עבודה זו מומנה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדע (מספר הפרסים IOS-1,031,416) ונערכה בשיתוף פעולה עם נתן מילר, לוגן ג&#39;ונסון ואדגר ספולדינג של אוניברסיטת ויסקונסין ובריאן Bockelman, קרל Lundstedt ודיוויד סוונסון של אוניברסיטת הולנד מרכז המחשוב של נברסקה.

1. תמונת רכישת פרוטוקול שיקולים: פרוטוקול זה מתבצע בצורה היעילה ביותר עם שני אנשים, למרות שזה אפשרי עבור אחד כדי לעבוד לבד. סידור עבודה הטוב ביותר במעבדה זו היה עבור אדם אחד כדי להכין צלחות לסריקה בזמן עבודות אחרת בהתקנה של סורק, ואז שניהם לעבוד יחד כדי למקם צלחות בסורקים ולהתחיל בתהליך הסריקה. חשוב גם לציין כי הסורקים בפרויקט זה הם בכיוון אנכי עם מכסי הסורק נחו על גביו של הסורק. תמיכה מותאמת אישית נעשתה להחזיק כלים במצב אנכי והוצמדה אל פני השטח השטוח עם רצועות 3M פיקוד (איור 2). מכסה המסמך הנשלף שמגיע עם הסורק בשימוש בפרוטוקול זה (V700 Epson) היה מצופה בצד אחד עם לבד שחורים. מכסה המסמך הוצב נגד הגרר עם כבל באנג&#39;י כדילהחזיק את הצלחות במקום ולספק ניגוד תמונה (איור 3). כל סורק ברזולוציה מספקת יכול לשמש ללכידת תמונה. V700 שלמות Epson נבחר בגלל הפרופיל שלו מרובע (מה שהופך אותו קל למצב אנכי), ברזולוציה הגבוהה שלה, ואת האפשרויות נוספות כדי לסרוק משתי המיטה והמכסה ולהשתמש בערוץ אינפרא אדום. אפשרויות נוספות אלה לא היו בשימוש בפרוטוקול זה. לאחר הצלחות הוסרו מחדר הצמיחה, זוהי החובה של הפרוטוקול להמשיך עד הסוף. הכנת צלחת מנות סטנדרטיות פטרי המכילות 10 מיליליטר של מדיום שקוף ו9 זרעים שניטעו לאורך מרכז כל צלחת היו בשימוש. ניתן למצוא נהלים לתיוג צלחת, הכנת תקשורת ושתילה ב: <a href="http://www.doane.edu/doane-phytomorph">http://www.doane.edu/doane-phytomorph</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; אחזר את הצלחת אגר הראשונה ולספוג עיבוי נאסף על המכסה והשפה של המכסה של הצלחת אגר עם Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טריטון X-100 (חומרי ניקוי) למכסה עם Kimwipe - להיות נדיב. (שים לב שטריטון X-100 עוזר למנוע ההצטברות של עיבוי על המכסה כצלחת נסרק. יישום נדיב (מספיק כדי ליצור סרט על פני השטח המכסה) יעזור לוודא כי המכסה נשאר שקופה לאורך כל ריצת הסורק .) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עטוף את הצלחת עם קלטת micropore כדי לאבטח את המכסה, וכדי לאפשר אוורור. </li></ol> התקנת סורק ואוסף תמונות פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה שנמצא בשימוש סורק יותר מ 1, ומספק הוראות כדי להתחיל סורקים מרובים ממחשב אחד. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור תיקיות לאחסון תמונות מסורק. סורק כל אחד יחזיק שתי צלחות, כדי לשמור את זה בחשבון בעת ​​יצירת תיקיות. אחדייתכן שיבחר להשתמש מטה כמרכיבים של שם הקובץ, כגון תעודות זהות ייחודיות לכל צלחת, גילאי שתיל, גודל זרע, ואת תעודות זהות של המניות נטועות. דוגמא לשם תיקייה המשמשת לאיסוף נתונים המכילים מטה אלה היא &quot;1,652-2-SM-9-92-17-1653-2-LG-88-79-161&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר טיימרים פורקן מיועד זמן איסוף (9 שעות היו בשימוש במעבדה זו). הקפד להגדיר תוספת זמן (כשעה) להכנה. (שים לב שסורקים צריכים להיות מחוברים לטיימרים לשקע כדי להגדיר את זמן הרכישה. בעוד תוכנת VueScan מאפשרת למשתמש לאסוף תמונות שוב ושוב, זה לא מאפשר למשתמש לציין כמה תמונות כדי לאסוף או כמה זמן לאסוף תמונות עבור .) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הסורק הראשון ולהמתין כ 10 שניות לסורק כדי לעבור החם קופצים הראשוני שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תכנית VueScan פעם אחת. גרסת VueScan 9.0.20 הייתה בשימוש בפרוטוקול זה (ראה לוח חומרים), ניתן להשתמש בו למרות שגרסות חדשות יותר עם modific הקטןation. ודא שלחצן &#39;עוד&#39; כבר לחץ על הפנל התחתון של ממשק המשתמש כדי להציג את אפשרויות תפריט מתוארות להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה החוזרת האוטומטי: תיבה נפתחת לאף אחד תחת לשונית הקלט ותחת לשונית יבול אזור תצוגה מקדימה נקבע: למרבית (איור 4). לחץ על &quot;תצוגה מקדימה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור תיבת יבול שהיה ללכוד את האזור של עניין על ידי שימוש בעכבר כדי ללחוץ ולגרור על פני האזור של עניין בתמונת התצוגה המקדימה. הגדרות עשויות להשתנות לאזור של עניין בכרטיסיית היבול. ההגדרות טיפוסיות המשמשות לתיבת החיתוך היו: קיזוז-x .675; 1.924 ב, אם כי זה היה מותאם כדי ללכוד את אזור השתיל לכל סורק לקזז y. גודל תיבת החיתוך השתמש היה 7.246 ברחבים על ידי 1.1 בגובו (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להזיז את תיבת החיתוך, החזק את מקש Shift לחוץ בזמן גרירה עם העכבר. ודא שתיבת החיתוך מכילה את כל השתילים לסריקה בתוספת כל מטה רצוי שעשויות להיות כלול בתווית (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת לשונית היבול, להגדיר את אזור התצוגה המקדימה: לתיבת יבול ו&#39;התצוגה המקדימה &#39;לעיתונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לכרטיסיית Output ובחר את הקובץ הנכון עבור הסורק (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.7-1.12 על כל הסורקים למחשב אחד. בחר את האפשרות &quot;כן&quot; בתשובה לשאלה אם יש מקום לפתוח יותר ממופע אחד של VueScan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדרך כל כרטיסייה ולוודא שההגדרות נכונות. (שים לב שניתן לשנות את כל המפרט שיתאים לצרכימים של מעבדה בודדת כולל צבע תמונה, רזולוציה, וכו &#39;. עם זאת, הגדרות שימוש בפרוטוקול זה יכולה להיות מיושמים באופן ישיר לרשות הפלסטיניתrticular סריקת חומרה של מעבדה ניתנה בשל הממשק המשותף של תוכנת VueScan. עיין ברשימה המצורפת המפרט כדי להציג את הפרמטרים המשמשים בפרויקט זה, תוך שימוש בגרסה VueScan 9.0.20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת לשונית הקלט לבחור רציף בחוזר האוטומטי: שדה, או לבחור מרווח זמן ארוך יותר בין תמונות אם תרצה בכך. מרווח הזמן הוא משך הזמן שהסורק עוצר לאחר שמירת התמונה האחרונה ומתחיל אוסף של התמונה הבאה. במצב רציף, ניתן להשיג 3-4 ברזולוציה דקות ב 4,800 dpi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.14-1.15 למשך שארית הסורקים מחוברים למחשב בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צלחות ערוכים סורקים הנכונים עם שתילים בכיוון אופקי (לא gravistimulate). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן זמני למקם שחור, הרגיש רקע נגד הצלחות כך שהם לא נופלים מתבנית פרספקס. חזור על פעולה עבור כל הסריקהners. (הערה: בפרויקט זה, חתיכות שחורות של הלבד היו מצורפים למסמך מכסה מסופק עם הציוד כדי למנוע סנוור ולספק ניגוד נגד רקמת שורש צבע הרקע הספציפי בשימוש יהיה תלוי בצבע של להיות הדמיה רקמות.