Name: protocol for isolating the mouse circle of willis
Uploaded: 2016-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo VI Universidade Paris e uma bolsa Pierre Fabre Inovação.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas da Comunidade Europeia para o cuidado e uso de animais de laboratório, com a aprovação do comitê de ética local para experimentação animal (Ile de France-Paris-Comitê, Autorização 4270). 1. Anestesia <ol><li> Infundir uma dose letal de pentobarbital (até 1 mg / 10 g de peso corporal) (agulha de calibre 27 e seringa de 1 ml) por via intraperitoneal em ratinhos adultos antes da cirurgia. </li></ol> Perfusão 2. Vessel NOTA: Não há necessidade de aplicar vet pomada para os olhos durante a perfusão navio. Este procedimento é rápido (5-10 minutos) e termina na morte do animal. Confirmar a falta de resposta com uma pitada dedo do pé. <ol><li> Usando íris tesouras, fazer uma incisão, de cerca de 4 cm de comprimento, na parede abdominal e peritônio, logo abaixo da caixa torácica. </li><li> Fazer uma pequena incisão (alguns milímetros de comprimento) no diafragma e, em seguida, continue a incisão do diafragma ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural. </li><li> Levante o esterno de distância e apertar a ponta do esterno com a pinça hemostática; colocar a pinça hemostática no pescoço. Cuidadosamente cortar o tecido adiposo que liga o esterno para o coração. </li><li> Passar a perfusão agulha de calibre 15 através do ventrículo esquerdo para o vértice do coração. </li><li> Finalmente, utilize uma tesoura para cortar um dos lóbulos do fígado para criar uma saída. NOTA: Uma tomada alternativa pode ser criado usando íris tesouras para criar uma incisão no átrio direito. </li><li> Perfundir o animal com 25 a 50 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com uma bomba que opera a uma velocidade de 2,5 ml / min. O fígado deve blanch como o sangue é substituído por PBS. </li><li> Depois de aproximadamente cinco minutos, uma vez que o fluido a partir do fígado é completamente claro, parar a perfusão. </li><li> Se imunocoloração ou coloração regular é planejado, perfundir o animal com 50 ml de paraformaldeído(PFA; 4% em PBS) durante 15 min. NOTA: Cuidado, fumos PFA são tóxicos. Perfusão do animal com PFA deve ser levada a cabo numa hotte ventilada. </li></ol> 3. O isolamento do cérebro e do Círculo de Willis <ol><li> O isolamento do cérebro <ol><li> Retire a cabeça com um par de tesouras cirúrgicas. </li><li> Faça uma incisão na linha média com íris tesouras, ao longo da pele do pescoço até o nariz. </li><li> Aparar a pele para expor o crânio e remova todos os músculos residuais e tecidos adiposos com tesoura de íris. </li><li> Colocar a ponta da íris tesouras para o buraco occipital de um lado e deslize-as cuidadosamente ao longo da superfície interna do crânio para o meato auditivo externo (também conhecida como o canal do ouvido). </li><li> Reproduzir a incisão descrito em 3.1.4 no lado contralateral e fazer um corte na linha média ao longo da superfície interna do osso inter-parietal para o início da sutura sagital. </li><li> Plantar a íristesouras no osso frontal, bem entre os olhos, na sutura sagital e, em seguida, abri-los para dividir o crânio em dois. </li><li> Levante o cérebro, agarrando os bulbos olfatórios e usando as íris tesoura para cortar as conexões nervosas em sua superfície ventral. </li><li> Remover o cérebro e colocá-lo em um prato de 60 mm de Petri contendo PBS gelado para o isolamento de vaca. Mergulhe completamente o cérebro na PBS. Se o cérebro foi fixada com PFA a 4% (para corte subsequente e imunocoloração ou coloração normal), mantê-lo em um banho de PFA a 4% a 4 ° C durante 24 h. </li></ol></li><li> O isolamento do círculo de Willis NOTA: Um microscópio de dissecação é necessária para o isolamento de vaca. O cérebro deve ser mantida a 4 ° C ao longo de todo o procedimento. <ol><li> Coloque o cérebro de cabeça para baixo (ou seja, em sua superfície dorsal) para visualizar a vaca. </li><li> Use uma pequena pinça para agarrar as artérias cerebrais anteriores (ACA) na base dos lobos olfativos ( <strong&gt; A, Figura 1) e exercer pressão para dissociar-los a partir do vaso contínuo. Use o mesmo procedimento para cortar as artérias cerebral média (MCA) em b (Figura 1). </li><li> Use as pontas afiadas das pinças para levantar e remover as principais artérias que formam a vaca do córtex. </li><li> Levante-se o início das artérias comunicantes posteriores (PCA) para desligá-los a partir do cérebro, segurando nas artérias cerebrais médias (MCA) com a pinça. Pegar as artérias anteriores (ACA e MCA) e puxe-os delicadamente sobre o quiasma no sentido ântero-dorsal. Para evitar a interrupção da vaca, interromper o procedimento a lidar com as outras artérias. </li><li> Repita os passos 3.2.2 e 3.2.3 para as artérias cerebelar superior e posterior (SCA) / (APC) (C, figura 1) e para a artéria basilar (BA) (d, Figura 1), puxando-os em um dorso- direcção anterior. Parar no final do procedimento descrito In 3.2.4. </li><li> Remova toda a vaca puxando suavemente com a pinça. Coloque a vaca em um 60-mm placa de Petri com PBS gelado e remover qualquer tecido cerebral ligada restante com duas pinças, segurando a vaca no lugar com pequenos pinos. </li><li> Mantenha a vaca colhida a -80 ° C para posterior processamento para purificação de RNA (rendimentos de extração de RNA grandes quantidades de RNA - cerca de 500 ng) ou extração de proteínas. Nota: A vaca pode ser mantida ex vivo, durante 24 horas, através da adaptação do sistema de banho de órgãos desenvolvido para artéria olfativa isolado do rato 7. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama esquemático de um Ventral View of the Mouse Cérebro Destacando a vaca a vaca é formada a partir das duas artérias carótidas internas (MCA), que são derivadas das duas artérias cerebrais anteriores (ACA);. o basilararteriais (BA) ramifica na posterior (PCA) e superior (SCA) artérias cerebrais, e duas artérias vertebrais (VA).

