Bu eser Paris VI Üniversitesi ve Pierre Fabre Yenilik hibe ile desteklenmiştir.

Tüm prosedürler hayvan deney için yerel etik kurul (Ile de France-Paris-Komitesi, Yetki 4270) onayı ile, bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için Avrupa Birliği standartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Anestezi <ol><li> pentobarbitalin letal doz infüze yetişkin farelere intraperitonal olarak (27 gauge iğne ve 1 ml&#39;lik bir şırınga) (1 mg / 10 g vücut ağırlığı kadar) ameliyattan önce. </li></ol> 2. Gemi Perfüzyon NOT: damar perfüzyon sırasında gözlere veteriner merhem uygulamak için gerek yoktur. Bu prosedür, (5-10 dakika), hızlı ve hayvanın ölümü ile sona erer. Bir ayak tutam yanıt eksikliği onaylayın. <ol><li> iris makas kullanarak, sadece göğüs kafesine altında, karın duvarı ve periton içine, yaklaşık 4 cm uzunluğunda, bir kesi yapmak. </li><li> continu sonra diyafram küçük bir kesi (birkaç milimetre uzunluğunda) yapmak vee göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyaframın kesi plevra boşluğunu ortaya çıkarmak. </li><li> uzak sternum kaldırın ve hemostatla sternum ucu kelepçe; Boyunda hemostat yerleştirin. Dikkatle kalbe sternum bağlayan yağ dokusu kırpın. </li><li> kalbin apeks sol ventrikül ile 15 gauge perfüzyon iğne geçirin. </li><li> Son olarak, bir çıkış oluşturmak için karaciğer lobları birini kesmek için makas kullanın. NOT: Alternatif çıkış sağ atriuma bir kesi oluşturmak için iris makası kullanılarak oluşturulabilir. </li><li> 2.5 ml / dk&#39;lık bir hızda çalışan bir pompa ile fosfat tamponlu tuz (PBS) 25 ila 50 ml hayvan serpmek. Karaciğer kan gibi beyazlasan PBS ile değiştirilir gerekir. </li><li> Karaciğer sıvı tamamen berrak bir kez yaklaşık beş dakika sonra, perfüzyon durdurun. </li><li> immün veya normal boyama planlanmış ise, paraformaldehid 50 ml ile hayvan serpmek(PFA, 4 PBS içinde%) 15 dakika karıştırıldı. NOT: Dikkat, PFA dumanı zehirlidir. PFA hayvanın perfüzyon havalandırılan bir duman başlığı içinde yapılmalıdır. </li></ol> 3. Beyin İzolasyonu ve Willis Çember <ol><li> Beyin izolasyonu <ol><li> Cerrahi bir makas ile baş kaldırmak. </li><li> burun boyun derinin boyunca, iris makas ile orta hat kesi olun. </li><li> kafatası maruz ve iris makası ile herhangi bir kalıntı kasları ve adipoz doku kaldırmak için cildi keserek. </li><li> Bir tarafta foramen magnum içine iris makas keskin ucunu yerleştirin ve dikkatlice (aynı zamanda kulak kanalında olarak da bilinir) dış kulak yolu kafatası iç yüzeyi boyunca kaydırın. </li><li> karşı tarafta 3.1.4 açıklanan kesi yeniden ve sutur başlamadan arası parietal kemiğin iç yüzeyi boyunca kesilmiş bir orta hat yapmak. </li><li> iris bitkiFrontal kemikte makas, sağ gözler arasında, sagital sütür ve daha sonra ikiye kafatası bölünmüş açın. </li><li> koku ampuller kapma ve ventral yüzeyinde sinir bağlantılarını kesmek iris makas kullanılarak, beyin kaldırın. </li><li> beyin çıkarın ve inek izolasyonu için buz soğukluğunda PBS içeren 60 mm Petri kabı içine koyun. Tamamen PBS içinde beyin batırmayın. Beyin% 4 PFA ile sabitlenmiş ise (daha sonra kesit ve immün ya da normal boyama için), 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de% 4 PFA banyosu içinde tutmak. </li></ol></li><li> Willis poligonunun İzolasyonu NOT: Bir diseksiyon mikroskobu inek izolasyonu için gereklidir. Beyin tüm işlem boyunca 4 ° C&#39;de tutulmalıdır. <ol><li> Inek görselleştirmek için ters (yani, dorsal yüzeyinde) beyin koymak. </li><li> (Koku lobları dibinde anterior serebral arter (ACA) kapmak için küçük bir forseps kullanabilir <strong&gt; bir, Şekil 1) ve sarf basınçlı kap süreklilik onları ayırmak. B orta serebral arter (MCA) (Şekil 1) kesmek için aynı prosedürü kullanın. </li><li> korteks inek oluşturan ana arterleri kaldırmak ve kaldırmak için forseps keskin uçlarını kullanın. </li><li> forseps ile orta serebral arter (MCA) kavrayarak, beynin onları kesmek için arka iletişim arterlerin (PCA) başlangıç ​​yukarı kaldırın. ön arterleri (ACA ve MCA) Pick up ve anterior-dorsal yönde kiazmada üzerinde hafifçe çekin. İnek aksamaması için, diğer arterler ile başa çıkmak için prosedür kesme. </li><li> Tekrarlayın dorsal- çekerek, / (PCA) (c, Şekil 1) ve baziler arter (BA) (d, Şekil 1) için 3.2.2 ve üstün ve posterior serebellar arter (SCA) için 3.2.3 adımları ön yönü. Bu prosedür i sonunda durdurmakn 3.2.4. </li><li> forseps ile hafifçe çekerek tüm inek çıkarın. buz soğukluğunda PBS ile dolu bir 60 mm Petri kabı İnek yerleştirin ve küçük pimler yerine, inek tutan iki forseps ile kalan bağlı beyin dokusu çıkarın. </li><li> ya da protein çıkarımı - daha sonra, RNA saflaştırma için işlem (yaklaşık 500 ng RNA ekstraksiyon verimi RNA miktarda) -80 ° C&#39;de hasat COW tutun. Not: İnek izole fare koku alma arter için geliştirilmiş organ banyosu sistemi adapte ederek, 24 saat süreyle ex vivo olarak korunabilir 7. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> Şekil 1: Fare Beyin inek vurgulama inek iki anterior serebral arterlerin (ACA) türetilmiştir iki internal karotid arter (MCA), oluşur bir Ventral View Şematik;. bazilerarter (BA) posterior (PCA) ve üstün (SCA) içine dalları serebral arterler ve iki vertebral arter (VA).

