この作品は、パリVI大学とピエールファーブルイノベーション助成金によってサポートされていました。

すべての手順は、動物実験（イル=ド=フランス・パリ委員会、認可4270）のためのローカルの倫理委員会の承認を得て、実験動物の管理と使用のための欧州共同体の基準に準拠して行きました。 1.麻酔<ol><li>手術前に成体マウスにペントバルビタール（1ミリグラム/体重10gまで）を腹腔内（27ゲージの針および1-mlの注射器）の致死量を注入。 </li></ol> 2.船舶灌流注：血管灌流の間に目に獣医軟膏を適用する必要はありません。この手順は、（5-10分）迅速であり、動物の死で終わります。つま先のピンチと応答の欠如を確認してください。 <ol><li>ちょうど胸郭の下に、腹壁および腹膜に、虹彩のはさみを使用して、切開を行い、約4センチ。 </li><li> continuその後、振動板に小切開（数ミリ長い）を作成し、E胸郭の全長に沿って振動板の切開は胸膜腔を露出させます。 </li><li>離れて胸骨を持ち上げて、止血剤と胸骨の先端をクランプします。首に止血剤を配置します。慎重に心臓への胸骨を連結する脂肪組織をトリミングします。 </li><li>心尖に左心室を通って15ゲージの灌流針を渡します。 </li><li>最後に、コンセントを作成するために、肝葉の1をカットするはさみを使用しています。 注：代替出口は右心房への切開部を作成するために、虹彩のはさみを使用して作成することができます。 </li><li> 2.5ml /分の速度で作動するポンプを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の25〜50ミリリットルで動物を灌流。肝臓は血液のような湯通しをPBSに置換されるべきです。 </li><li>肝臓からの流体が完全にクリアされた後、約5分後、灌流を停止します。 </li><li>免疫染色や定期的な染色が計画されている場合は、パラホルムアルデヒド50mlで動物を灌流（PFA; PBS中4％）で15分間。 注：注意、PFAの煙は有毒です。 PFAと動物の灌流は、換気ドラフト内で行われるべきです。 </li></ol> 3.脳の単離とウィリスのサークル<ol><li> 脳の単離 <ol><li>手術用ハサミで頭を削除します。 </li><li>鼻に首から皮膚に沿って、アイリスハサミで正中切開を行います。 </li><li>頭蓋骨を露出させ、アイリスハサミで任意の残留筋肉や脂肪組織を除去するために皮膚を切り落とします。 </li><li>片側に大後頭孔にアイリスはさみの鋭い端を置き、慎重に（また、外耳道として知られている）外耳道に頭蓋骨の内面に沿って、それらをスライドさせます。 </li><li>対側に3.1.4で説明切開を再現し、矢状縫合の開始に間頭頂骨の内面に沿って切断正中線を作ります。 </li><li>植物アイリス前頭骨ではさみ、右眼の間、矢状縫合で、その後2で頭蓋骨を分割するためにそれらを開きます。 </li><li>嗅球をつかみ、その腹面に神経接続を遮断する虹彩のはさみを使用して、脳を持ち上げます。 </li><li>脳を外し牛の分離のための氷冷PBSを含む60 mmのペトリ皿に入れてください。完全にPBSで脳を浸します。脳は4％PFAで固定した場合（後続セク免疫染色や定期的な染色のため）、24時間4℃で4％PFAの浴に保管してください。 </li></ol></li><li> ウィリス動脈輪の単離 注：解剖顕微鏡をするCoW分離のために必要とされます。脳は全体の手順を通して4℃に保たれるべきです。 <ol><li>牛を可視化するために逆さまに（ すなわち、その背側表面上）脳を置きます。 </li><li> （嗅覚葉の基部で前大脳動脈（ACA）をつかむために、小さな鉗子を使用して、 <strオング&gt;、図1）および及ぼす圧力容器の連続からそれらを分離します。 B（ 図1）に、中大脳動脈（MCA）をカットするために、同じ手順を使用します。 </li><li>皮質から牛を形成する主要な動脈を持ち上げて除去するために鉗子の鋭い端を使用してください。 </li><li>ピンセットで中大脳動脈（MCA）を把持することにより、脳からそれらを切断し、後方の通信動脈（PCA）の開始を持ち上げます。前方動脈（ACAとMCA）をピックアップし、前方、背側方向の視交叉上で静かにそれらを引きます。 CoWの破壊を防止するために、他の動脈に対処するための手順を中断。 </li><li>繰り返しはdorsal-でそれらを引っ張って、3.2.2と優れたと後部小脳動脈（SCA）/（PCA）3.2.3（C、図1）および脳底動脈（BA） の（d、図1）のためのステップ前方方向。私記載された手順の最後で停止nは3.2.4。 </li><li>ピンセットで軽く引っ張ることにより、全体のCoWを削除します。氷冷PBSで満たされた60 mmのペトリ皿に牛を置き、小さなピンで所定の位置に牛を保持し、2鉗子で残っている添付の脳組織を除去します。 </li><li>またはタンパク質の抽出 - その後のRNA精製のための処理（約500 ngのRNAの抽出収率大量のRNA）のために-80℃で収穫したCoWを保管してください。 注：牛は、単離されたマウス嗅覚動脈用に開発された器官槽システムを適合させることにより、24時間のex vivoで維持することができる7。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> 図1：マウス脳牛をハイライト牛は2前大脳動脈（ACA）に由来している2つの内部頚動脈（MCA）、から形成されているの腹側図の略図;。脳底動脈（BA）事後（PCA）と優れた（SCA）に分岐し、脳動脈、および2つの椎骨動脈（VA）。

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

ここではウィリス動脈輪の単離のための再現可能なプロトコルを記述します。牛を含む最も一般的な脳血管障害は、動脈血管の壁に影響を与えるのすべてがCAA関連血管障害、頭蓋内アテローム性動脈硬化症と頭蓋内動脈瘤、です。危険因子にはよく知られているが、これらの脳疾患の分子的病因はよくわかっていないままであり、その発生を予測するための特異的な生物学的マーカーが欠如しています。分子変化と肉眼観察をリンクするトランスジェニックマウスから牛を単離する方法にかなりの関心があります。例えば、（保坂ら 8で説明したように）特定の遺伝子がノックアウトされたマウスモデルで一貫動脈瘤を誘発し、牛を分析することにより、治療がこの遺伝子によってコードされるタンパク質を標的とするかどうかを決定することが可能でなければならない可能性頭蓋内動脈瘤および/またはクモ膜下出血を防ぎます。 Obviouずる、この方法はまた、ADの種々のトランスジェニックマウスモデルにおけるCAA関連血管障害の進行に対する特定の薬物の効果を分析するために使用することができます。 全体のマウスの微小血管を精製するよりも、マウスの動脈を単離することが容易であるが、そのようなサンプリングは、それにもかかわらず、ラットよりもマウスにおいてより困難です。実際、ラット牛により、一度に全体の構造を単離すること、非常に堅い髄膜に埋め込まれています。マウスにおける血管の小さなサイズの問題に加えて、この手順は、脳の除去の前にPBSとの灌流の後の血管の透過性にも厄介です。したがって、我々は、それが簡単に血管を区別することを可能にするために麻酔の後、ステップ3から開始し、注入することなく練習をお勧めします。マウス脳血管が非常に微細で、簡単に破る最後に、解剖はその全体構成を確保するために、急いですることなく、非常に慎重に行うべきです最初のACAをつかむことによって、一体的に隔離されています。 CoW調製物の純度は、神経および血管の遺伝子の発現のレベルを比較することによって評価することができます。 10遺伝子発現 - 練習では、単一の牛は5の研究のためだけに十分なRNAを提供します。大規模なスクリーニングのために、いくつかのマウス牛をプールする必要があります。 ゴーティエら 9は、平滑筋、または培養物中に維持することができ、内皮細胞を生じる（トラップそれらに脳のガラスビーズの断片を消化するためにコラゲナーゼ/ディスパーゼの使用に基づいて）微小血管の小片を単離するための方法を記載しました適切な培地に入れました。本手法の利点は、血管構造を変えることなく、大血管を分離することです。カウ特定枝の解剖も脳diseasに遺伝子発現の特定の分岐のプロファイルと可能感受性との間の相関を決定するために、関心のものであってもよいですこのような頭蓋内動脈瘤などのエス、。このようなアプローチは、いくつかのACA解剖学的および遺伝的変異は、ACA動脈瘤のより高い有病率と相関している理由の説明を提供してもよいです。この解剖牛の単離手順の開始時に、他のブランチからそれを分離するために、各特定の枝の基部に鉗子で発揮する圧力を必要とします。 したがって、それは可能にCoW 10から細胞を誘導するために、または遺伝子発現11およびタンパク質産生12または翻訳後タンパク質修飾をスクリーニングすることに加えて、この方法は、単純にするために開発された器官浴システムを適合させることにより、ex vivoでの研究のために使用することができます単離したマウス嗅覚動脈7抗生物質を含む培地中で全体のCoWのインキュベーションに続いて、この特定の構造により放出secretomeを得て、分析することができます。 CAAのマウスモデルにおいて、このsecretomeの分析は、それ経口になるだろうssible、例えば、これらの脳動脈のCAA関連の炎症状態を決定します。得られた馴化培地は、各血管壁の細胞型の表現型にsecretomeの効果を決定するために使用することができます。病理学のCoW製剤はまた、環状グアノシン一リン酸（cGMP）、サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）のような生化学的シグナルの可能な違いを識別するために使用される、または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて検出可能なの Ca 2+濃度、ベースバイオセンサーことができます。ウイルス配信バイオセンサーは、錐体皮質ニューロンと線条体中型有棘ニューロン間のD1応答の深遠な違いの検出につながる、保存形態の実験的にアクセス可能な成熟した生きたニューロンを含む脳スライス標本上で使用されている。13 FRETベースのセカンドメッセンジャーセンサータンパク質14を発現するトランスジェニックマウスにおいて、脳血管疾患のモデル孤立したCoWでの生化学的シグナルのイメージングのために、さらに、これらの疾患の生化学、病態生理、および薬物療法へのさらなる洞察を提供する必要があります。

また、ウィリス（のCoW）、Willisorウィリス多角形のループの円として知られる脳動脈円（大脳動脈輪）は、）最初のそれは、光学キアズマとすることができ、視床下部の周囲に位置する循環吻合である1664にトーマス・ウィリスによって記述されました脳および周囲の構造に血液を供給する中央ハブとみなすこと。血液は、内頸動脈と椎骨動脈を経由してこの構造体に入り、それが内部の中間及び後大脳動脈を経由して、円の外に流れます。これらの動脈の各々は、円の両側の枝を左右しています。完全な円を動脈通信基底、郵便通信、及び前方（ 図1及び図2）。流出動脈のいずれかに血流障害のリスクは、それによって、十分な血液がBに供給されることを保証し、頸動脈および大脳動脈の円に入る血液の融合によって最小化されます雨。この構造は、内頸動脈の重症閉塞性疾患における側副血流のための主経路として機能します。 脳血管障害のいくつかの種類の牛にその起源を持っています。最も一般的には1、2、3これらの障害が原因で血管拡張に低灌流につながる可能性があります。脳アミロイド血管症（CAA）関連血管障害、頭蓋内アテローム性動脈硬化症と頭蓋内動脈瘤であり、脳内および/またはくも膜下出血は、最終的には、虚血性または出血性脳卒中またはに変換しますせいぜい、一過性脳虚血発作。おそらく血管造影法と組み合わせた神経画像などの診断手順における最近の進歩は、それが可能な脳生検を必要とせず、臨床的にこれらの主要な脳血管疾患を診断するために行きました。それにもかかわらず、効果的かつ具体的な治療法（薬理学的または血管内）は、現在不足していると、新しい定義する必要性が存在します分子標的。 ヒトにおけるこれらの疾患の予防のための新規な薬物標的の同定は、動物モデル牛などの脳血管系を単離する方法を必要とします。このようなモデルは、頭蓋内動脈瘤、CAAまたは頭蓋内アテローム性動脈硬化症の動物モデルにおける大血管の壁に生じる、炎症性変化を含む特定の変更、にの証拠や手がかりを提供する必要があります。4、5、6 当社は、CAAのようなアルツハイマー病（AD）における血管の炎症の研究および関連疾患を容易にするために、マウスのCoWを単離するための方法を確立しました。マウスの牛を単離するためのこの方法は、疾患の進行中の炎症性脳血管遺伝子発現の評価のために開発されました。一緒に軟膜および軟膜動脈の壁内のアミロイドβ沈着の検出と、この方法は、簡単に阻止するために作ることができます鉱山炎症性脳血管壁での遺伝子発現およびAβペプチドの蓄積の間の可能な関係。くも膜下空間内の軟膜および軟膜を含む脳の血管網は、ウィリス動脈輪を形成する大きな動脈の拡張です。ここに記載された方法は、任意のマウス系統の牛を単離するために使用することができ、マウスの脳血管系の大きな血管のスクリーニング（ 例えば 、遺伝子発現、タンパク質産生、および翻訳後タンパク質修飾）すべてのタイプのために使用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">D8537</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Dumont #55 Forceps</td>
			<td style="width:173px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:173px;">11295-51</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Hardened Fine Iris Scissors&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:173px;">14090-11</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Scissors - Straight / Sharp / Sharp&#160;&#160; 16.5 cm</td>
			<td style="width:173px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:173px;">14002-16</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Dumont #7b Forceps&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:173px;">11270-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Stereoscopic Zoom Microscope</td>
			<td style="width:173px;">Nikon</td>
			<td style="width:173px;">SMZ745T</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">CellBIND Surface 60mm Culture Dish</td>
			<td style="width:173px;">Corning</td>
			<td style="width:173px;">#3295</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Peristaltic Pump - MINIPULS 3</td>
			<td style="width:173px;">Gilson</td>
			<td style="width:173px;">M312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:173px;">Pentobarbital Sodique</td>
			<td style="width:173px;">Ceva Sant&#233; Animale</td>
			<td style="width:173px;">FR/V/2770465 3/1992</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for isolating the mouse circle of willis

ウィリス（のCoW）の大脳動脈輪（大脳動脈輪）または円は、脳や周囲の構造に血液を供給する光学キアズマと視床下部を取り囲む循環吻合術です。これは、脳アミロイド血管症（CAA）関連血管障害、頭蓋内アテローム性動脈硬化症と頭蓋内動脈瘤を含むいくつかの脳血管障害、に関与しています。その予防のための新規な薬物標的の同定のために、これらの疾患の根底にある分子メカニズムの研究は、動物モデルを必要とします。他のものは、ここで説明CoW.The方法は、任意のマウス系統でのCoW分離に適しており、（タンパク質産生の遺伝子の発現をスクリーニングするための大きな可能性を有しているなどの、脳血管系の単離を含むであろう一方、これらのモデルのいくつかは、トランスジェニックであってもよいです翻訳後タンパク質修飾など secretome分析、）マウスの脳の大型船舶に関する研究血管系。それはまた、単離されたマウスの嗅覚動脈のために開発された臓器槽システムを適合させることにより、ex vivoでの研究のために使用することができます。

<html> PBS-灌流マウスが殺され、プロトコルのセクション3.2で説明したようにCoWが単離されます。解剖が正しく実行されると、牛は一枚で出てくるべきであるとによる血管系の残留血液の不在にわずかに透明であるべきです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> 図2： 分離後のマウスのCoW。 10-cmのペトリ皿中のCoWの（A）の概要。（B）のCoWの様々な枝の詳細。中大脳動脈のためのMCA、前大脳動脈、脳底動脈のためのBAのためのACA、PCA優れた脳動脈のための後大脳動脈とSCAのために。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54352/54352fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 10トン。 &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt;のCoW調製物の純度は、ニューロンの遺伝子の発現が検出不可能であるのに対し、特定の血管の遺伝子が強く発現していることを確実にすることによって確認することができます具体的には、洗浄牛はすべき具体的には、平滑筋アクチン（SMA）、平滑筋ミオシン重鎖（SM-MHC）およびsmoothelinなどの血管平滑筋細胞マーカーを発現する。これらのマーカーはほとんど脳の他の部分で発現される。発現の反対側のパターンがあるべきCoWでのみわずかに検出ニューロンマーカー（モグ、マップMap2）で、神経細胞の遺伝子を得ました。 mRNAのレベルは、基準遺伝子転写物（ここで、GAPDHのそれ）に正規化相対してRT-qPCRにより評価することができます。典型的な結果を図3AおよびBに示されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig3.jpg" /&gt; 図 3： ウィリスと脳のマウスサークルにおける神経および収縮遺伝子の発現のRT-qPCRの結果は、参照遺伝子（GAPDH）のものに対して正規化しました。それらは、6〜12の独立した実験の平均±SDとして表されます。脳とのCoWの比較：NS、有意ではない、*、P &lt;0.05、**、P &lt;0.005、及び***、P &lt;0.001収縮遺伝子の（A）式：SMA（平滑筋アクチン）、 smoothelin、SM-MHC（平滑筋ミオシン重鎖11）とE-セレクチン神経遺伝子の（B）式：モグ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）とMap2の（微小管関連タンパク質2）。 牛を欠く脳における内皮マーカーE-セレクチンの発現パターンは、おそらく脳の毛細血管網の存在を反映して、ウシのサンプルについて得られたものと非常に類似しています。 <stronグラム&gt;表1は、各転写物の平均Cpの番号を示します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> A. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> 平均のCp </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> SMA </td><td colspan="3"> Smoothelin </td><td colspan="3"> SM-MHC </td><td colspan="3"> E-SEL </td></tr><tr><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </強いです&gt; </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td></tr><tr><td> 牛 </td><td> 20.86 </td><td> 0.93 </td><td> 12 </td><td> 22.02 </td><td> 0.67 </td><td> 12 </td><td> 25.29 </td><td> 1.89 </td><td> 12 </td><td> 23.37 </td><td> 0.80 </td><td> 12 </td><td> 30.56 </td><td> 1.66 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 脳 </td><td> 18.71 </td><td> 0.72 </td><td> 6 </td><td> 33.91 </td><td> 2.06 </td><td> 6 </td><td> 31.08 </td><td> 3.17 </td><td> 6 </td><td> 26.05 </td><td> 0.73 </td><td> 6 </td><td> 28.45 </td><td> 0.63 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> B. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;TD&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> 平均のCp </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> モグ </td><td colspan="3"> マップ2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 牛 </td><td> 21.04 </td><td> 0.41 </td><td> 6 </td><td> 32.13 </td><td> 1.63 </td><td> 6 </td><td> 30.21 </td><td> 0.85 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 脳 </td><td> 19.09 </td><td> 0.49 </td><td> 6 </td><td> 26.43 </td><td> 0.88 </td><td> 6 </td><td> 23.30 </td><td> 150 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1： 平均クロッシングポイントウィリスと脳のマウスサークルにおける神経および収縮遺伝子の発現のための計算は、蛍光の一定のレベルにポイント（CP）を交配することによって決定され、正確なサイクルの比較に基づいています。交差点は、増幅曲線の最大二次導関数に対応するサイクル数です。より高いCp値は、発現の低いレベルと関連しています。 Cpは参照遺伝子の35（A）のCp超えた場合、所定の遺伝子については、発現が検出不能であると考えられている：GAPDHを、そして、収縮遺伝子の：SMA、smoothelin、SM-MHCおよびE-セレクチン参照遺伝子の（B）のCp：GAPDH;およびニューロンの遺伝子：モグとマップ2。

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Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

ウィリスのマウスサークルを単離するためのプロトコル

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.0K ビュー.  Sorbonne Universités. We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

ビデオ: Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

NeuroStar TMSデバイス：うつ病の治療薬としてFDA承認されたプロトコルを実施

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

神経科学

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

げっ歯類やヒトから鼻嗅覚幹細胞を単離する

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

フローサイトメトリーを用いてマウスの内耳の組織からのLacZの発現細胞を単離する

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex three-dimensional retinal blood vessels and capillaries by creating a two-dimensional flat-mount of the interconnected vascular channels after digestion of the non-vascular components of the retina. This allows one to study various pathologic vascular changes, such as microaneurysms, capillary degeneration, and abnormal endothelial to pericyte ratios. However, the method is technically challenging, especially in mice, which have become the most widely available animal model to study the retina because of the ease of genetic manipulations 6,7. In the mouse eye, it is particularly difficult to completely remove the non-vascular components while maintaining the overall architecture of the retinal blood vessels. To date, there is a dearth of literature that describes the trypsin digest technique in detail in the mouse. This manuscript provides a detailed step-by-step methodology of the trypsin digest in mouse retina, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Trypsin digest is one of the most commonly used methods to analyze retinal vasculature. This manuscript describes the method in detail, including key alterations to optimize the technique and remove the non-vascular tissue while preserving the overall architecture of the vessels.

トリプシン消化プロトコルモデルマウスの網膜血管系を分析する

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, hippocampus, and the associated parahippocampal regions (perirhinal, entorhinal,&#160;and parahippocampal proper). Unlike most other tracing protocols available, typically focusing on certain MTL areas (e.g., amygdala and/or hippocampus), the integrative perspective adopted by the present tracing guidelines allows for clear localization of all MTL subregions. By integrating information from a variety of sources, including extant tracing protocols separately targeting various MTL structures, histological reports, and brain atlases, and with the complement of illustrative visual materials, the present protocol provides an accurate, intuitive, and convenient guide for understanding the MTL anatomy. The need for such tracing guidelines is also emphasized by illustrating possible differences between automatic and manual segmentation protocols. This knowledge can be applied toward research involving not only structural MRI investigations but also structural-functional colocalization and fMRI signal extraction from anatomically defined ROIs, in healthy and clinical groups alike.

The present work provides a comprehensive set of guidelines for manually tracing the medial temporal lobe (MTL) structures. This protocol can be applied to research involving structural and/or combined structural-functional magnetic resonance imaging (MRI) investigations of the MTL, in both healthy and clinical groups.

内側側頭葉構造の手動分割のための総合的なプロトコル

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

マウス脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性：非放射性テロメラーゼリピート増幅プロトコル（TRAP）アッセイ

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to perform receptor autoradiographic mapping.
Tissue specimens are harvested and stored at -80 &#176;C. A cryostat is used to coronally section the tissue (brain) and thaw-mount the sections onto charged slides. The slide-mounted tissue sections are incubated in 125I-SI-Ang II to radiolabel Ang II receptors. Adjacent slides are separated into two sets: &#39;non-specific binding&#39; (NSP) in the presence of a receptor saturating concentration of non-radiolabeled Ang II, or an AT1 Ang II receptor subtype (AT1R) selective Ang II receptor antagonist, and &#39;total binding&#39; with no AT1R antagonist. A saturating concentration of AT2 Ang II receptor subtype (AT2R) antagonist (PD123319, 10 &#181;M) is also present in the incubation buffer to limit 125I-SI-Ang II binding to the AT1R subtype. During a 30 min pre-incubation at ~22 &#176;C, NSP slides are exposed to 10 &#181;M PD123319 and losartan, while &#39;total binding&#39; slides are exposed to 10 &#181;M PD123319. Slides are then incubated with 125I-SI-Ang II in the presence of PD123319 for &#39;total binding&#39;, and PD123319 and losartan for NSP in assay buffer, followed by several &#39;washes&#39; in buffer, and water to remove salt and non-specifically bound radioligand. The slides are dried using blow-dryers, then exposed to autoradiography film using a specialized film and cassette. The film is developed and the images are scanned into a computer for visual and quantitative densitometry using a proprietary imaging system and a spreadsheet. An additional set of slides are thionin-stained for histological comparisons.
The advantage of using receptor autoradiography is the ability to visualize Ang II receptors in situ, within a section of a tissue specimen, and anatomically identify the region of the tissue by comparing it to an adjacent histological reference section.

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

アンジオテンシンII受容体のローカライズされた可視化のための受容体オートラジオグラフィープロトコル

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control neuroplastic processes and correct abnormal function, or even shift functions from damaged tissue to physiologically healthy brain regions, hold the potential to dramatically improve overall health. Of the current neuroplastic interventions in development, neurofeedback training (NFT) from functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) has the advantages of being completely non-invasive, non-pharmacologic, and spatially localized to target brain regions, as well as having no known side effects. Furthermore, NFT techniques, initially developed using fMRI, can often be translated to exercises that can be performed outside of the scanner without the aid of medical professionals or sophisticated medical equipment. In fMRI NFT, the fMRI signal is measured from specific regions of the brain, processed, and presented to the participant in real-time. Through training, self-directed mental processing techniques, that regulate this signal and its underlying neurophysiologic correlates, are developed. FMRI NFT has been used to train volitional control over a wide range of brain regions with implications for several different cognitive, behavioral, and motor systems. Additionally, fMRI NFT has shown promise in a broad range of applications such as the treatment of neurologic disorders and the augmentation of baseline human performance. In this article, we present an fMRI NFT protocol developed at our institution for modulation of both healthy and abnormal brain function, as well as examples of using the method to target both cognitive and auditory regions of the brain.

The ability to induce and/or control neural plasticity may be critical in future treatments for neurologic disorders and the recovery from brain injury. In this paper, we present a protocol on the use of neurofeedback training with functional magnetic resonance imaging to modulate human brain function.

管理のリアルタイム fMRI ニューロフィード バック トレーニングのプロトコル

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...