<ol>
	<li>Beckmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cerebrovascular+abnormalities+and+blood+flow+disturbances+in+APP23+mice+modeling+Alzheimer's+disease.">Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).</li><li>Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+factors+effecting+cerebral+aneurysm+pathophysiology.">Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology.</a> Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).</li><li>Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+mechanisms+of+intracranial+atherosclerosis.">Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis.</a> Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).</li><li>Tulamo, R., Fr&#246;sen, J., Hernesniemi, J., Niemel&#228;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+changes+in+the+aneurysm+wall:+a+review.">Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review.</a> J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).</li><li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+amyloid+angiopathy:+emerging+concepts.">Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts.</a> J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).</li><li>Oy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+atherosclerotic+stroke:+specific+focus+on+the+metabolic+syndrome+and+inflammation.">Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation.</a> Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).</li><li>Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+model+for+the+study+of+cerebrovascular+function+utilizing+isolated+mouse+olfactory+artery.">Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery.</a> J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).</li><li>Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+murine+intracranial+aneurysm+model:+aneurysm+formation+and+rupture+by+elastase+and+hypertension.">Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension.</a> J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).</li><li>Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebrovascular+cells+as+a+cell+culture+model+for+cerebral+amyloid+angiopathy:+isolation+of+smooth+muscle+and+endothelial+cells+from+mouse+brain.">Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain.</a> Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).</li><li>Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+vascular+endothelial+cells+from+mice.">Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).</li><li>Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transcript+analysis+in+small+quantitiesof+mRNA+by+SAGE-Lite.">Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite.</a> Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).</li><li>Badhwar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stanimirovic,+Hamel,+&amp;+Haqqani+The+proteome+of+mouse+cerebral+arteries.">Stanimirovic, Hamel, &amp; Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).</li><li>Castro, L., Brito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+neurones+have+a+specific+ability+to+respond+to+phasic+dopamine+release.">Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release.</a> J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).</li><li>H&#252;bscher, D., Nikolaev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+mice+expressing+FRET+biosensors.">Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors.</a> Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Descrevemos aqui um protocolo reprodutível para o isolamento do círculo de Willis. As doenças cerebrovasculares mais comuns que envolvem a vaca são vasculopatias associadas à CAA, aterosclerose intracraniana e aneurisma intracraniano, todos os quais afectam as paredes dos vasos arteriais. Os fatores de risco são bem conhecidos, mas a patogênese molecular desses distúrbios cerebrais permanece mal compreendido e marcadores biológicos específicos para prever sua ocorrência faltam. Há um grande interesse em métodos para isolar a vaca de ratinhos transgénicos para ligar observações macroscópicas com as alterações moleculares. Por exemplo, através da indução de aneurismas consistentes num modelo de murganho em que um gene específico é eliminado (tal como descrito por Hosaka et ai. 8) e analisando a vaca, deverá ser possível determinar se os tratamentos visando a proteína codificada por este gene pode prevenir aneurismas intracranianos e / ou hemorragia subaracnóidea. Obvioudissimulado, este método também pode ser utilizado para analisar o efeito de uma droga em particular sobre a progressão da vasculopatia associada à CAA nos vários modelos de ratinhos transgénicos de AD. É mais fácil isolar as artérias de rato do que para purificar microvasos inteiros de rato, mas este tipo de amostragem é, no entanto, mais difícil do que em ratos em ratos. Na verdade, a vaca rato está incorporado em meninges muito mais duras, tornando-se possível isolar toda a estrutura de uma só vez. Em adição ao problema de o pequeno tamanho dos vasos em ratinhos, este procedimento também é complicado devido à transparência dos vasos após a sua perfusão com PBS antes da remoção do cérebro. Assim, recomendamos praticando sem a infusão, a partir do passo 3 após anestesia para torná-lo mais fácil de distinguir os vasos sanguíneos. Finalmente, como vasos cerebrais de rato são muito finos e quebram com facilidade, a dissecção deve ser efectuada com muito cuidado, sem pressa, para assegurar que toda a estruturaé isolado de uma só peça, por primeiro agarrando a ACA. A pureza da preparação de vaca pode ser avaliada comparando os níveis de expressão dos genes neuronais e dos vasos. Com a prática, uma única vaca fornece apenas RNA suficiente para o estudo de 5 - 10 expressão dos genes. Para rastreio em grande escala, várias vacas rato devem ser recolhidas. Gauthier et ai. 9 descrito um método para o isolamento de pequenos pedaços de microvasos (com base na utilização de colagenase / dispase a digerir fragmentos de cérebro e de esferas de vidro para prendê-los) que produz o músculo liso ou células endoteliais que podem ser mantidas em cultura quando colocado num meio apropriado. A vantagem do nosso método é que grandes vasos isolados, sem alterar a estrutura do vaso. A dissecção de ramos específicos da vaca também podem ser de interesse, para determinar a correlação entre o perfil de expressão gênica de um ramo particular e possível suscetibilidade a diseas cerebrovascularesES, tais como aneurisma intracraniana. Tais abordagens podem fornecer uma explicação de por que algumas variações anatômicas e genéticas ACA estão correlacionados com uma maior prevalência de aneurismas ACA. Esta dissecção requer que sejam exercidas pressões com uma pinça na base de cada ramo específico, para dissociar-lo dos outros ramos, no início do procedimento de isolamento de vaca. Assim, além de tornar possível obter células a partir de a vaca 10 ou para o rastreio de gene de expressão 11 e a proteína de produção 12 ou modificações de proteínas pós-tradução, este método pode ser usado para ex vivo estudos, por simples adaptação do sistema de banho do órgão desenvolvido para isolado rato artérias olfativo. 7 Após a incubação de toda a vaca em contendo antibióticos meio de cultura, a secretome liberada por essa estrutura específica pode ser obtida e analisada. Uma análise deste secretome em modelos de ratos com CAA tornaria possible, por exemplo, para determinar o estado inflamatório da CAA destas artérias cerebrais. O meio condicionado resultante também pode ser usado para determinar os efeitos da secretoma em cada parede do vaso fenótipo tipo de célula. Preparações vaca patológicas podem também ser utilizados para identificar possíveis diferenças de sinais bioquímicos, tais como o monofosfato de guanosina cíclico (cGMP), monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), ou Ca 2+, detectável com a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) biossensores baseados. Biossensores entregou-vírus têm sido utilizados em preparações de fatias do cérebro contendo neurônios vivos maduros experimentalmente acessíveis com uma morfologia preservada, levando à detecção de diferenças profundas em resposta D1 entre os neurônios corticais piramidais e do estriado neurônios espinhosos médios. 13 A modelagem das doenças cerebrovasculares em ratinhos transgénicos que expressam proteínas de sensores segundo mensageiro baseado em FRET 14para a imagem de sinais bioquímicos na vaca isolada deve fornecer mais uma visão mais aprofundada a bioquímica, fisiopatologia e tratamento farmacológico dessas doenças.

O círculo arterial cerebral (circulus arterial cerebral), também conhecido como o círculo de Willis (vaca), alça de Willisor Willis polígono) foi descrita pela primeira vez por Thomas Willis em 1664. É uma anastomose circulatório localizados ao redor do quiasma óptico e no hipotálamo que pode ser considerado como um hub central fornecimento de sangue para o cérebro e estruturas circundantes. Sangue entra esta estrutura através da carótida interna e artérias vertebrais e flui para fora do círculo através do meio interior e as artérias cerebrais posteriores. Cada um destes ramos tem artérias esquerda e direita de cada lado do circulo. O basilar, pós comunicação, e comunicante anterior artérias completa o círculo (Figura 1 e Figura 2). O risco de fluxo de sangue deficiente em qualquer das artérias de escoamento é minimizado pela fusão de sangue que entra no círculo da carótida e artérias cerebrais, garantindo assim que o sangue suficiente seja fornecido ao bchuva. Essa estrutura também serve como a principal via para o fluxo sanguíneo colateral em doenças oclusivas graves da artéria carótida interna. Vários tipos de doenças cerebrovasculares têm a sua origem na vaca. Os mais comuns são angiopatia amilóide cerebral (CAA) vasculopatias -associated, aterosclerose intracraniana e aneurismas intracranianos. 1, 2, 3 Esses distúrbios podem levar a hipoperfusão devido à vasodilatação e intracerebrais e / ou subaracnóidea hemorragias em última análise, traduzindo-se em acidente vascular cerebral isquêmico ou hemorrágico ou , na melhor das hipóteses, um ataque isquêmico transitório. Recentes avanços em procedimentos de diagnóstico, incluindo neuroimagem, possivelmente combinado com angiografia, tornaram possível para diagnosticar estas importantes doenças cerebrovasculares clinicamente, sem a necessidade de uma biópsia do cérebro. No entanto, os tratamentos eficazes e específicos (farmacológicas ou endovasculares) são actualmente não existe e não existe, portanto, uma necessidade de definir novosalvos moleculares. A identificação de novos alvos de drogas para a prevenção dessas doenças em seres humanos vai exigir modelos animais e modos de isolamento do cerebro-vascular incluindo a vaca. Tais modelos devem fornecer provas de e pistas para as mudanças específicas, incluindo alterações inflamatórias, que ocorrem nas paredes dos vasos grandes em modelos animais de aneurisma da artéria intracraniana, CAA ou aterosclerose intracraniana. 4, 5, 6 Nós estabelecemos um método para o isolamento do mouse vaca para facilitar os estudos de inflamação dos vasos na doença de Alzheimer (DA) e doenças relacionadas, tais como CAA. Este método para isolar a vaca rato foi desenvolvida para a avaliação da expressão do gene vascular cerebral durante a progressão da doença inflamatória. Juntamente com a detecção da deposição de amilóide beta dentro das paredes das artérias e leptomeníngeas piais, este método pode tornar mais fácil para dissuadirmina a possível relação entre a expressão do gene inflamatório na parede do cerebro-vascular e acumulação de Ap-péptido. A rede vascular do cérebro, incluindo o leptomeníngea e pial no espaço subaracnóide, é uma extensão das grandes artérias que formam o polígono de Willis. O método aqui descrito pode ser utilizado para isolar a vaca de qualquer linhagem do rato e poderia ser utilizado para todos os tipos de rastreio (por exemplo, a expressão do gene, a produção de proteínas e modificações pós-tradução de proteínas) sobre os grandes vasos do rato cerebro-vascular.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Hardened Fine Iris Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Straight / Sharp / Sharp&amp;nbsp;&amp;nbsp; 16.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic Zoom Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Surface 60mm Culture Dish</td><td>Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&amp;eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for isolating the mouse circle of willis

O círculo arterial cerebral (circulus arterial cerebral) ou círculo de Willis (vaca) é uma anastomose circulatório em torno do quiasma óptico e no hipotálamo que fornece sangue para o cérebro e estruturas adjacentes. Ele tem sido implicada em várias doenças cerebrovasculares, incluindo angiopatia amilóide cerebral (CAA) -associated vasculopatias, aterosclerose intracraniana e aneurismas intracranianos. Estudos de mecanismos moleculares subjacentes a estas doenças para a identificação de novos alvos de drogas para a sua prevenção requerem modelos animais. Alguns destes modelos podem ser transgénico, enquanto que outros envolvem o isolamento do cerebro-vascular, incluindo o método CoW.The aqui descrito é adequado para o isolamento de vaca em qualquer linhagem do rato e tem um potencial considerável para o rastreio (a expressão de genes, a produção de proteína, modificações pós-traducionais de proteínas, análise secretome, etc.) estudos sobre os grandes vasos do cerebrospinal do ratovasculatura. Ele também pode ser usado para estudos ex vivo, mediante a adaptação do sistema de banho do órgão desenvolvido para artérias rato isolados olfactivos.

<html> O mouse PBS-perfusão é morto ea vaca é isolada como descrito no ponto 3.2 do protocolo. Quando a dissecção é realizada corretamente, a vaca deve sair em uma parte e deve ser ligeiramente transparente, devido à ausência de sangue residual na vasculatura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> Figura 2: A vaca mouse após o isolamento. (A) Resumo da vaca em um prato de 10 cm Petri. (B) Os detalhes dos vários ramos da vaca. MCA para as artérias cerebrais médias, ACA para as artérias cerebrais anteriores, BA para artéria basilar, PCA para posterior artérias cerebrais e SCA para as artérias cerebrais superiores. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54352/54352fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> tenda. &quot;FO: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; A pureza da preparação de vaca pode ser verificada através da garantia de que os genes específicos vasculares são fortemente expresso ao passo que a expressão de genes neuronais é indetectável Mais especificamente, a vaca limpa deveria especificamente expressam marcadores de células musculares lisas vasculares, tais como a actina do músculo liso (SMA), do músculo liso-cadeia pesada de miosina (SM-MHC) e smoothelin. Estes marcadores são apenas expressos em outras partes do cérebro. Um padrão oposto de expressão deve ser obtidos para genes neuronais, com marcadores neuronais (Mog, Map2) só quase indetectáveis ​​na vaca. Os níveis de ARNm pode ser avaliada por RT-qPCR com a normalização em relação a um transcrito genético de referência (aqui, que de GAPDH). Os resultados típicos são mostrados na Figura 3A e B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig3.jpg" /&gt; Figura 3:. Expressão de genes neuronal e contráteis do mouse Círculo de Willis e Cérebro Os resultados RT-qPCR foram normalizados contra aqueles para um gene de referência (GAPDH). Eles são expressos como a média ± DP de 6 a 12 experiências independentes; Comparação da vaca com o cérebro: ns, não significativa, *, P &lt;0,05, **, P &lt;0,005 e ***, P &lt;0,001 (A) A expressão de genes contráteis:. SMA (actina de músculo liso), smoothelin, SM-MHC (músculo liso-miosina de cadeia pesada 11) e e-selectin (B) Expressão de genes neuronais:. Mog (mielina de oligodendrócitos glicoproteína) e Map2 (microtúbulo associado proteína 2). O padrão do marcador E-selectina endotelial cerebral em falta a vaca expressão é muito semelhante ao obtido para as amostras de vaca, reflectindo possivelmente a existência de uma rede capilar cerebral. <strong&gt; Tabela 1 lista os números de Cp médios para cada transcrição. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> UMA. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> média Cp </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> SMA </td><td colspan="3"> Smoothelin </td><td colspan="3"> SM-MHC </td><td colspan="3"> E-Sel </td></tr><tr><td> Significar </td><td> SD </td><td> N </td><td> Significar </td><td> SD </td><td> N </td><td> Significar </td><td> SD </td><td> N </strong&gt; </td><td> Significar </td><td> SD </td><td> N </td><td> Significar </td><td> SD </td><td> N </td></tr><tr><td> Vaca </td><td> 20.86 </td><td> 0,93 </td><td> 12 </td><td> 22.02 </td><td> 0,67 </td><td> 12 </td><td> 25.29 </td><td> 1,89 </td><td> 12 </td><td> 23.37 </td><td> 0.80 </td><td> 12 </td><td> 30.56 </td><td> 1.66 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Cérebro </td><td> 18.71 </td><td> 0,72 </td><td> 6 </td><td> 33.91 </td><td> 2.06 </td><td> 6 </td><td> 31.08 </td><td> 3.17 </td><td> 6 </td><td> 26.05 </td><td> 0,73 </td><td> 6 </td><td> 28.45 </td><td> 0,63 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> B. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> média Cp </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> Mog </td><td colspan="3"> Map2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Significar </td><td> SD </td><td> N </td><td> Significar </td><td> SD </td><td> N </td><td> Significar </td><td> SD </td><td> N </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vaca </td><td> 21.04 </td><td> 0,41 </td><td> 6 </td><td> 32.13 </td><td> 1,63 </td><td> 6 </td><td> 30.21 </td><td> 0,85 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cérebro </td><td> 19,09 </td><td> 0,49 </td><td> 6 </td><td> 26,43 </td><td> 0,88 </td><td> 6 </td><td> 23.30 </td><td> 0.99 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Média ponto de passagem para a expressão de genes contrácteis neuronal e no ratinho círculo de Willis e cérebro cálculos baseiam-se na comparação do ciclo exacta determinada através de pontos de cruzamento (Cp) a um nível constante de fluorescência. O ponto de passagem é o número do ciclo correspondente à segunda derivada máximo da curva de amplificação. Cp valores mais elevados estão associados com níveis inferiores de expressão. Para um dado gene, a expressão é considerada como sendo indetectável se o Cp excede 35. (A) Cp do gene de referência: GAPDH; e de genes contrácteis: SMA, smoothelin, SM-MHC e E-selectin (B) Cp do gene de referência:. GAPDH; e genes neuronais: Mog e Map2.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis at JoVE.com

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Protocolo para isolar o mouse Círculo de Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

protocol-for-isolating-the-mouse-circle-of-willis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.0K visualizações.  Sorbonne Universités. We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Vídeo: Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Medicina

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Imunologia e Infecção

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Regulação hormonal, metabólica e elétrica de neurônios hipotalâmicos isolados

Isolation of Targeted Hypothalamic Neurons for Studies of Hormonal, Metabolic, and Electrical Regulation

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As the functions of the hypothalamus are controlled by specific subsets of neuronal populations, the ability to isolate them provides a major tool for studying metabolic mechanisms. In this regard, the neuronal complexity of the hypothalamus poses exceptional challenges. 
For these reasons, new techniques, such as Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS), have been explored. This paper describes a new application of magnetic-activated cell sorting (MACS) using microbead technology to isolate a targeted neuronal population from prenatal mice brains. The technique is simple and guarantees a highly pure and viable primary hypothalamic neuron culture with high reproducibility. The hypothalamus is gently dissociated, neurons are selectively isolated and separated from glial cells, and finally, using a specific antibody for a cell surface marker, the population of interest is selected. 
Once isolated, targeted neurons can be used to investigate their morphological, electrical, and endocrine characteristics and their responses in normal or pathological conditions. Furthermore, given the variegated roles of the hypothalamus in regulating feeding, metabolism, stress, sleep, and motivation, a closer look at targeted and region-specific neurons may provide insight into their tasks in this complex environment.

Autor em destaque: Insights do mecanismo neural hipotalâmico 

Here we present a protocol to grow specific hypothalamic cell subtypes in culture. The cells can be selected based on opportune/unique membrane markers and used in many applications, including immunofluorescence, electrophysiological, and biochemical assays.

Isolamento de neurônios hipotalâmicos direcionados para estudos de regulação hormonal, metabólica e elétrica

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As ...

Neurociência

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Biologia

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the three-dimensional tissue morphology is from such sections. In addition, the sections of tissues examined may not contain the region within the tissue that is necessary for the purpose of the ongoing study. This latter limitation hinders histopathological studies of blood vessels since vascular lesions develop in a focalized manner. This requires a method that enables us to survey a wide area of the blood vessel wall, from its surface to deeper regions. A whole mount en face preparation of blood vessels fulfills this requirement. In this article, we will demonstrate how to make en face preparations of the mouse aorta and carotid artery and to immunofluorescently stain them for confocal microscopy and other types of fluorescence-based imaging.

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

A procedure for making en face preparations of the mouse carotid artery and aorta is described. Such preparations, when immunofluorescently stained with specific antibodies, enable us to study localization of proteins and identification of cell types within the entire vascular wall by confocal microscopy.

En Face Preparação de Vasos Sanguíneos de Rato

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Protocolo para isolar o mouse Círculo de Willis

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos

Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

Isolamento de neurônios hipotalâmicos direcionados para estudos de regulação hormonal, metabólica e elétrica

Isolamento de neurônios hipotalâmicos direcionados para estudos de regulação hormonal, metabólica e elétrica

Isolamento de neurônios hipotalâmicos direcionados para estudos de regulação hormonal, metabólica e elétrica

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

En Face Preparação de Vasos Sanguíneos de Rato

Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos