We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1. צמח צמיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח לעקר זרעים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר זרעים (עד 30 מ&quot;ג) על ידי שיטה רטובה או יבשה. כדוגמה, עבור שיטת עיקור יבש, מוסיפים 1 מ&quot;ל קרחונים HCl 37% ב 50 מ&quot;ל אקונומיקה, בכוס זכוכית ייבוש סגור לפחות 4 שעות ועד לילה. בצע פעולה זו במנדף כימי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את הזרעים סטרילית על צלחות עם אגר צמח 0.8% ב 0.5x Murashige &amp; Skoog (MS) בינוני. גלישת צלחות עם Parafilm או קלטת נקבובי ומכסים ברדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הצלחות ב 4 ° C. עבור 1 - 4 ימים כדי לקדם נביטה אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את צלחות חדרי צמיחה מתאימים לגידול שתילים ארבידופסיס. מניחים את הצלחות אנכית כדי לשמור על צמיחה שורש על גבי המדיום אגר ולמנוע חדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתילי העברה קוֹבֵעַ 7 ימים לאחר הנביטה (DAG). </li></ol> קיבוע 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 50 מיליליטר ריצ&#39;רדסון solution על ידי שילוב כמויות שווות של 1 בורקס% (סוכן חיץ), 1% מתילן כחול 1% Azure (צבעי היסטולוגית) במים מזוקקים פעמים. סינון דרך מזרק מונע 0.22 מיקרומטר יחידת מסנן PVDF לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של מקבע: 1.25% Glutaraldehyde ב 0.05 M נתרן Cacodylate (סוכן חציצה). הערה: חומרים אלה רעילים ויש לטפל במנדף כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של פתרון ריצ&#39;רדסון (ראה 2.1) לפתרון קיבעון (ראה 2.2) כדי לקבל את פתרון קיבעון הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק היטב בכל צלחת 6-היטב עם שם המדגם המקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 3 - 2 מ&quot;ל פתרון קיבעון הסופי (ראה 2.3) לתוך הבארות, כך שתילים, הועבר פעם, יכוסו באופן מלא בנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות, באמצעות מלקחיים, עד 10 שתילים היטב כל אחד. חותם את הצלחות באמצעות Parafilm. חנות ב 4 ° C, בחושך, לפחות לילה אחד, עד שבוע. </li></ol> התייבשות 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; מייבשי שתילים. ולהעבירם בין הבארות של 6 צלחות באר חדשות, המכילים ריכוז גדל והולך של אתנול, כמפורט כאן: אתנול 10% במשך 15 דקות; 30% אתנול במשך 15 דקות; 50% אתנול במשך 15 דקות; 70% אתנול במשך 15 דקות; 85% אתנול במשך 15 דקות; 95% אתנול במשך 15 דקות; אתנול 95% ב 4 ° C, לילה, לכל הפחות. טפל שתילים ידי אחיזה אותם בקפידה על ידי cotyledons שלהם, העדיף עם מלקחי פלסטיק. </li></ol> 4. הסתננות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני חדיר. מערבבים את התוכן של 1 שקית של מפעיל ערכת historesin עם 50 ערכת נוזל שרף בסיסי מ&quot;ל בבקבוק זכוכית קטן. מערבבים עם מגנט עבור 20 דקות. מדיום הסתננות נשמר ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק היטב בכל צלחת 6-באר חדשה עם השם מדגם המקביל ולמלא עם 2 - 3 מ&quot;ל של מדיום הסתננות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השתילים מפתרון אתנול 95% עד הבינוני החדיר באמצעות מלקחיים. ודא את השתילים הם פוlly מכוסה על ידי המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים לפחות, כדי להבטיח חדירה מקסימלית לתוך רקמות הצמח. </li></ol> 5. הכנת בלוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח תוויות קטנות, עפרונות המסומנות שם מדגם, בתוך היטב בכל הטבעת תבניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הטבעה בינוני על ידי הוספת המקשה 1 מ&quot;ל ל 15 מ&quot;ל בינוני חדירה (ראה 4.1). אל תנסה להכין נפח קטן יותר מ -15 מ&quot;ל, כדי למנוע בעיות פילמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו חצי היטב כל העובש עם 200 μl הטבעה בינוניים ומכסי חתיכת סרט תקורה לחתוך את צורת העובש, אלא בגודל 1 מ&quot;מ גדול יותר בכל צד. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 2, כדי לאפשר פילמור. אינו עולה על 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יצוו נוסף של הטבעה בינונית (ראה 5.2) ולשמור על קרח, כדי למנוע פילמור בעוד טיפי שורש שמתבצעים מסודרים העובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כל קצה השורש תחת בהיקף לנתח באמצעות אזמל בזהירות רבה העמדה שאני<html> t: אנכי עבור סעיפים רוחביים או אופקי עבור חתך לאורך, בסביבות 2 - 3 מ&quot;מ מפריפרית העובש. ממלא את התבנית לחלוטין עם פתרון חסימה ומכסי סרט תקורה. ראוי לציין, כי הפתרון החוסם יתכווץ מעט לאחר שהוא polymerized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות, לכל הפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייבש את אבני, למקם בתוך קופסה עם ג&#39;ל סיליקה יבש ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך הלילה, לכל הפחות. </li></ol> 6. חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן סכיני זכוכית מוטות זכוכית עם מתקן להכנת סכין. השתמש סכיני הזכוכית עבור חתך רקמות. חותך את מוט הזכוכית לריבוע ולאחר מכן לחתוך את הכיכר באלכסון כדי לייצר שני סכינים, באמצעות כלי ניקוד יהלומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוקי סעיף לתוך 2 - 3 מיקרומטר פרוסות רוחב, באמצעות מכונת חתך. פרוסות מקום בשקופית זכוכית, על גבי טיפות מים מזוקקים במקום להחליק על גוש חום מוגדר אש נמוכה (50 - 60 מעלות צלזיוס), עד מים מתאדים. </li></ol>התחת = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. חלק כנה מיקרוסקופ Polarized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון ריצ&#39;רדסון (ראה 2.1) ל -0.2% מהפתרון המקורי ולהשתמש 1 מ&quot;ל של זה כדי לכסות את פרוסות. מניח על הגוש החום למשך 5 שניות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את השקופית על פלטה חשמלית. שימו לב תחת בהיקף לנתח ולסמן האחורי של השקופית עם סמן, כדי לציין את המיקום של פרוסות של עניין, כדי להקל על זיהוי מאוחר יותר שלהם תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של בינוניים כיסוי גוברים עם להחליק את מכסה. </li></ol> 8. Image Acquisition <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את שקף המכוסה המכיל את סעיפי השורש תחת מיקרוסקופ אור מצוידת במערכת Polscope מתאימה לקבל מידע retardance ומסנן אופטי מקטב / הפרעה (AD איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלה בחר המאפשר ויזואליזציה ברורה מכלל המדגם (למשל, 40X במחקר זה) ולמקד את microscopדואר על שדה ריק המכיל סעיף לחסום אבל לא בקטע שורש. נסה למצוא באזור נקי ללא פגמים. השתמש באזור זה כדי להגדיר את הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מערכת הדמיה ופרמטרים תוכנה: מגוון הגדר עד 17 ננומטר. החל &quot;חשיפה אוטומטית&quot; ולקבל תמונת רקע מהתחום הריק (ראה 8.2). תמונת רקע אחד משמשת לכל ניסוי. </li></ol> 9. ניתוח Polscope של כיווניות התאיות מיקרופיברילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח סעיפים אורכים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופיות המכילות סעיפים אורכים מתחת למיקרוסקופ לקבל תמונת retardance ממנו. פוקוס מיקרוסקופ על קטע של עניין שורש. תן שם קובץ חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צילום תמונת abrio (תמונה עם מידע פיגור) דרך החלון &quot;Abrio החי&quot;. הקפד ללכוד קטע זה כולל את דופן התא, אשר ניתן לזהות על ידי תאית מוכתם רץ לאורך בפריפריה של התא, כפי שמוצג באיור 2C.</li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פעמיים על התמונה הרלוונטית בערימה תמונה. בחר &quot;צבע כיווניות פסאודו&quot; בלשונית &quot;הגדרות תצוגה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את הזווית התאית מיקרופיברילות, להתאים את הגוון מקביל דופן תא לזה של גלגל הצבעים. הערה: גלגל הצבעים באיור 2C משקף את הציר האיטי של אור שוכב לאורך מיקרופיברילות המצביע על הכיוון לאורך ציר זמן של מיקרופיברילות. הזווית של מיקרופיברילות התאית היא הזווית שצוינה על ידי הצבע ואת ציר זמן של התא. לדוגמה, בתא מתארך ב הבלעה מראה צבע ציאן, מוטה על ידי כ -90 ° לציר הארוך של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את זווית מיקרופיברילות הממוצעת בקיר התא, השתמש &quot;retardance ו אזימוט בול&quot; כלי מסרגל הכלים של התוכנה. בעת בחירת הכלי, הצבע ולחץ על האזור של עניין בתמונה מתקבלת. הערה: wil זהתוצאת l בתצוגה של הזוויות (אזימוט) במעלות (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת תוכנת ניתוח תמונת אור מקוטב גישה פתוחה חלופית, צהריים &quot;Pol-Analyzer&quot; תוסף מתפריט התוסף. בחלון החדש שנפתח, בחר את הכרטיסייה &quot;שבירה כפולה&quot; ופתוח ולאחר מכן שמור את הקובץ הרקע ואת קובץ התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון התמונה, בחר &quot;מפרט.&quot; ולהתאים את &#39;גודל ROI פיקסל&#39; (שימוש 5 פיקסלים למחקר זה). ב &quot;המפרט&quot;. חלון, בחרו &quot;צג ערכים בטבלת תוצאה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי מצולע כדי לסמן את האזור של עניין בחלון התמונה. בחר &quot;קווי התמצאות&quot; כדי להשיג את הכיוון של מיקרופיברילות התאית. הערה: זה יגרום התצוגה של זוויות (אזימוט) במעלות. הערה: הזווית הממוצעת מחושבת על ידי אחת משתי השיטות צריכה להיות מנורמלת אז למיצובה של סעיף השורש לאורך השקופית. כדי לתקן את הסטייההמיצוב האופקי של סעיף השורש השלם לאורך השקופית, לכמת את זווית מיקרופיברילות הממוצעת של דופן תא איגוף התא לאורך הציר הארוך שלה (כלומר, בניצב הסעיף ולאורך ציר צמיחת שורש, איור 2C). זווית זו היא 180 ° כאשר סעיף השורש ממוצבת בצורה מדויקת לאורך השקופית. לצורך חישוב זווית מיקרופיברילות, להפחית את זווית מיקרופיברילות נמדד ממוצע של דופן תא האיגוף מ -180 °. מוסיפים את הפער נבע לזווית מיקרופיברילות נמדד הממוצע של דופן התא שנמצאת שטוח בשקופית. </li></ol></li></ol> 10. ניתוח Polscope של גבישי תאית הצטברות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסעיפים הרוחביים (צלב). שים לב הצטברות גבישי תאית ניתן להשוות רק בין תאים כאשר מיקרופיברילות התאית שלהם מיושרות בזווית דומה (כפי שנקבעה 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פעמיים על התמונה הרלוונטית בערימה תמונה. בחר &quot;Pseudo צבע &quot;&quot; כרטיסיית הגדרות תצוגה &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד retardance. זום-אין על התמונה. בחר &quot;אזור&quot; ולסמן כל אזורי עניין. עבור אל הכרטיסיה &quot;מדידות&quot; ו &quot;העתק ללוח&quot; כל הערכים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הנתונים ל- Excel ולחלץ מידע הנדרש (ממוצע באזור retardance). לנרמל את הנתונים. הערה: כדי להסביר את ההבדלים בין עובי הפרוס, מבטאת את הערכים ביחס יתרון דופן תא ספציפי בשקופית. כדי לנרמל, לחלק את retardance הממוצע המתאים את דופן התא של ריבית על ידי retardance הממוצע של דופן תא שונה באותה התמונה. לדוגמא, את דופן התא החיצונית באפידרמיס הייתה מנורמלת את דופן תא בקליפת המוח הפנימית במחקרנו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מדידות לפחות 3 חלקים לכל שורש, עם מינימום של 3 שורשים לדגימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).</li><li>Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+and+cell+wall+signaling+in+plants.">Growth control and cell wall signaling in plants.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).</li><li>Mazeau, K., Heux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Dynamics+Simulations+of+Bulk+Native+Crystalline+and+Amorphous+Structures+of+Cellulose.">Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose.</a> J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cellulose+fiber+structure+by+SEM,+XRD,+NMR+and+acid+hydrolysis.">Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis.</a> Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubules+optimize+cell-wall+crystallinity+to+drive+unidirectional+growth+in+Arabidopsis.">Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis.</a> Plant J. 66, 915-928 (2011).</li><li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractional+separation+and+structural+features+of+hemicelluloses+from+sweet+sorghum+leaves.">Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves.</a> Bioresources. 7, (2012).</li><li>Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+leucine-rich+repeat+receptor+kinases+mediate+signaling,+linking+cell+wall+biosynthesis+and+ACC+synthase+in+Arabidopsis.">Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).</li><li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Cellulose+Reorientation+during+Cell+Wall+Expansion+in+Arabidopsis+Roots.">Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots.</a> Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).</li><li>Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+of+cortical+microtubules+stimulates+tangential+expansion+and+reduces+the+uniformity+of+cellulose+microfibril+alignment+among+cells+in+the+root+of+Arabidopsis.">Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).</li><li>Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birefringence+of+native+cellulosic+fibers.+I.+Untreated+cotton+and+ramie.">Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie.</a> J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).</li><li>Abraham, Y., Elbaum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+microfibril+angle+in+secondary+cell+walls+at+subcellular+resolution+by+means+of+polarized+light+microscopy.">Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy.</a> New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).</li><li>Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Arabidopsis+root+development.">Control of Arabidopsis root development.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).</li><li>Vanstraelen, M., Benkova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+Interactions+in+the+Regulation+of+Plant+Development.">Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).</li><li>Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control:+brassinosteroid+activity+gets+context.">Growth control: brassinosteroid activity gets context.</a> J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).</li><li>Fridman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+growth+is+modulated+by+differential+hormonal+sensitivity+in+neighboring+cells.">Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells.</a> Genes Dev. 28, 912-920 (2014).</li><li>Vragovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translatome+analyses+capture+of+opposing+tissue-specific+brassinosteroid+signals+orchestrating+root+meristem+differentiation.">Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).</li><li>Hacham, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brassinosteroid+perception+in+the+epidermis+controls+root+meristem+size.">Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size.</a> Development. 138, 839-848 (2011).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cellulose+synthase-associated+protein+required+for+cellulose+biosynthesis.">Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).</li><li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+controlled+by+ANAC033/SOMBRERO+determines+root+cap+organ+size+in+Arabidopsis.">Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 24, 931-940 (2014).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest.

כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת ההצטברות של תאית גבישים ברקמות השונות המרכיבות את השורשים ארבידופסיס, תוך שמירה על מידע אנטומי. ככזה, הוא מספק צעד נוסף להבנת תהליכי צמיחת צמחים ברזולוציה הסלולר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לחקר מיני צמחים נוספים ואיברים. מספר נקודות יש לקחת בחשבון בעת ​​יישום השיטה. הצטברות ראשית, תאית גבישים ב קטע שורש נתון ניתן להשוות בין רקמות, בקרב חלקים מן גנוטיפים שונים ובקרב טיפולים אם הכיוון של תאית מיקרופיברילות שלהם דומה. האורינטציה התאית מיקרופיברילות נקבעה בסעיף האורך המכיל פנים אחד של קיר התא 18. לפיכך, הסדרה של סעיפים אורכים, מכסה את הרקמות המובהקות של השורשים, מהשכבות החיצוניות לאלה הפנימיים ביותר, לאפשר analysהוא האורינטציה תאי מיקרופיברילות ברקמות השונות, ובשלב ההתפתחותי נתון. בדוגמא המוצגת כאן, תאי meristematic של יש האפידרמיס מגוון רחב של אורינטציות מיקרופיברילות תאיות עם זווית מיקרופיברילות תאית ממוצעת של 140 מעלות, בעוד התאים מתארכים של האפידרמיס יש מבנה מאורגן יותר, עם זווית מיקרופיברילות תאית ממוצע של 120 °. מדידות אלה היו דומות בין סוג בר המוטציה של עניין, ובכך לאפשר השוואה בטוחה של ההצטברות התאית גבישים היחסיים, בסוגי התאים המתאימים אזור התפתחותית. שנית, השתנות הרוחב של החלקים השונים יכולות להשפיע על הרמות של retardance האור נמדדו. זה לעקוף כאן על ידי נרמול המדידות retardance הגלם של ברקמות של עניין (תאי אפידרמיס) למדידה retardance של רקמות שונות (תאים בקליפת המוח). הערכים המנורמלים arדואר משווה (ראה איור 2E-G). לבסוף, סעיפים רוחביים לאורך השורש, ללכוד אזורי התפתחותיים שונים. זיהוי של אזורים אלה החתך חשוב לפרשנות של הנתונים. פסד של שכבת תאי כובע שורש לרוחב החיצונית בסעיף מהווה סמן אזור פשוט. באופן כללי, תאים מתחילים התרחבות המהירה שלהם כאשר תא הבכור של כובע שורש לרוחב עובר באופן מתוכן מוות של תאים, ולאחר מכן, האפידרמיס המוגן הופך הרקמה החיצונית 19. נכון לעכשיו, שיטות המספקות מידה ברזולוציה הסלולר של היחס בין הגבישים לעומת התחומים התאיים אמורפי חסרות. אכן, זוהי גם מגבלה אחת של השיטה המוצגת כאן. עם זאת, יכולתו לתקשר ההצטברות של גבישים תאיים כשלעצמה היא התקדמות משמעותית, כמו רמות גבוהות יחסיות של תאית גבישים סבירות הופכות יותרדופן תא חזקה עם חוזק מתיחה מוגבר. פיתוח של כלים ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את ההרכב בדיוק את דופן התא לצד התכונות המכאניות שלה עדיין מהווה אתגר עתיד.

דופן תא הצמח היא מבנה דינמי. תאי גידול מוקפים חומת תא ראשונית, ארגון אשר מאפשרת לתאים להרחיב. תאים אשר מפסיקים לגדול פיקדון קיר משני נוקשה יותר זה משפר את התמיכה המכאנית של הצמח. קירות תא שניהם מורכבים מיקרופיברילות תאית משוקעת בתוך גוש של סוכרים של מבנים שונים (למשל, hemicellulose ופקטין) המשתנים בהתאם לשלב ההתפתחותי השונה ורקמות 1,2. תאית הוא מסונתז כמו שרשראות של (1,4) -β-D-גלוקן כי מיושרים בחוזקה כדי ליצור את מיקרופיברילות של מבנה גבישי. תאית אמורפיים מתייחס באזורים שבהם רשתות גלוקן פחות מסודרות. היחס בין הגבישים ואת תחומי אמורפי הוא פרמטר אחד חשב להשפיע על התכונות המכאניות של דופן התא, על ידי מתן כוח מכאני מאפיין viscoelastic, בהתאמה 3. כמה שיטות כברפתח על מנת לזהות ולכמת שתי צורות של הסדר תאי, ביניהם עקיף של קרני רנטגן, קיטוב צלב / זווית קסם ספינינג NMR 4-המצב מוצק. קרן ה- X עקיף יכול לשמש כדי לקבוע את שיעור גבישים לעומת תחומים תאיים אמורפי במדגם 5. שיטה חלופית משתמשת חלוקה של תוכן דופן תא לחומר חומצה-מסיס וחומצה מסיסה, להבחין בין הגבישים ו התאי אמורפי או פולימרים אחרים, בהתאמה. לפי גישה זו, שילוב של גלוקוז שכותרתו ([14 C] גלוקוז) משמש לכמת את 6,7 התאית. שיטות אלו דורשים כמויות גדולות של חומר צמחי עבור ניתוחים איבר שלם, במקרה הטוב, ומכאן, רגישים במידה מספקת כדי וריאציה רקמות ספציפיות במבנה דופן התא. ויזואליזציה של מיקרופיברילות התאית ברזולוציה הסלולר ניתן להשיג במחקרי הדמיה חיה בשילוב עם צבעי ניאון 8,9, שיכול לזהות שינוייםאת הכיוון של מיקרופיברילות התאית. עם זאת, צבעים אלה אינם משמשים כימות, הם אינם ספציפיים צחים תאיים ועלולים להפריע במבנה הרגיל של תא הקיר 8. Polscope היא טכניקת הדמיה המסתמכת על היכולת של תאית גבישים לפצל קרן אור ולעכב חלק 10 האור. פיגור אור הוא חזק ביותר עבור מיקרופיברילות העומדים בניצב לכיוון התקדמות אור. לקבלת מיקרופיברילות עם אוריינטציה דומה, גבוה יותר את מידת crystallinity, גדול יותר retardance אור 11. לפיכך, polscope משמש ללמוד הוא את הרמות היחסיות וכיוון של מיקרופיברילות התאית. שורשים להפגין צמיחה ליניארית, שבמהלכו תאים שמקורם בבית נישת תאי גזע, על קצה השורש, לעבור סדרה של חלוקות תא, לפני שהם להרחיב במהירות 12. התאים המרכיבים את השורש להרחיב בתוך חד כיווני (איזוטרופי)באופן, המוכתבים על ידי הורמוני איתות מולקולה קטנים להשפיע על המאפיינים של דופן התא 13. תגובות דיפרנציאלי להורמונים, בזמן ובמרחב, לספק אמצעי להבטחת צמיחת איבר מאוזן 14. לפיכך, ניתוח ברזולוציה גבוה של מבנה דופן תא יכול לספק מידע חשוב צורך להבין טוב יותר את הקשר בין תגובות סוג התא ספציפי לצמיחת איבר שלמה. כאן אנו מדווחים יישום polscope ללמוד הצטברות ספציפי רקמות של תאית גבישים בשורשי ארבידופסיס, כפי שנצפה בסעיפים אנטומיים באיכות גבוהה. שיטה זו חשפה לאחרונה תא הצטברות סוג ספציפי של תאית גבישים בתגובת הפרעות המרחבית של פעילות הורמונלית 15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>LOBA CHEMIE&#160;</td>
			<td>6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter&#160;</td>
			<td>MILLEX-GV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica kit historesin&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7022 18 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding molds</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>film 100&#181; P.P.C.&#160;</td>
			<td>www.Jolybar.com</td>
			<td></td>
			<td>overhead film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knivemaker</td>
			<td>LKB</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratome III</td>
			<td>LKB</td>
			<td>8800</td>
			<td>Ultratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon immumount&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>9990402</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrio imaging system</td>
			<td>CRI</td>
			<td>Abrio imaging system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrio V2.2 software</td>
			<td>CRI</td>
			<td>Abrio V2.2 software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open access polarized light image analysis software &#160;</td>
			<td>OPS</td>
			<td>OpenPolScope</td>
			<td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution quantification of crystalline cellulose accumulation in arabidopsis roots to monitor tissue-specific cell wall modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

אנחנו בוחנים את ההשפעה של תגובות סוג התא ספציפי כדי ברסינוסטרואיד (BRS), באמצעות שורש ארבידופסיס כאיבר מודל 15-17. כאשר BRI1 קולטן BR הוא ממוקד, ברקע של מוטצית bri1, לקבוצת משנה של תאי אפידרמיס הנקראים תאים הלא שיער (איור 2 א &#39;, ב&#39;), זה מעכב הרחבת תא חד כיווני של תאי שכנים, ושלמי שורש צמיחה של 15. ניתוח Polscope בוצע על מנת לחשוף את המנגנון בסיסי עיכוב זה. סעיפים אורכים של השורש המתקבל סוג הבר מקווי להביע BRI1 בתאי שיער הלא בלבד, הראו נטייה דומה של מיקרופיברילות התאית (איור 2 ג, ד, והסביר כמו 9.2.3), המאפשר השוואה של ההצטברות היחסית של גבישים תאית בתאים meristematic האריכה, באמצעות חתכים שנלקחו באזורים אלה (איור 2E, F). ניתוח זה הראה correlatיון בין ביטוי BRI1 בתאים שאינם שיער וצבירה מקומית של תאית גבישים. מעקב ניסויים הראו כי עיכוב קל של synthase התאית על ידי ריכוזים נמוכים של isoxaben הוריד את רמת תאית גבישים בתאים אלה, אשר בתורו, שוחזרו חלקית עיכוב צמיחה, באמצעות קידום הרחבת תא חד כיווני ואורך שורש 15. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53707/53707fig1.jpg" /> איור 1:. מערכת מיקרוסקופ אור מקוטב מערכת Polscope מורכבת מיקרוסקופ אור (א), מצויד במצלמה דיגיטלית CCD (B), מנתח גביש נוזלי ירוק ממוקם על גבי מקור האור שלה (ג) (ד). תוכנת Abrio שמשה לרכישת תמונה וניתוח. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53707/53707fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן t</a>o לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53707/53707fig2.jpg" /> איור 2: ניתוח Polscope של רכב Cell-סטריט. (א) חתך של שורש ארבידופסיס העיקרי מראה ארגון רדיאלי של רקמות המרכיבות אותה. מבין אלה, תאים שאינם שיער אפידרמיס (N); תאי שיער (H) ואת הקליפה (C) מסומנים. בר, 10 מיקרומטר. (ב) תמונות במיקרוסקופ Confocal של שורשים להביע BRI1-GFP ממוקד תאים שאינם שיער. לבן, מכתים PI המסמן את התאים, ירוק, ביטוי BRI1-GFP. בר, 20 מיקרומטר. (C) סעיפים אורכים של שורשים המתקבלים סוג הבר מצמח להביע BRI1 בתאים שאינם שיער. הזווית של מיקרופיברילות התאית (כלומר, את הזווית בין צבע ציר תא ארוך, המשקף לציר הארוך של השורש) דומה בין שני הקווים. דופן התא איגוף התא יחד l שלהציר אונג מכותר; סימן זווית לייצג את דופן התא המוצלת נמדדת. בר, 50 מיקרומטר. (ד) כימות של זווית תאי מיקרופיברילות בקירות תא אפידרמיס. הערת ההשתנות הגבוהה של הזוויות הנוכחיות בתאי meristematic (כלומר, אזור meristematic, MZ) לעומת תאים באזור המעבר (ט&quot;ז), כפי שמשתקף עלילת התיבה. הזווית הממוצעת תאית הדומה מיקרופיברילות בין סוג הבר וצמחים להביע BRI1 בתאים שאינם שיער מאפשרת השוואה של הצטברות תאית גבישים בתאים של אזור התפתחות המקביל שלהם. הזווית הממוצעת במדגם כל מותווה על ידי קו אדום. (EF) רוחבי שורש קטעי רקע צמח אותם, לראות במצב retardance אור. סולם צבעים מייצג retardance לאור 0 - 17 ננומטר. הסעיפים המתאימים meristem (E) ואת ההתארכות אזורית (F) מוצגים. בר, 50 מיקרומטר. דופן תא אפידרמיס החיצונית והפנימיתדופן תא בקליפת מוח מוקפת. (G) כימות ערכי retardance כפי שחושבים מתמונות polscope. הערכים באים לידי ביטוי כיחס retardance בין דופן התא החיצונית באפידרמיס ואת דופן תא בקליפת המוח הפנימית. ראוי לציין, כי בתצהיר הגבוה של תאית גבישים בתאים שאינם שיער בקווים להביע BRI1 בתאים אלה בלבד. ממוצע + SE; 40 &lt;n &lt;600; (**) P &lt;0.01; (***) P &lt;0.001 במבחן t-דו-זנבי. הדמות שאומצה שונה מ 15. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53707/53707fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications at JoVE.com

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

8.1K Views.  Technion-Israel Institute of Technology. Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Video: High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

שימוש במשטח סורקים לאיסוף תמונות-פקע זמן ברזולוציה גבוהה של ארבידופסיס רוט Gravitropic התגובה

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...