<ol>
	<li>Beckmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+cerebrovascular+abnormalities+and+blood+flow+disturbances+in+APP23+mice+modeling+Alzheimer's+disease.">Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).</li><li>Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+factors+effecting+cerebral+aneurysm+pathophysiology.">Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology.</a> Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).</li><li>Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+mechanisms+of+intracranial+atherosclerosis.">Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis.</a> Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).</li><li>Tulamo, R., Fr&#246;sen, J., Hernesniemi, J., Niemel&#228;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+changes+in+the+aneurysm+wall:+a+review.">Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review.</a> J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).</li><li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+amyloid+angiopathy:+emerging+concepts.">Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts.</a> J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).</li><li>Oy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+atherosclerotic+stroke:+specific+focus+on+the+metabolic+syndrome+and+inflammation.">Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation.</a> Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).</li><li>Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+model+for+the+study+of+cerebrovascular+function+utilizing+isolated+mouse+olfactory+artery.">Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery.</a> J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).</li><li>Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+murine+intracranial+aneurysm+model:+aneurysm+formation+and+rupture+by+elastase+and+hypertension.">Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension.</a> J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).</li><li>Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebrovascular+cells+as+a+cell+culture+model+for+cerebral+amyloid+angiopathy:+isolation+of+smooth+muscle+and+endothelial+cells+from+mouse+brain.">Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain.</a> Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).</li><li>Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+vascular+endothelial+cells+from+mice.">Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).</li><li>Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transcript+analysis+in+small+quantitiesof+mRNA+by+SAGE-Lite.">Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite.</a> Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).</li><li>Badhwar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stanimirovic,+Hamel,+&amp;+Haqqani+The+proteome+of+mouse+cerebral+arteries.">Stanimirovic, Hamel, &amp; Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).</li><li>Castro, L., Brito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+neurones+have+a+specific+ability+to+respond+to+phasic+dopamine+release.">Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release.</a> J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).</li><li>H&#252;bscher, D., Nikolaev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+mice+expressing+FRET+biosensors.">Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors.</a> Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biz Willis poligonunun izolasyonu için burada bir tekrarlanabilir protokol açıklar. İNEK ilgili sık serebrovasküler hastalıklar arteriyel damarlarının duvarlarını etkileyen her hangi SAA ilişkili vaskulopatiler, intrakranial ateroskleroz ve intrakranial anevrizma vardır. risk faktörleri iyi bilinmektedir, ancak bu serebral bozuklukların moleküler patogenezi henüz tam olarak anlaşılamamış ve bunların oluşumunun tahmin etmek için belirli biyolojik belirteçler eksiktir. moleküler değişiklikler ile makroskopik gözlemler bağlantı transgenik farelerden inek izole edilmesi için yöntemlerde hatırı sayılır bir ilgi vardır. Örneğin, (Hosaka ve ark., 8 tarafından tarif edildiği gibi) belirli bir genin nakavt edildiği bir fare modelinde, tutarlı anevrizmaların uyarılması ve inek analiz ederek, tedaviler, bu gen tarafından kodlanan proteini hedef belirlemek mümkün olmalıdır olabilir intrakranial anevrizmaların ve / veya subaraknoid kanamalar önler. Obviousinsi, bu yöntem aynı zamanda AD, çeşitli transgenik fare modellerinde CAA ilişkili DAMAR HASTALIKLARI ilerlemesi üzerine belirli bir ilacın etkisini analiz etmek için kullanılabilir. Tüm fare mikrodamarlar saflaştırmak için daha fare arterler izole etmek daha kolaydır, ancak bu örnek yine sıçanlarda daha farelerde daha zordur. Nitekim, sıçan inek mümkün tek seferde tüm yapıyı izole etmek yaparak çok sert meninkslerde gömülüdür. Farelerde damar küçük boyutu problemine ek olarak, bu prosedür, beyne uzaklaştırılmasından önce PBS ile perfüzyonundan sonra damarların şeffaflık da zordur. Bu nedenle daha kolay kan damarlarını ayırt yapmak için anestezi sonrası 3. adımdan başlayarak, infüzyon olmadan pratik tavsiye ederiz. Fare serebral damarlar çok ince ve kolay kırılabilir Son olarak, diseksiyon tüm yapının olmasını sağlamak için, acele etmeden, çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdırİlk ACA kapma, tek bir parça olarak izole edilir. COW preparatın saflığı nöronal ve damar genlerin ekspresyon düzeylerinin karşılaştırılması ile değerlendirilebilmektedir. 10 gen ifadeleri - Uygulama ile, tek bir inek 5 çalışma için sadece yeterli RNA sağlar. Büyük ölçekli tarama için birçok fare inek toplanmalıdır. Gauthier et al. 9 kültür zaman içinde muhafaza edilebilir düz kas veya endotel hücreleri elde edilir (TRAP bunları cam boncuklar, beyin ve fragmanlarını sindirimi kolajenaz / dispaz kullanımına göre), mikrokapların küçük parçalar izole etmek için bir yöntem tarif uygun bir ortama yerleştirilir. Bizim yöntemin avantajı damar yapısını değiştirmeden, büyük gemiler izolatlarının olmasıdır. Inek belirli şube diseksiyonu da serebrovasküler hastalığı etkeni gen ifadesi, belirli bir şube profili ve olası duyarlılık arasındaki ilişkiyi belirlemek için, ilgi çekici olabilirintrakranial anevrizma olarak es. Bu tür yaklaşımlar, bazı ACA anatomik ve genetik varyasyonlar ACA anevrizması yüksek prevalansı ile ilişkilidir olarak neden bir açıklama sağlayabilir. Bu diseksiyon inek izolasyon prosedürü başında, diğer branşlardan da ayırmak için, her özel dal dibinde forseps ile uygulanan olması basınç gerektirir. Bu nedenle, mümkün İnek 10 hücreleri elde etmek için ya da gen sentezleme 11 ve protein üretimi 12 veya translasyon sonrası protein modifikasyonları taranması için verilmesine ek olarak, bu yöntem, sadece geliştirilmiş organ banyosu uyarlama sisteminin ile ex vivo çalışmalar için kullanılabilir kültür ortamı içeren antibiyotiklere bütün ineğin inkübe edildikten sonra izole edilmiş fare olfaktori arterler. 7, bu özel yapı tarafından yayımlanan secretome elde analiz edilebilir. CAA fare modellerinde, bu secretome bir analizi, PO olurssible, örneğin, bu serebral arter SAA ile ilişkili inflamatuar durumunu belirlemek için. Elde edilen koşullandırılmış ortam ayrıca, her duvardan hücre tipi fenotipe secretome etkisini belirlemek için kullanılabilir. Patolojik COW preparasyonlar, aynı zamanda, siklik guanosin monofosfatın (cGMP) siklik adenosin monofosfat (cAMP) biyokimyasal sinyallerin olası farklar, belirlemek için kullanılabilir, ya da flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) ile tespit edilebilir, Ca + 2 konsantrasyonu, merkezli biyosensörler edilebilir. Virüs teslim biyosensörler piramidal kortikal nöronların ve striatal orta dikenli nöronlar arasındaki D1 yanıt derin farklılıkların tespiti için önde gelen bir korunmuş morfolojiye sahip deneysel erişilebilir olgun yaşam nöron içeren beyin dilim hazırlıkları üzerinde kullanılmıştır. 13 FRET dayalı ikinci haberci sensör proteinleri 14 ifade eden transgenik farelerde serebrovasküler hastalıkların modellemeizole edilmiş inek biyokimyasal sinyallerin görüntülenmesi için daha fazla bu hastalıkların biyokimyası, patofizyoloji ve farmakoterapi içine daha fazla fikir vermelidir.

Ayrıca Willis (inek), Willisor Willis çokgenin döngünün daire olarak bilinen serebral arter daire (circulus arteriosus serebri),) ilk Bu optik chiasma ve can hipotalamus çevresinde bulunan bir dolaşım anastomoz olan 1664 yılında Thomas Willis tarafından tanımlanmıştır Beyin ve çevre yapılara kan tedarik merkezi bir hub olarak düşünülebilir. Kan internal karotis ve vertebral arterler ile bu yapıyı girer ve iç orta ve posterior serebral arterlerin vasıtasıyla çemberin dışına akar. Bu arterlerin her dairenin her iki tarafında dalları sol ve sağ etti. Tam bir daire arterler iletişim baziler sonrası haberleşme, ve anterior (Şekil 1 ve Şekil 2). çıkış arterlerin herhangi kan akım riski bu şekilde yeterli kan B beslenir garanti, karotis ve serebral arter bir çevre giren kan birleşmesi ile en aza indirilmiştiryağmur. Bu yapı aynı zamanda internal karotis arter şiddetli tıkayıcı hastalıklarda kollateral kan akımı için ana yol olarak hizmet vermektedir. serebrovasküler hastalıkların birkaç çeşit inek kökenlerine sahip. En yaygın 1, 2, 3 Bu bozukluklar nedeniyle vazodilatasyon hipoperfüzyona yol açabilir. Serebral amiloid anjiyopati (CAA) -associated damar hastalığı, intrakranial ateroskleroz ve intrakranial anevrizmalar, ve intraserebral ve / veya subaraknoid kanama sonuçta iskemik veya hemorajik inme veya çevrilmesine en iyi ihtimalle, bir geçici iskemik atak. muhtemelen anjiyografi ile kombine beyin görüntüleme dahil olmak üzere tanı yöntemleri, son gelişmeler, bir beyin biyopsisi için gerek kalmadan, mümkün klinik bu büyük serebrovasküler hastalıklar teşhis etmek için yaptık. Bununla birlikte, etkili ve spesifik tedavi (farmakolojik veya endovasküler) henüz mevcut değildir ve yeni tanımlamak için bir ihtiyacı vardırmoleküler hedefler. İnsanlarda bu hastalıkların önlenmesi için yeni ilaç hedefleri belirlenmesi hayvan modelleri ve inek de dahil olmak üzere serebro-damarsal izole yollarını gerektirir. Bu tür modeller intrakranial arter anevrizması, CAA veya intrakranial aterosklerozun hayvan modellerinde büyük damarların duvarlarında meydana gelen iltihabi değişiklikler de dahil belirli değişikliklere kanıt ve ipuçlarını vermelidir. 4, 5, 6 Böyle CAA Alzheimer hastalığı damar iltihabı üzerinde (AD) ve ilişkili hastalıklar, kolaylaştırmak için, fare, inek izolasyonu için bir yöntem oluşturmuştur. Fare COW izole edilmesi için bu yöntem, hastalığın ilerlemesi sırasında enflamatuar serebrovasküler gen ekspresyonunun değerlendirilmesi için geliştirilmiştir. Birlikte Leptomeningeal ve Pial arter duvarları içinde amiloit beta birikmesi saptanması ile, bu yöntem, daha kolay caydırmak için yapabilirizmayın inflamatuar serebro-damar duvarında gen ifadesinde ve Aβ-peptid birikimi arasındaki olası ilişki. subaraknoid mesafede leptomeningeal ve Pial dahil beyin, damar ağı, Willis çemberi oluşturan büyük arterlerin bir uzantısıdır. Burada tarif edilen yöntem, herhangi bir fare soyu inek izole etmek için kullanılabilir ve fare beyin-damar sisteminin büyük gemiler üzerinde tarama (örneğin, gen ekspresyonu, protein üretimi ve translasyon sonrası protein modifikasyonları) her türlü kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Hardened Fine Iris Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Straight / Sharp / Sharp&amp;nbsp;&amp;nbsp; 16.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic Zoom Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Surface 60mm Culture Dish</td><td>Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&amp;eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for isolating the mouse circle of willis

Willis (inek) serebral arter daire (circulus arteriosus serebri) ya da daire beyin ve çevreleyen yapılara kan tedarik optik chiasma ve hipotalamus çevreleyen bir dolaşım anastomoz olduğunu. Bu serebral amiloid anjiyopati (CAA) -associated damar hastalığı intrakraniyal ateroskleroz ve intrakranyal anevrizma dahil olmak üzere birçok serebrovasküler bozukluklar, implike edilmiştir. onların önlenmesi için yeni ilaç hedeflerinin tanımlanması için bu hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaların Çalışmaları hayvan modelleri gerektirmektedir. Diğerleri burada açıklanan CoW.The yöntemiyle herhangi bir fare soyu inek izolasyonu için uygundur ve (genlerin protein üretiminin ifadesini taranması için önemli bir potansiyele sahiptir dahil serebro-damar sisteminin izolasyonu, içerecektir ise bu modellerin bazıları, transgenik olabilir posttranslasyonel protein modifikasyonları, vb secretome analiz) fare serebrovasküler büyük gemilerde çalışmalarıdamar. Aynı zamanda, izole edilmiş fare olfaktori arter için geliştirilmiş organ banyosu uyarlama sisteminin ile ex vivo çalışmalar için de kullanılabilir.

<html> PBS perfüze fare öldürülür ve protokol bölüm 3.2&#39;de anlatıldığı gibi inek izole edilir. Diseksiyon doğru yapıldığında, inek tek parça halinde dışarı gelmelidir nedeniyle damarsal artık kan olmaması biraz şeffaf olmalıdır. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> Şekil 2: İzolasyon sonra Fare İnek. 10 cm&#39;lik Petri kabındaki inek (A) genel bakış. (B) inek çeşitli dallarında ayrıntıları. MCA, orta serebral arter için, ACA baziler arter anterior serebral arter, BA için, PCA posterior serebral arter ve üstün serebral arterlerin için SCA için. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54352/54352fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Çadır. &quot;fo: keep-together.within sayfa =&quot; 1 &quot;&gt; inek hazırlık saflığı nöronal genlerin ifadesi saptanamaz ise özel damar genler kuvvetle ifade sağlanarak kontrol edilebilir Daha spesifik olarak, temizlenmiş inek gerekir özellikle, düz kas aktin (SMA), düz kas-miyozin ağır zincir (SM-MHC) ve smoothelin&#39;in gibi vasküler düz kas hücre işaretçilerini, ifade eder. Bu işaretçiler, ancak diğer beyin bölgeleri olarak ifade edilmiştir. ekspresyon zıt desen olmalıdır İneklerde sadece zar zor saptanabilir nöronal belirteçlerin (Mog, map2) ile, nöronal genler için elde edilmiştir. mRNA seviyeleri, bir referans gen transkript normalizasyon nisbetle (burada GAPDH bu) RT-qPCR değerlendirilebilir. Tipik sonuçlar Şekil 3A ve B&#39;de gösterilmektedir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54352/54352fig3.jpg" /&gt; Şekil 3:. Nöronal ve Kontraktil Willis Fare Circle Genler ve Beyin ifadesi RT-qPCR sonuçları referans gen (GAPDH) için kişilere karşı normalize edildi. 6 ila 12 bağımsız deneyin ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir; Beyin ile ineğin Karşılaştırılması: ns, önemli değil, *, p &lt;0.05, ** P &lt;0.005, ve *** p &lt;0.001 kasılma genlerinin (A) İfade:. SMA (düz kas aktini), smoothelin, SM-MHC (düz kas-miyozin ağır zincir 11) ve E-selektin nöronal genlerin (b) sentezlenmesinin. Mogadorian (miyelin oligodendrosit bir glikoprotein) ile MAP2 (mikrotübül ile ilişkili protein 2). COW yoksun beyin endotel markör E-selektin salgılama modeli muhtemelen beyin kapiler ağın varlığını gösterir, inek örnekler için elde edilene benzer. <strong&gt; Tablo 1, her transkript için ortalama Cp numaralarını listeler. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> A. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> ortalama Cp </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> SMA </td><td colspan="3"> smoothelin </td><td colspan="3"> SM-MHC </td><td colspan="3"> E-Sel </td></tr><tr><td> Anlamına gelmek </td><td> SD </td><td> N </td><td> Anlamına gelmek </td><td> SD </td><td> N </td><td> Anlamına gelmek </td><td> SD </td><td> N </strong&gt; </td><td> Anlamına gelmek </td><td> SD </td><td> N </td><td> Anlamına gelmek </td><td> SD </td><td> N </td></tr><tr><td> İnek </td><td> 20.86 </td><td> 0.93 </td><td> 12 </td><td> 22.02 </td><td> 0.67 </td><td> 12 </td><td> 25.29 </td><td> 1.89 </td><td> 12 </td><td> 23,37 </td><td> 0.80 </td><td> 12 </td><td> 30.56 </td><td> 1.66 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Beyin </td><td> 18.71 </td><td> 0.72 </td><td> 6 </td><td> 33,91 </td><td> 2.06 </td><td> 6 </td><td> 31.08 </td><td> 3.17 </td><td> 6 </td><td> 26.05 </td><td> 0.73 </td><td> 6 </td><td> 28.45 </td><td> 0.63 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> B. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> ortalama Cp </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> Mog </td><td colspan="3"> map2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anlamına gelmek </td><td> SD </td><td> N </td><td> Anlamına gelmek </td><td> SD </td><td> N </td><td> Anlamına gelmek </td><td> SD </td><td> N </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> İnek </td><td> 21.04 </td><td> 0.41 </td><td> 6 </td><td> 32.13 </td><td> 1.63 </td><td> 6 </td><td> 30.21 </td><td> 0.85 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beyin </td><td> 19.09 </td><td> 0.49 </td><td> 6 </td><td> 26,43 </td><td> 0.88 </td><td> 6 </td><td> 23.30 </td><td> 0.99 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Willis Fare Circle Nöronal ve kasılma Genler İfade için ortalama Geçiş Noktası ve Beyin Hesaplamaları floresan sabit bir düzeyde geçiş noktalarında (Cp) tarafından belirlenen kesin döngüsü karşılaştırılmasına dayanır. geçiş noktası büyütme eğrisinin maksimum ikinci türevi karşılık gelen devir sayısıdır. Daha yüksek Cp değerleri ifade alt seviyeleri ile ilişkilidir. Cp referans gen 35. (A) &#39;Cp aşarsa bir genin ekspresyon tespit edilemez olarak kabul edilmektedir: GAPDH; ve kasılma genlerinin: SMA, smoothelin, SMMHC ve E-selektin (B) referans genin Cp:. GAPDH; ve nöronal genler Mogadorian ve MAP2.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis at JoVE.com

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Willis Fare Çemberi Ayırma Protokolü

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

protocol-for-isolating-the-mouse-circle-of-willis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.0K Görüntüleme.  Sorbonne Universités. We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Video: Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Sol ön inen arter ligasyonu ile Miyokard İskemi-reperfüzyon Hasarı bir fare modeli

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Tıp

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

Farelerde Konjonktival Kommenal İzolasyon ve Tanımlama

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

İzole Hipotalamik Nöronların Hormonal, Metabolik ve Elektriksel Regülasyonu

Isolation of Targeted Hypothalamic Neurons for Studies of Hormonal, Metabolic, and Electrical Regulation

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As the functions of the hypothalamus are controlled by specific subsets of neuronal populations, the ability to isolate them provides a major tool for studying metabolic mechanisms. In this regard, the neuronal complexity of the hypothalamus poses exceptional challenges. 
For these reasons, new techniques, such as Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS), have been explored. This paper describes a new application of magnetic-activated cell sorting (MACS) using microbead technology to isolate a targeted neuronal population from prenatal mice brains. The technique is simple and guarantees a highly pure and viable primary hypothalamic neuron culture with high reproducibility. The hypothalamus is gently dissociated, neurons are selectively isolated and separated from glial cells, and finally, using a specific antibody for a cell surface marker, the population of interest is selected. 
Once isolated, targeted neurons can be used to investigate their morphological, electrical, and endocrine characteristics and their responses in normal or pathological conditions. Furthermore, given the variegated roles of the hypothalamus in regulating feeding, metabolism, stress, sleep, and motivation, a closer look at targeted and region-specific neurons may provide insight into their tasks in this complex environment.

Yazar Spotlight: Hipotalamik Nöral Mekanizma Öngörüleri 

Here we present a protocol to grow specific hypothalamic cell subtypes in culture. The cells can be selected based on opportune/unique membrane markers and used in many applications, including immunofluorescence, electrophysiological, and biochemical assays.

Hormonal, Metabolik ve Elektriksel Düzenleme Çalışmaları için Hedeflenen Hipotalamik Nöronların İzolasyonu

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As ...

Nörobilim

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the three-dimensional tissue morphology is from such sections. In addition, the sections of tissues examined may not contain the region within the tissue that is necessary for the purpose of the ongoing study. This latter limitation hinders histopathological studies of blood vessels since vascular lesions develop in a focalized manner. This requires a method that enables us to survey a wide area of the blood vessel wall, from its surface to deeper regions. A whole mount en face preparation of blood vessels fulfills this requirement. In this article, we will demonstrate how to make en face preparations of the mouse aorta and carotid artery and to immunofluorescently stain them for confocal microscopy and other types of fluorescence-based imaging.

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

A procedure for making en face preparations of the mouse carotid artery and aorta is described. Such preparations, when immunofluorescently stained with specific antibodies, enable us to study localization of proteins and identification of cell types within the entire vascular wall by confocal microscopy.

Fare Kan Gemilerinin Yüz Yüzey Hazırlığı

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

Biyoloji

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Willis Fare Çemberi Ayırma Protokolü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Sol ön inen arter ligasyonu ile Miyokard İskemi-reperfüzyon Hasarı bir fare modeli

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Farelerde Konjonktival Kommenal İzolasyon ve Tanımlama

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Hormonal, Metabolik ve Elektriksel Düzenleme Çalışmaları için Hedeflenen Hipotalamik Nöronların İzolasyonu

Hormonal, Metabolik ve Elektriksel Düzenleme Çalışmaları için Hedeflenen Hipotalamik Nöronların İzolasyonu

Hormonal, Metabolik ve Elektriksel Düzenleme Çalışmaları için Hedeflenen Hipotalamik Nöronların İzolasyonu

Fare Kan Gemilerinin Yüz Yüzey Hazırlığı

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu