להשיג באופן מסחרי. שרף הפלסטיק בתקנים אלו חלקית מגן הסרט מן הקרינה כזו כי שקילות רקמות של ~ 40% צריכות להיות בחשבון את הכיול. </li></ol> חשיפת קולנוע 3. ופיתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חושך עם סרט קלטת autoradiography רצועת גב רנטגן. פתח את הקלטת ומקום הקרטון עם מגלשות בפנים (איור 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבות את האור ולהדליק את safelight. בזהירות לפתוח את קופסא סרט X-Ray, להסיר סרט אחד, ומניח את צד מבריק סרט מעלה (עם הקצה המשונן על בפינה הימנית התחתונה) על גבי שקופיות הקלטת. בזהירות לסגור את הקלטת, ולסובב את סורגי הנעילה לאטום את האור (איור 6). לחשוף את השקופיות עבור מספר ימים עד מספר שבועות ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר החושך, לפתוח את הקלטת ולהמשיך עם proc מפתח הסרטESS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את השקופיות במגשים ברציפות; יזם למשך 2 דקות, מים המכילים חומצה אצטית קרחונית 5% למשך 30 שניות, ו מסדר למשך 5 דקות. הסרטים הם מכניסים מגש עם מים זורמים במשך 20 דקות, ולאחר מכן להציב לתוך Photoflo לא יותר מ -10 שניות ותלה. הערה: זמן החשיפה נקבע באופן אמפירי יכול לערב סרטים מרובים עם זמני חשיפה שונים: מספיק זמן כדי לקבל אותות מדידים מאזורים עם נמוך מחייב, אבל לא כל עוד להרוות את הסרט לפי תחומים עם גבוה מחייב. לאחר מתקבלות חשיפות מקובלות, ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא. </li></ol></li></ol> 4. היסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את הכתם thionin ריאגנטים מכתים (טבלה 2, איור 7). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות &quot;-3&quot; במעמד שקופיות, והעברת בסדר רציף החל מים ללא יונים 1 דקות, ואז thionin פתרון כתם במשך 10 דקות ולאחריה שלושה מטבלים לתוך Deionמי ized, לשטוף אחד 30 שניות במי deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות המים, מניחים את מתלה להחליק לתוך שוטף אתנול כדלקמן; 50%, 70%, ו -90% למשך 30 שניות, ואחריו שני שוטף אתנול ב -100% עבור 1 דקות כל אחד. לבסוף, הניחו את מתלה להחליק לתוך קסילן במשך 3 דקות, ולאחר מכן להעביר לידי פתרון קסילן השני במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר שקופית אחת בכל פעם מאמבטית קסילן האחרונה, ולכסות את הקצה העליון של השקופית עם בסיס שרף במדיום הרכבה ממס אורגני, ומקום coverslip 24 מ&quot;מ x 60 מ&quot;מ לשקופית. אפשר שקופיות יבשות מספיק עבור ~ 48 שעות ולאחר מכן סרוק למחשב ב- 2400 בגווני אפור dpi. </li></ol> 5. ניתוח תמונה densitometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את צד מבריק סרט למטה, עם הקצה המשונן על הפינה השמאלית התחתונה ולסרוק באמצעות סורק קניינית מסוגל לשדר את מידע צפיפות סרט ללא כל עיוות במחשב מערכת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את sys הדמית הקנייניםTEM ולנצל הסורגים כיול לקבוע כללים כיול לניתוח densitometric העתיד של התמונות על הסרט (איורים 9 - 12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזורי מידה של עניין או על ידי הקמת תבנית או אמפירי אשר מתווה את תחומי העניין. נתונים נאספו והפרידו מבוסס על סרט, או שליטה או סוג בר (פסק), ובאזור. הקפד לכלול צפיפות (fmol / g), אזור הסריקה, ואזור היעד הכולל במדידות (איור 9). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ברי אזור סריקה ידי והבטיח כי האזור של עניין נופל בין פרמטרים של הדגשה (איור 10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא לתוך גיליון אלקטרוני (לוח 4). הכפל את פעמי הצפיפות באזור היעד הכולל, ולאחר מכן חלק את אזור הסריקה על מנת לקבל את הערך עבור המחייב כי אזור מסוים. ברגע שזה נעשה לכל הערכים שנמדדו, למצע לדגמים הקיימים שאינם ספציפיים ממניין להניב הספציפי מחייב pלְהִתְרַעֵם. ממוצעים עשויים גם להתבצע על ערכים אלה. </li></ol></li></ol>

Robert Speth has licensed antibodies to angiotensin II receptors to a commercial vendor and receives royalties from the sale of said antibodies. The other authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול מתואר מזהה את להדמיה של &#39;הכולל&#39; ו &#39;הלא ספציפי &quot;מחייב של radioligand בסעיפים סמוכים סעיפי עטרה של מוח מכרסם שנקטף בעבר ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, והוא יכול להיות ישים בקלות כמעט בכל רקמה אנטומית פתר substructures אשר להציג כמויות הפרש של קולטנים או אתרי קישור radioligand. הנהלים התואר בתוך הפרוטוקול פשוטים הניתוח הוא קריטי עבור בפירוש תוצאות כראוי. 20 מיקרומטר העובי היה נחוש בדעתו להיות אופטימלי; אם הסעיף עבה מדי הלא ספציפי המחייב יגדל, ולכן קשה לפתור את הכריכה של radioligand למטרתה. אם הקטע הוא חתך דק יותר, הוא הופך להיות קשה לחתוך בהצלחה ולשמור חלקים רציפים ללא עיוות. טמפרטורת החיתוך האופטימלית תשתנה מעט בשל אופיו של הרקמה ואת העובי של חלקים ואניזה בדרך כלל נקבע באופן אמפירי. לאחר יצירת קשרים בין הלהב לבין הרקמות, את הכיוון של הדגימה יכול להיבדק, ומכוון את עצמם מחדש על ידי העברת דגימת הרקמות בחזרה מן הלהב, ושינוי מוכוונות הכדור הגובר. כשמנסרים מוח מכרסם זה קריטי על מנת להבטיח שמאל לצד ימין של המוח נמצאים באותו הקואורדינטות אנטרו-postero, וכי הציר dorso- הגחון הוא בניצב אטלסים המוח נפוץ. סטי שקופיות הם מראש שכותרתו כדי לבצע מחקרים על חלקים סמוכים של רקמות. הסטים הראשונים של 5 מגלשות מסומנים 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, ו 1-5. סעיף החתך הראשון ממשיך שקופיות 1-1 בפינה השמאלית העליונה (זה בפינה הימנית העליונה של השקופית כאשר הוא בצד חלבי למטה); בסעיף לחתוך השני ממשיך שקופיות 1-2, וכו &#39;החלק לחתוך החמישי ממשיך שקופיות 1-5. החלק לחתוך השישי ממשיך שקופיות 1-1 משמאל את החלק הראשון. לאחר הסדרה של השקפים הראשונות מלאה, להתחיל קבוצה נוספת של 5 החליקהes, שכותרתו 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, ו 2-5. מחזור זה נמשך עד בחזרה לתוך המוח לפי הצורך. את &quot;-4&quot; ו &quot;-5&quot; שקופיות נשמרים כגיבוי או radiolabel קולטן שונה. פרוטוקול autoradiography קולטן תלוי radioligand המשמש ואת המאפיינים של קולטנים הנסקרים לשם קביעת הריכוזים של מאגרים, מלחים מעכבים. עבור מדידה של תת-סוג AT1 של קולטנים אנג השנייה בהליך זה, ליגנד שכותרתו גבוהה זיקה יוד-125, 125 I-סאר 1 Ile 8 -Ang השנייה (125 I-SI-אנג II); רדיואקטיבי על ידי רוברט ג Speth, Ph.D. (משאב משותף פפטיד Radioiodination, אוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;טאון), שהוא גם זמינים מסחרית) הוא מומס חיץ AM5 (טבלה 1); חיץ פוספט נתרן כלוריד נתרן, EDTA ו Bacitracin. AM5 מספק הגנה טובה של radioligand מ metallopeptidases ו peptida Bacitracin רגישses מתן pH פיזיולוגי וריכוז NaCl כדי לייעל מאפיינים מחייב. הדגירה טרום ב AM5 חושף את הסעיפים רקמות כדי peptidase inhibitors כדי למזער השפלה radioligand, וגם מנתק אנדוגני אנג השנייה מן הקולטנים אנג השנייה. יריבי Losartan ו PD123319, AT1R ו AT2R, בהתאמה, כי להרוות קולטנים היעד שלהם מתווספים בריכוזים (10 מיקרומטר) כדי למנוע את radioligand מלהיקשר קולטנים אלה להעריך את הלא ספציפיים מחייבים ולהגביל ספציפיים מחייבים לקולטן AT1, בהתאמה. הריכוז הרצוי של 125 I-SI-אנג II עבור assay נקבע ואת דילול הנדרש של פתרון המניות נקבע מגיליון אלקטרוני של קצב הדעיכה רדיואיזוטופיים (ראה פרוטוקול טבלה 3). באופן אופטימלי ריכוז של radioligand בקירוב K D משמש אשר יכבוש 50% של קולטנים הנוכחי. עם זאת, בגלל radioligands יכול להיות דואר ריכוזים יקר תחתון.g. 10-20% של ריכוז D K ניתן להשתמש. יש לכך יתרון פוטנציאלי של הגדלת יחס אות לרעש על ידי צמצום הלא ספציפית מחייב יותר מחייב ספציפית. עם זאת, פעמי חשיפה ארוכות יותר נדרשות לפתח דימוי של הכריכה. כפי שצוין לעיל (סעיף 3.4), אם החשיפה המתקבלת היא מעל או מתחת חשופים, השקופיות ניתנות מחדש נחשפו סרט חדש עבור קצר ו / או ארוך יותר זמן כדי להשיג את החשיפה הרצויה. ניתוח תמונת densitometric יכול להיעשות על ידי מערכת הדמית קניינים המספקת מצבור נרחב של היישומים עבור autoradiography כמו גם יישומים אחרים. סטנדרטי כיול נמצאים fmol / גרם של משקל רקמות רטוב (בהנחה סגולית של אחד עבור הרקמה). כל ערכה סטנדרטית, יחד עם רקע תפיק עקומת סטנדרט. ישנם מספר אלגוריתמים ההולמים עקומים עם ובלי שקלול זמין לייצר עקומת סטנדרט מן ד ביחס אופטומטריערכי ensity (ROD) עבור סטנדרטי כיול השונים. בחירה של העקומה מייצגת בצורה הטובה ביותר את הנתונים נעשתה באופן אמפירי כמו שהשגרה עבור הולם עקום אינו מספקת ערכי שגיאה יחסיים עבור העקומות הסטנדרטיות השונות. בשעה מוטה עד ~ 0.6, העקומה הסטנדרטית היא pseudolinear. עם זאת, הסרט מתחיל להרוות מעבר לנקודה זו ויוצרת עקום כי אסימפטוטה סביב 0.8 ל 0.9 יחידות ROD. אם את הסטנדרטים למסגר את הדגימות הם מעל 0.9 יחידות ROD, מומלץ מחדש לחשוף את הסרט לתקופה קצרה של זמן להשיג ערכים אמינים יותר של fmol / g המחייב של הדגימות קרובות יותר בטווח pseudolinear של ההתקן עֲקוּמָה. ערכים הנגזרים בקיצוניותו זו של עקומת הסטנדרט יגרמו הבדלים קטנים ROD להבדלים גדולים משמעותי radioligand מחייבים. מכאן היכולת לזהות שינויי ירידות מחייבות כסרט מתקרב לנקודת הרוויה שלה. עבור מדידות של אזורים ספציפיים,צעדים מומלצים הם &#39;צפיפות&#39; ב fmol / g, &#39;אזור סרוק &quot;בפיקסלים, ו&#39; סה&quot;כ יעד פינה &#39;בפיקסלים (איור 9). חשוב להגדיר ערך סף קרוב לאפס ככל האפשר (איור 10), כי וריאציות צפיפות סרט או את ההיבט השרירותי של עקומת הסטנדרט נגזרת סטנדרטי הכיול לפעמים יכולות לתת ערכים פחות מאפסת. אם ערכים כאלה הם ממוצעים עבור כל הפיקסלים שטח סריקה זה היה להפיק ערך נמוך באופן מלאכותי. הקריטריונים המשמשים כדי לזהות אזורים עם המחייב יכול להיות מאוד סובייקטיבי, ולכן עדיף לעקוב מקרוב לשייך את מלאת מוח ניסוי ככל האפשר כדי להפחית את השכיחות של טעויות סובייקטיבי. אתגר נוסף הוא להחליט כמה סעיפי הסכום ממוצעים לקבל קריאה סופית. אינדיקציה טובה סעיפים לנתח יכולה להיקבע על ידי ביצוע אטלס מוח עכברוש מקובלים, יחד עם מגלשות היסטולוגיה המוכתמות. גודלו של שטח הדגימה גם יכול להיותבְּעָיָה. כדי לפצות, תבנית ניתן להקים לתקן בגין אי-התאמות גודל. הטיפול בסעיפים יכול גם להשפיע על שטח של המבנה גבוה יש כריכה, נחשב במהלך ניתוח. זה דורש שימוש אלטרנטיבי של הכלי &#39;thresholding&#39; במערכת ההדמיה קנייני להגדיר טווח צפיפות העולה על ערך שרירותי כדי לייצג את המאפיינים האנטומיים של האזור במוח להיות שנדגמו כגון גרעין paraventricular של ההיפותלמוס בתוך כלי דגימה המקיף את האזור של עניין (איור 11, לוח ג). כמו כן ניתן לכלול את מדידת השטח אל תוך קביעת הסכום של הכריכה. ניתן לעשות זאת על ידי הכפלת הערך עבור פעמים מחייבות ספציפית את מספר הפיקסלים שנמדדו. פיקסלים ניתן להמיר יחידות מטר ידי הדמית סרגל בשני מישורים, או מלבן של ממדים ידועים. מספר הפיקסלים מתאיםאורך או שטח של מלבן אז יכול לבוא לידי ביטוי ביחידות מטריות. ב- 2400 dpi רזולוציה, ~ 9,000 פיקסלים = 1 מ&quot;מ 2 במערכת שלנו. למרות השימוש הליגנדים רדיואקטיבי הוא כבר לא טכניקה בשימוש נרחב; זה אחד בודדי הדרכים כדי להמחיש את ההפצה הפיסית של קולטנים בתוך רקמת הדגימות עצמם תפקודיים (מסוגלים מחייבים ליגנד המולד שלה). בנוסף, זה יכול לכמת את מספר הקולטנים כדי לאפשר הערכה של שינויים בביטוי קולטן פונקציונלי בין קבוצות הטיפול, בין אזורי מוח שונים או מבנים אחרים, בין זנים שונים של בעלי חיים, או בעלי חיים בגילאים שונים, וכו &#39;שיטות חלופיות זמינים לאפיין היבטי neuroanatomical ביטוי קולטן 1 AT, אולם, יש להם ערך מוגבל. הכלאה באתרו של mRNA עבור AT 1 קולטנים אינו תואם תמיד עם קולטן AT 1 הביטוי או חלוקהמוֹחַ. בעוד טכניקות חיסוניות יכולות משוערות הבדלי הביטוי הקולטן בוסס על עוצמת מכתים סעיפי רקמות, זה לא אפשרי כדי ליצור עקומת תקן מכתים כדי לאפשר קביעה מספרית של ביטוי הקולטן. autoradiography קולטן גם מספק רמה של וספציפיות קולטנים (או מטרות אחרות באופן ספציפי להיקשר radioligands) כי לא ניתן להבטיח באמצעות טכניקות אימונולוגיות. בשנת 2009, סדרה של מאמרים פורסמו 37-43 כי ספק בתוקפו של 49 נוגדנים שהיו בשימוש כדי להעריך 18 קולטנים שונים G חלבון בשילוב ופוטנציאל הקולטן חולף ערוץ (TRP). בעיקרו של דבר, נוגדנים שכותרתו להקות זהות על כתמים מערביים wild-type ועכברים בנוקאאוט עבור הקולטניים מדובר. בהמשך לכך, כמה קבוצות עשו תצפיות דומות באמצעות זמינים מסחריים AT 1 ו- AT 2 נוגדנים לקולטן 44-49. שימוש חיידקיםאל כרומוזום מלאכותי אשר מייצר מולקולת כתב, למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק, מונעת על ידי AT 1 האמרגן הוא אמצעי עקיף של קביעת קיומו או אי קיומו של AT 1 תאים לבטא קולטן עכבר (אך לא עכברוש) מוח מבוסס על היותן פונקציונלי AT 1 קולטן האמרגן 50. אפשר לספור &quot;תאים חיוביים&quot; באזורי המוח זיהו מיקרוסקופי, אבל לא כדי לכמת שינויים בעוצמת הביטוי של הקולטן AT 1 באזורים אלו. לכן בשלב זה את הטכניקות תוקפות רק כי זמין יחיד למדוד ישירות ביטוי הקולטן אנג השני הן radioligand שיטות מחייבות. וגם, אם ברזולוציה האנטומי של פעילות לפי 1 חלבון קולטן יש צורך ברמה מיקרוסקופית, autoradiography קולטן הוא הטכניקה היחידה העומדת למדידה ישירה כזו. autoradiography קולטן אינו נטול מגבלות. Concer הגדולהn הוא כי העמידה בדרישות להשתמש בחומרים רדיואקטיביים במסגרת מחקרית. זה הכרחי כדי לקבל תכנית בטיחות קרינה עם הנחיות קפדניות במקום כדי להבטיח את שלומם של חוקרים שעובדים עם חומרים רדיואקטיביים ואת הפריסה הבטוחה של החומרים רדיואקטיביים. זה מסלים את עלות המחקר תוך שימוש בחומרים רדיואקטיביים עד כדי כך מונע את השימוש שלהם בה בסביבות מחקר רבות. בנוסף, העלות של radioligands יכולה להיות משמעותית. כך ניסוי autoradiography קולטן שבו מספר רב של קטעי רקמה רכוב שקופיות מודגרת במיכלים של radioligand יכול להשתמש מאות אם לא אלפי דולרים של radioligand. מגבלה נוספת היא כי רקמות חייבות להיות קפוא לפני החתך על cryostat, מאוחסנות במשך תקופה מסוימת, ושטפו במהירות יבשה לאחר הדגרה עם radioligand, כל מה שיכול לפגוע ביכולת של קולטנים או חלבון העניין לחייב את radioligand . לקבלת הליגנדים שיש תחת מהירקינטיקה ociation / דיסוציאציה, זה לא יכול להיות אפשרי כדי לשמור את הכריכה של radioligand לקולטן במהלך הזמן הדרוש כדי לשטוף ממני radioligand כבול שאינם במיוחד. כמו כן, עם כמויות נמוכות של radioligand מחייב תקופות ארוכות של חשיפת סרט - חודש או יותר - ייתכן שיידרש לפני תמונה למדידה יכולה להיוצר על הסרט. אתגר נוסף הוא כי תוספת של יוד-125 ליגנד עלולה להביא לפגיעה ביכולת של ליגנד להיקשר לקולטן היעד שלה או חלבון עקב הפרעה סטרית. שימוש מולקולה קטנה, למשל, טריטיום (3 H) מבטל את הבעיה של הפרעה סטרית, אבל יש טריטיום כגון אנרגיה נמוכה ופעילות סגולית נמוכה (יחסית יוד-125) כי זה מאוד קשה כדי ליצור תמונת סרט עבור רוב אוכלוסיות קולטן. לאור בעיות אלו, ישנם מצבים רבים בהם autoradiography הקולטן אינו מסוגל לזהות קולטנים או מבנים מולקולריים אחרים בעלי עניין. למרות li שלהmitations, autoradiography הקולטן יכול לזהות מבנים ספציפיים בתוך רקמה, למשל, אזורים במוח שינו בתגובה המשתנית ניסיוני לעומת מוח שליטה נורמלי. ידע זה יכול לעזור לקבוע את התפקיד של R 1 AT עבור אנג שנייה או קולטן אחר או אנזימים בפתולוגיה של מחלה. יש ידע זה השלכות תרופתיות יקרות, כפי שהוא מעיד באזורים למקד עבור טיפולים פוטנציאליים.

מחלות לב וכלי דם ממשיכה להיות הגורם המוביל למוות ונכות בארצות הברית, גרימה יותר מ -30% ממקרי המוות בארצות הברית בשנת 2011 1. הנתונים הסטטיסטיים העדכניים ביותר של איגוד הלב האמריקאי עולה כי יותר מאדם אחד מכל שלוש יש אחד או יותר סוג של מחלות לב וכלי דם. מחקר לב וכלי דם ממשיך לעשות צעדים נגד להבנת המחלה הזאת, אבל כמו דורות להתחיל מזדקן זה הכרחי כדי להמשיך במאמצים אלה. מערכת רנין-אנגיוטנסין (RAS) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות של מערכת הלב וכלי הדם בעיקר על ידי קידום טרשת עורקים, דלקת, vasoconstriction מערכתית, והפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית (איור 1) 2-8. ראס הוא המערכת ההורמונלית, כי הוא מופעל כאשר תאים juxtaglomerular של הכליה להפריש רנין לתוך זרם הדם בתגובה וירידה בלחץ דם, גדל sympatגירוי hetic, או ירידה בזרימת נתרן ידי Densa המקולה. רנין חילוף החומרים angiotensinogen (מסונתז בכבד) כדי ליצור אנגיוטנסין I (אנג לי). אנג לי עובר מטבוליזם מכן על ידי אנזים-המרת אנגיוטנסין (ACE), גידול ectoenzyme בצד luminal של תאי האנדותל של כלי הדם, בעיקר הריאות והכליות, כדי ליצור אנגיוטנסין II (אנג II), הפפטיד מפעיל הראשי של RAS. אנג II הוא מסוגל הפעלת שתי תת קולטן; הקולטן מסוג 1 (AT 1 R) לבין הקולטן מסוג 2 (AT 2 R), הן המסדירות את מערכת הלב וכלי הדם, לשמור על הומאוסטזיס נוזלים ואלקטרוליטים ו נחשבים כיום להשפיע על התפקוד הקוגניטיבי ומחלות ניווניות מעבדת 8,9. RAS מקומי, מוח ספציפי מדווח באופן עצמאי לסנתז אנג שנייה. בשנת המוח, angiotensinogen חלבון מבשר הוא מסונתז astroglia 10 מומר אנג לי על ידי אנזים רנין דמוי 3, ואולי כבול prorenin לקולטן prorenin11, ולאחר מכן להמיר אנג השנייה על ידי אנזים-המרת אנגיוטנסין אשר מבוטא בשפע על פני השטח התאיים של נוירונים במוח 12. Intrabrain זה שנוצר אנג II הוא אגוניסט למוח AT 1 ו- AT 2 קולטנים מבודדים השנייה אנג שמקורן בדם. בעוד AT 1 R ממלא תפקיד פיזיולוגי חשוב, זה ידוע יותר עבור אפקטים pathophysiological שלה בכל הגוף, המשפיעים על מערכת הלב וכלי הדם בעיקר והכליות (איור 2). כאשר אנג II נקשר R 1 AT, שהיא גורמת vasoconstriction; הגדלת התנגדות לזרימת דם והעלאת לחץ דם. זה גם מקדם סינתזה הפרשת אלדוסטרון ווסופרסין, שמוביל נתרן מוגברת החזקת מים. תופעות אלה יכולים גם לגרום נזק מוחי איסכמי וליקויים קוגניטיביים והיא צמודה מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, ואת diabetes, כמו גם להיות זיהו באחרונה להשפיע למידה וזיכרון 13-15. יש לולאת משוב בשכונת ראס באותה AT 1 R על תאי juxtaglomerular בכליות מעכב הפרשת רנין. מעניין לציין, כי R AT 2 בדרך כלל נגד מווסת את הפעולה של AT 1 R, גרימת התרחבות, תולדה neurite, התחדשות axonal, אנטי התפשטות, cerebroprotection בקרב רבים אחרים 16-20. ה- R AT 2 גם זוהה כיעד אנטי יתר לחץ דם ולאחרונה, תרופות אנטי-סרטני 21. קביעת לוקליזציה הצפיפות של קולטנים אנג השניים בתוך רקמות שונות וכיצד הם מושפעים טיפולים שונים ומצבי המחלה באמצעות autoradiography קולטן densitometric כמותית יעזור לחשוף את התפקיד RAS משחק במחלות ספציפיות. autoradiography קולטן שימש במשך למעלה מ -30 שנה כשיטה יעילה עבור המעידים על נוכחות של אנגיוטנסין Iאני קולטנים ורכיבים אחרים של RAS במוח וברקמות אחרות של חולדה, עכבר, שרקן, הכלב האנושי תחת מגוון רחב של תנאי הניסוי 22-34. החשיבות של איתור קולטנים השני אנג בתוך המוח היא שאפשר להחיל הנוירואנטומיה פונקציונלי לפעולות של אנג השנייה במוח, למשל, הנוכחות של R AT 1 בגרעין paraventricular של ההיפותלמוס (PVN) מציעה פונקציה של אנג שני במוח כדי לעורר וזופרסין, אוקסיטוצין או שחרור הורמון קורטיקוטרופין (CRH) שחרור, או הפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית. לכן, תרופות החוסמות את R AT 1 עשויות להקטין כמה תופעות PVN בתיווך אלה הקשורים על פעילות של RAS המוח. תוצרת בעיבוד מראה שהשימוש של AT 1 יריבי R יכול להקטין הפרעת דחק פוסט-טראומטי (PTSD) שחרור -induced של CRH ו לשפר את הסימפטומים של PTSD (Hurt et al., שהוגש לפרסום). PVN, subfornicalהאיבר (SFO), ו האמיגדלה ידוע להסדרת הומאוסטזיס, תיאבון / צמא, שינה, זיכרון, תגובות רגשיות, והם בתחומי היעד של מחקר הפגנה הזאת. אזורים אלה נבחנו על ידי איסוף חלקי עטרה של מוח על שקופיות מיקרוסקופ, וטיפול הקטעים עם מעכבים ספציפיים יחד עם radioligand ספציפי לקולטניים אנג השני. במחקר זה, כל החומרים ריאגנטים יחד עם ספקים הציעו מפורטים, יוד-125 שמשו radiolabel אנטגוניסט לקולטן אנג השנייה, sarcosine 1, isoleucine 8 אנג שני (SI אנג II), אשר היה מטוהר אז כמו שאני מוניתי 125 -SI אנג II באמצעות שיטות HPLC כפי שתואר לעיל 35. השימוש radioligand פעילות ספציפית גבוהה זה מאפשר הדמיה של תחומי צפיפות קולטני נמוך, בינוני וגבוה לאחר חשיפה של חלקים רדיואקטיבי כדי הסרט רנטגן. על ידי כיול הסרט לתקני רסק מוח המכילים לסכומים ידועים של יוד-125, הסכום המבוקששל קולטן אנג השני מחייב בשטח ניתן לכמת. במחקרים ניסיוניים, הקולטן אנג השנייה מחייב במוחם של הנבדקים הניסוי ניתן בהשוואה לזו במוחם של נבדקים בריאים. זה יכול לציין אם הפעולות של אנג שנייה הם שינו בתגובת מחלה גנטית, נורמליות פנוטיפי, מצב מחלה או טיפול תרופתי. ידע זה יכול להיות מיושם על הפיתוח של טיפולים לטיפול במחלות הקשורות חוסר ויסות של RAS. טכניקות חלופיות המזהות קולטן אתרי קישור, אבל עם רזולוציה אנטומיים מופחתת, מחייבות מבחנים המשתמשות הכנות קרום רקמות נגזרות homogenates רקמות, אשר מודגרת עם radioligand על פני טווח של ריכוזיים להעריך זיקה מחייבת radioligand כמו הקבוע דיסוציאציה (K D ) וקיבולת מחייב מקסימלי (מקסימום B) של הרקמה של עניין. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות שבור למטה לתוך 5 שיתוף גדולmponents: הכנת סעיפי רקמות עבור קולטן autoradiography; קולטן autoradiography; חשיפה לקולנוע פיתוח; היסטולוגיה; ניתוח תמונה densitometric.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500ml Plastic Beakers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24mm x 60mm Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-050-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography Imaging Film 24x30cm</td>
			<td>Carestream-Biomax MR Film</td>
			<td>891-2560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin (from Bacillus licheniformis)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard Sheet 8x11</td>
			<td>Crescent Illustration Board #201</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hair dryers</td>
			<td>Conair</td>
			<td>Model SD6X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Disodium salt, Dihydrate)</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>15-699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16-100-210&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulary Substitute for D-19 Developer</td>
			<td>Photographers Formulary, Inc.&#160;</td>
			<td>01-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38 SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoprep / OCT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH75-125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film Fixer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>5160320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo flo</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Losartan</td>
			<td>Fisher/Tocris</td>
			<td>37-985-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID&#8482; Core 7.0</td>
			<td>MCID</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way slide grips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48440-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD123319</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-615-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Charged Slides , Fine Ground Edge</td>
			<td>Premiere Microscope Slides</td>
			<td>9308W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125I Ligands</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX- 248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125SI-Ang II&#160;</td>
			<td>George Washington University</td>
			<td>Radioiodinated by Dr. Speth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mailers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>RDCS0750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thionin&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T409-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ray Casette (10 x 12)</td>
			<td>Spectronics Corporation</td>
			<td>Four Square</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

receptor autoradiography protocol for the localized visualization of angiotensin ii receptors

פרוטוקול זה מתאר דפוסים מחייבים קולטן עבור אנגיוטנסין II (אנג II) במוח החולדה באמצעות radioligand ספציפי לקולטניים אנג השנייה לבצע מיפוי קולטן autoradiographic. דגימות רקמות נקצרות ומאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. Cryostat משמש סעיף coronally הרקמה (המוח) הפשרת הר בסעיפים גבי שקופיות טעונות. סעיפי הרקמות רכובי השקופיות מודגרת 125 I-SI-אנג שני radiolabel קולטנים אנג השני. שקופיות סמוכות מופרדים לשתי קבוצות: &quot;הלא ספציפיות מחייבים&quot; (NSP) בנוכחות ריכוז להרוות הקולטן של הלא רדיואקטיבי אנג השנייה, או AT 1 תת סוג קולטן אנג השני (AT 1 R) אנטגוניסט לרצפטור אנג שני סלקטיבית , ו &#39;סה&quot;כ מחייב &quot;ללא AT אנטגוניסט R 1. ריכוז להרוות של תת-סוג קולטן AT 2 אנג השנייה (AT 2 R) אנטגוניסט (PD123319, 10 מיקרומטר) קיים גם incubatiעל חיץ להגביל 125 I-SI-אנג השנייה מחייב את תת סוג R AT 1. במהלך 30 דקות הדגירה טרום ב ~ 22 ° C, מגלשות NSP נחשפים 10 מיקרומטר PD123319 ו Losartan, כאשר בוחרים באפשרות &#39;סה&quot;כ מחייב&#39; שקופיות נחשפים 10 מיקרומטר PD123319. שקופיות מודגרת מכן עם 125 I-SI-אנג השנייה בנוכחות PD123319 עבור &#39;להסתכם מחייב&#39;, ו PD123319 ו Losartan עבור NSP חיץ assay, ואחריו כמה &#39;שוטף&#39; חיץ, ומים כדי להסיר מלח אי כבול radioligand במיוחד. השקופיות הן יבשות באמצעות מכת מייבשים, אז נחשפו סרט autoradiography באמצעות סרט קלטת מיוחד. הסרט הוא פיתח את התמונות נסרקים לתוך המחשב עבור צפיפות ויזואלית וכמותית באמצעות מערכת הדמיה קנייני גיליון אלקטרוני. סט נוסף של שקופיות thionin מוכתם להשוואות היסטולוגית. היתרון של שימוש autoradiography קולטן הוא היכולת לדמייןאנג השנייה קולטנים באתרו, בתוך קטע של דגימת רקמות, אנטומית לזהות את האזור של הרקמה על ידי השוואתה קטע התייחסות היסטולוגית סמוך.

Watch this Scientific Journal Video about Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors at JoVE.com

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K Views.  Nova Southeastern University. Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II. 

Video: Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

התקן TMS NeuroStar: ניהול ה-FDA פרוטוקול מאושר לטיפול דיכאון

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

ניגון אוטומטי של וידאו אינטראקטיבי ללימודי תקשורת של בעלי חיים

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and hypothalamus that supplies blood to the brain and surrounding structures. It has been implicated in several cerebrovascular disorders, including cerebral amyloid angiopathy (CAA)-associated vasculopathies, intracranial atherosclerosis and intracranial aneurysms. Studies of the molecular mechanisms underlying these diseases for the identification of novel drug targets for their prevention require animal models. Some of these models may be transgenic, whereas others will involve isolation of the cerebro-vasculature, including the CoW.The method described here is suitable for CoW isolation in any mouse lineage and has considerable potential for screening (expression of genes, protein production, posttranslational protein modifications, secretome analysis, etc.) studies on the large vessels of the mouse cerebro-vasculature. It can also be used for ex vivo studies, by adapting the organ bath system developed for isolated mouse olfactory arteries.

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

פרוטוקול בידוד לחוג עכבר של וויליס

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...