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש אדם אחד להפוך את הצלחות 90 ° (צלחות הופנו נגד כיוון השעון בפרוטוקול זה) ומייד להחליף את הרקע המורגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האדם האחר צריך להיות עומד במחשב, כך שהם יכולים ללחוץ על הכפתור &quot;הסריקה&quot; באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הרקע לסורק עם כבל באנג&#39;י (איור 3). יש אדם אחד להחזיק את הרקע במקום בעוד עמדות אחר כבל באנג&#39;י. (הערה: מייד לאחר gravistimulation (סיבוב של הצלחות ב -90 °) ומיקום של הרקע המורגש, צריכה להיות לחוץ &quot;סריקה&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.17-1.21 לשארית של הסורקים בcomput אחתאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.6-1.22 לסדרה הבאה של סורקים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תשאירו את הסורקים עד כמה תמונות כבר נאספו כדי לוודא שהם שומרים בצורה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוא אידיאלי כדי לשמור על הסורקים באזור זה יהיה נקי מהפרעות בפעם הסריקה הייעודית. זה גם נבון לשקול את התנאים הסביבתיים באזור הסריקה כדי להבטיח את תגובות פנוטיפי אידיאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר איסוף הנתונים הושלם, לחץ על הלחצן בטל הירוק על כל חלון VueScan שעולה בקנה אחד עם כל סורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את כל התוכניות במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מחדש את המחשב ולכבות את כל הסורקים לפני תחילת סבב של אוסף תמונה אחר. </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+a+gravitropism+phenotype+in+glutamate+receptor-like+3.3+mutants+of+Arabidopsis+thaliana+using+machine+vision+and+computation.">Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation.</a> Genetics. 186, 585-593 (2010).</li><li>Clack, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Tracking+of+Whiskers+in+Videos+of+Head+Fixed+Rodents.">Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents.</a> PLoS Comp. Biol. 8, (2012).</li><li>Lussier, Y. A., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+approaches+to+phenotyping:+high-throughput+phenomics.">Computational approaches to phenotyping: high-throughput phenomics.</a> Proc. Am. Thoracic Soc. 4, 18-25 (2007).</li><li>Houle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colloquium+Paper:+Numbering+the+hairs+on+our+heads:+The+shared+challenge+and+promise+of+phenomics.">Colloquium Paper: Numbering the hairs on our heads: The shared challenge and promise of phenomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1793-1799 (2009).</li><li>Elwell, A. L., Gronwall, D. S., Miller, N. D., Spalding, E. P., L, T. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+parental+environment+from+seed+size+effects+on+next+generation+growth+and+development+in+Arabidopsis.">Separating parental environment from seed size effects on next generation growth and development in Arabidopsis.</a> Plant Cell Env. 34, 291-301 (2011).</li><li>Silk, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Descriptions+of+Development.">Quantitative Descriptions of Development.</a> Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 479-518 (1984).</li><li>Cronin, C. J., Feng, Z., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+imaging+of+C.+elegans+behavior.">Automated imaging of C. elegans behavior.</a> Methods Mol. Biol. 351, 241-251 (2006).</li><li>Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-vision+analysis+of+seedling+responses+to+light+and+gravity.">Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity.</a> Plant J. 52, 374-381 (2007).</li><li>Iyer-Pascuzzi, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+Analysis+Platform+for+Automatic+Phenotyping+and+Trait+Ranking+of+Plant+Root+Systems.">Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems.</a> Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).</li><li>Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+Drosophila+wings.">Automated measurement of Drosophila wings.</a> BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).</li><li>Jahnke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MRI-PET+dissects+dynamic+changes+in+plant+structures+and+functions.">Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions.</a> Plant J. 59, 634-644 (2009).</li><li>Durham Brooks, T. L., Miller, N. D., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+Arabidopsis+Root+Gravitropism+throughout+a+Multidimensional+Condition+Space+Quantified+by+Automated+Image+Analysis.">Plasticity of Arabidopsis Root Gravitropism throughout a Multidimensional Condition Space Quantified by Automated Image Analysis.</a> Plant Physiol. 152, 206-216 (2010).</li><li>Perrin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+signal+transduction+in+primary+roots.">Gravity signal transduction in primary roots.</a> Ann. Botany. 96, 737-743 (2005).</li><li>Strohm, A. K., Baldwin, K. L., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+root+gravity+sensing+and+signal+transduction.">Molecular mechanisms of root gravity sensing and signal transduction.</a> Dev. Biol. 1, 276-285 (2012).</li><li>Harrison, B. R., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARL2,+ARG1+and+PIN3+define+a+gravity+signal+transduction+pathway+in+root+statocytes.">ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes.</a> Plant J. 53, 380-392 (2007).</li><li>Swarup, R., Bennett, M. J., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root Development. , 157-174 .</li><li>French, A., Ubeda-Tom&#225;s, S., Holman, T. J., Bennett, M. J., Pridmore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+root+growth+using+a+novel+image-analysis+tool.">High-throughput quantification of root growth using a novel image-analysis tool.</a> Plant Physiol. 150, 1784-1795 (2009).</li><li>Granier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENOPSIS,+an+automated+platform+for+reproducible+phenotyping+of+plant+responses+to+soil+water+deficit+in+Arabidopsis+thaliana+permitted+the+identification+of+an+accession+with+low+sensitivity+to+soil+water+deficit.">PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit.</a> New Phytol. , 169-623 (2006).</li><li>Walter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+seedling+growth+acclimation+towards+altered+light+conditions+can+be+quantified+via+GROWSCREEN:+a+setup+and+procedure+designed+for+rapid+optical+phenotyping+of+different+plant+species.">Dynamics of seedling growth acclimation towards altered light conditions can be quantified via GROWSCREEN: a setup and procedure designed for rapid optical phenotyping of different plant species.</a> New Phytol. 174, 447-455 (2007).</li><li>Gregory, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+imaging+of+roots+with+high+resolution+X-ray+micro-tomography.">Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography.</a> Plant Soil. , 255-351 (2003).</li><li>Pierret, A., Kirby, M., Moran, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+X-ray+imaging+of+plant+root+growth+and+water+uptake+in+thin-slab+systems.">Simultaneous X-ray imaging of plant root growth and water uptake in thin-slab systems.</a> Plant Soil. 255, 361-373 (2003).</li><li>Naeem, A., French, A. P., Wells, D. M., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+feature+counting+and+measurement+of+roots.">High-throughput feature counting and measurement of roots.</a> Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תצפית פנוטיפי מדויקת היא קריטית להבנת הגילויים של תפקוד גן בתוך האורגניזם. דרך אחת להשיג מידע פנוטיפי היא באמצעות הלכידה של נתוני תמונה ברזולוציה גבוהה. הפלטפורמה מבוססת הסורק פותחה אפשרה אוסף של תמונות רבות (200 תמונות / תקופה סריקה) ברזולוציה גבוהה (4,800 dpi) על פני מספר שעות. בנוסף, פלטפורמה זו מותאמת בקלות למגוון רחב של סביבות מעבדה וכיתה, בשל הגמישות של תוכנת VueScan לרוץ אלפי סורקים שונים באמצעות ממשק משותף 18. השיטה המוצגת כאן ממלאת את חלל בלכידת תמונת תפוקה גבוהה המשתרע ממתקנים גדולים בקנה מידה phenotyping ומערכות אוטומטיות ישימות במעבדה אחת. פלטפורמות התפוקה גבוהה זמינות כרגע נוטות להשתמש בחומרת הדמיה מיוחדת, כוללים מצלמות רכובים על תומך רובוטית, כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה של primarily מעל רקמות צמח אדמה (למשל מרכז לצמחים אינטגרטיבית טכנולוגיה וHTS Scanalyzer ידי LemnaTec) 20,21. מערכות הדמיה מיוחדות באמצעות קרני ה-X וטכנולוגיות MRI יש גם פותחו לתמונה הבאה רקמות קרקע עם רזולוציה מרשימה ככל שהם גדלים בסביבת האדמה (למשל המרכז לצמחים אינטגרטיבית טכנולוגיה) 11,22,23. התפתחות זו של טכנולוגיה מיוחדת יותר היא בדרך כלל במחיר של תפוקה, מה שהופך את לימודי פנוטיפי דינמיים יותר קשים. חשוב לציין, את הצרכים ועלות התשתית לפלטפורמות-high-end אלה להפוך אותם בעיקר ישים ליישום במעבדות קטנות יותר. פלטפורמות יש גם פותחו אשר משתמשות בטכנולוגיה לכידת תמונה סטנדרטית יותר ומתאימים גם למדידה של תגובות דינמיות כגון תגובת השורש לגירוי כוח משיכה. לדוגמא, מצלמות CCD כבר בשימוש כדי ללכוד תגובות שתיל בודדות לאור ולכח הכבידה בגבוה1,8,12 רזולוציה מרחב ובזמן. מערכות אחרות פותחו מאפשרות מדידה של נטייה קצה שורש של שורשים מרובים מתמונה אחת (למשל RootTipMulti ידי שיתופי iPlant) 17,24. במקרה הראשון, התפוקה היא נמוכה יחסית בהתחשב בעובדה שרק אחד שתיל הוא הדמיה של כל מצלמה בכל פעם, ואילו במקרה השני התפוקה היא גבוהה יותר, אבל בדרך כלל במחיר של רזולוציה. ההליך המתואר במאמר זה מציג פלטפורמה ללכידת תמונות ברזולוציה גבוהה בתפוקה גבוהה עם ציוד ותוכנה שזמינות וזולים יחסית. שימוש בהגדרה זו, ניתן לאסוף 1,080 תגובות שורש בודדים בכל שבוע במעבדה בודדת מצוידים בבנק של שישה סורקים. ב15 חודשים של איסוף ממוצע של 864 תגובות בודדות בשבוע, בסך הכל 41,625 שתילים נסרקו למחקר הגנום. אודות 15% מהאוספים הבודדים נכשלו עקב התקנת שגיאה, netwoכישלון RK או תקלה בציוד. עוד תגובות 22% נכשלו בשל חוסר נביטה או צמיחת שורש מספיקה כדי לעורר תגובת צמיחה. ערכת נתונים הסופית מורכבת מ27,475 תגובות בודדות שתיל לגירוי כוח משיכה מ163 קווים טהורים רקומביננטי בתוספת 99 קווי isogenic קרובים. הנתונים נאספו במעבדה אחת, מה שהופך את זה גישה מאוד תפוקה גבוהה. גם בהתחשב בכך שהציוד ששמש לרכישה הוא זול יחסית, הוא תפקד באופן מהימן יותר משנים אפילו עם שימוש כבד. בעוד פרוטוקול זה היה מאוד שימושי עבור מטרות המחקר של קבוצה זו, כמה מגבלות עדיין קיימות. בשל התפוקה של כ 50 GB של נתוני תמונה לא דחוסים ליום, זה היה ברור שכמות גדולה של השטח הייתה נחוצה לתמונות בית, אלא אם כן ניתן לפתח תוכניות דחיסה יעילות. בעיית האחסון נפתרה באופן זמני על ידי רכישת כוננים קשיחים חיצוניים לכל מחשב. בנוסף, שתי 1התקני אחסון הקשורים לרשת 0 חפת נרכשו. מאוחר יותר, אלגוריתמי דחיסה פותחו, כפי שתואר לעיל, אשר יכולה לעזור להקטין את גודל הנתונים בשיעור של עד 60% (איור 8). חשוב לציין כי המהירות שבה ניתן לשמור נתונים להתקן אחסון הקשורים לרשת תלויה במהירות של החיבור לרשת. דחיסת סכימות יש גם מוגבלות בשל הרצון למנוע אובדן של נתוני תמונה. מגבלות אחרות ספציפיות למערכת הדמיה מבוססת סורק גם נשקלות. לדוגמא, בגישה המבוססת על סורק שתילים נחשפו לאור בעוצמה גבוה בטווחים הלבנים ואפשרות אינפרא אדום בכל סריקה. זה סביר משפיע על צמיחת שתיל, אם כי עדיין ניתן להבחין שתילים לעבור תגובות חזקות לגירוי כוח משיכה (איור 7). שיפור בעתיד עלול להיות כרוך בתכנות סורקים כך שהנוריות אינפרא אדומות רק הן פעילים. אזור בdevelopmen הפעילt הוא יצירת אלגוריתמי ניתוח מתאים גם לרזולוציה וקצב ההעברה של נתוני התמונה הבאים. סט נתונים הגדול שנוצר באמצעות השיטה המבוססת על הסורק הזה היה אידיאלי לפיתוח של כלים חזקים לphenotyping תפוקה גבוהה של תמונות שתיל. אלגוריתם הדחיסה מועסק על תמונות אלה מוצגים באיור 7 תומך את הטענה שהם נוחים ליישומי ניתוח תמונה. בנוסף, התמונות שנוצרו יכולות להיות מנותחת על ידי האלגוריתם שפורסם בעבר, RootTrace 17,24, אם הם נאספים ברזולוציה נמוכה יותר (פחות מ 1,200 dpi), ושתילים בודדים מפולחים מהתמונה באמצעות אלגוריתם הדחיסה שתואר לעיל לפני הניתוח. נתוני צמיחת שורש אפשר להפיק מתמונות הופחתו ל 1,200 dpi בעת אפשר להפיק נתונים זווית טיפ מהתמונות מופחתות ל900 dpi (תצפית לא פורסם). ההליך המתואר במאמר זה נכנס לתוך נישה משלו בעולם של רוהדמיה לא בכך שהוא תפוקה גבוהה ורזולוציה גבוהה ועדיין להיות סביר יחסית. יתרון נוסף של גישה זו הוא שהיא יכולה בקלות להיות מותאם אישית כדי להתאים לצרכימי ההדמיה של קבוצת מחקר מסוימת.

אוסף של נתונים פנוטיפי ברזולוציה גבוהה הוא שימושי במחקרים שמטרתם להבין את יחסי הגומלין בין הגנטיקה והסביבה בתיווך 1,2 תפקוד האורגניזם. מחקרים מסוג זה הם גם גדולים מטבעם בקנה מידה, מה שהופך אותו בנוסף יש צורך כי שיטות ננקטות למדידת פנוטיפים בהקשר זה להיות גבוהות ב3,4 התפוקה. בקביעת שיטות למחקר Phenomics קנה מידה, פשרות בין התפוקה ורזולוציה נכנסות לשחק. שיטות שאינן גבוהים יותר בתפוקה גם נוטות להיות נמוך יותר ברזולוציה, ולכן קשה יותר לזהות השפעות קטנות של גנטיקה או סביבה 5. לחלופין, שיטות המודדות את הפנוטיפ רצוי בזהירות רבה יותר גם נוטות להיות נמוך יותר בתפוקה, ולכן קשה ליסקור השפעות גנטיות וסביבתיות רחב. בנוסף, שיטות ידניות לפנוטיפים כימות, כוללים בדיקה ויזואלית, יכולות להיות נתונות לשינויים בשל הבדלים לאדםception 6. טכנולוגיות הדמיה יכולות לספק גשר שימושי בין התפוקה ורזולוציה בהשגת תצפיות פנוטיפי 7-9. באופן כללי, תמונה היא קלה יחסית כדי ללכוד, להקל את התפוקה, וכאשר נלקחו ברזולוציה מספיקה, ניתן לאתר בפנוטיפים עדינים 1,2,7. טכנולוגיות הדמיה נוטות להיות לשינוי כדי שיתאים למערכת או תהליך של עניין ובאופן כללי ניתן להרחבה 10-12. בגלל זה, טכנולוגיות הדמיה הן אידיאליים לפיתוח מחקרים בקנה מידה גדולה של תפקוד האורגניזם. התגובה של השורש העיקרי לגירוי כוח משיכה היא תהליך פיסיולוגי מורכב המתרחש בתוך איבר מורפולוגית פשוט. התגובה כרוכה בהפעלה של מסלולי איתות שלהפיץ דרך איבר השורש וההתקדמות שלה נקבעה על ידי גורמים סביבתיים וגנטיים, כוללים גורמים גנטיים מושפעים מהסביבה 12-14 </sup&gt;. התגובה של השורש העיקרי לגירוי הכבידה נחקרה לפחות מאז דארווין, עדיין יש הרבה מה ללמוד על איך זה עובד, במיוחד באירועי האיתות מוקדם ובגורמים מתווכים 12,14,15 פלסטיות תגובה. השגת הבנה מפורטת של הדינמיקה של תגובה זו היא חשוב במציאת הדרכים לשפר את היכולת של שתילים להצלחה להפוך הוקם בתוך סביבת נתונה 16. בנוסף, הצורה של השורש עושה את זה נוח עבור יישומי עיבוד תמונה 8,12,17. יחדיו, תגובת gravitropic השורש היא מערכת אידיאלית לפיתוח טכנולוגיית הדמיה תפוקה גבוהה לצורך ביצוע מחקרים ברמת הגנומיקה של תפקוד האורגניזם. בדו&quot;ח זה, תפוקה גבוהה, שיטה ברזולוציה גבוהה ללכידת תמונה של תגובת gravitropic השורש באמצעות סורקים זולים, זמינים מסחרי גרר מוצגת. הסקירה שלפרוטוקול מוצג באיור 1. שתילים ניטעו על צלחות אגר הוצבו בסורקים שטוחים אנכי אוריינטציה מצוידת מחזיקי צלחת פלסטיק מותאם אישית. תמונות נאספו כל כמה דקות ב4,800 dpi ונשמרו בכונן מקומי או בשרת נתונים. מידע נוסף הקשורים לכל סדרת תמונה מאוחסן במסד נתונים ותמונות המאוחסנים מעובדים. הגישה משתמשת בתוכנת VueScan עבור לכידת תמונה. VueScan יכול לשמש כדי להפעיל על 2,100 סורקים שונים ב-Windows, Mac או מערכת הפעלה לינוקס (ראה לוח חומרים). רזולוציה של 4,800 dpi סורק הייתה בשימוש ביישום זה כדי להתאים את הרזולוציה שהושגה במחקרים קודמים באמצעות 1,8,12 מצלמות קבועות CCD. הגמישות של תוכנת VueScan יחד עם הממשק המשותף משמשת אותה לכל סורק שהוא פועל מאפשר למשתמשים לאמץ בקלות כמעט כל חומרת סורק ברזולוציה מספיקה לפרוטוקול שהוצג במאמר זה. תפוקה נוכחית מאפשרת לאיסוף216 תגובות בודדות ליום. הטכנולוגיה ניתנת להתאמה וניתן להרחבה לשימוש במוסדות, החל מבתי ספר גבוהים למחקר באוניברסיטאות. יתר על כן, התמונות שנאספו הן באיכות מספיק עבור יישומי ניתוח תמונה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V700 Photo Scanners</td>
			<td>Epson</td>
			<td>B11B178011</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas Scanner Template</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made. See Figure 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart Strap Bungee Cords</td>
			<td>SmartStraps</td>
			<td>Wal-Mart 1079478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brinks Digital Outdoor Timers</td>
			<td>Brinks</td>
			<td>Wal-Mart 42-1014-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VueScan Software</td>
			<td>Hamrick Software</td>
			<td><a href="http://www.hamrick.com/">http://www.hamrick.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Segmentation Software</td>
			<td>Chris Wentworth, Doane College</td>
			<td></td>
			<td>https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-061-655</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made by gluing two cookie racks together.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flatbed scanners to collect high-resolution time-lapsed images of the arabidopsis root gravitropic response

מאמצי מחקר בביולוגיה ויותר דורשים שימוש במתודולוגיות המאפשרות איסוף בנפח גבוה של נתונים ברזולוציה גבוהה. אתגר מעבדות יכולות להתמודד הוא הפיתוח והשגה בשיטות אלה. תצפית של פנוטיפים בתהליך של עניין היא מטרה טיפוסית של מעבדות מחקר לומדות תפקוד גן וזו מושגת לעתים קרובות באמצעות לכידת תמונה. תהליך מסוים שניתנים לתצפית תוך שימוש בגישות הדמיה הוא הצמיחה המתקנת של שורש שתיל שנעקר מיישור עם וקטור כוח הכבידה. פלטפורמות הדמיה המשמשות כדי למדוד את תגובת gravitropic השורש יכולות להיות יקרות, נמוכות יחסית בתפוקה, ו / או עבודה אינטנסיבית. נושאים אלה טופלו על ידי פיתוח שיטת לכידת תמונת תפוקה גבוהה תוך שימוש ברזולוציה גבוהה עדיין, סורקים זולים, שטוחים. באמצעות שיטה זו, ניתן ללכוד תמונות כל כמה דקות ב4,800 dpi. ההתקנה הנוכחית מאפשרת לאוסף של 216 r הבודדesponses ליום. נתוני התמונה שנאספו הוא באיכות מספיק עבור יישומי ניתוח תמונה.

נציג תמונות גישה זו מאפשרת ייצור מהיר של סדרת זמן ברזולוציה הגבוהה של צמיחת שתיל ארבידופסיס. תמונות הראשונות והאחרונה של ריצת סורק מוצגות ב7A דמויות ו7B. איורים 7C ו7D להראות תוצאות אופטימליות ממחצית מתמונת סורק מלאה. כמה בעיות שיכולות להשפיע על איכות תמונה מוצגות ב7A דמויות ו7B. נושאים אלה כוללים וריאציה בנביטה, וריאציה בשתיל מסלול צמיחה בתחילת הריצה, והצטברות של עיבוי במהלך סריקה. עיבוי במידה רבה יכול להיפתר על ידי הגדלת הכמות של טריטון X-100 מוחלת על החלק הפנימי של המכסה הצלחת. גורמים אחרים שיכולים לעכב אוסף תמונה מדויק הם תצורה שגויה של תיבת החיתוך ביחס לצלחות עמדת צלחת ומיצוב כזה שהם מוטים ביחס לתיבת החיתוך. יישומי ניתוח תמונה: דחיסת תמונה ברגע שרצף של תמונות סורק בזמן שהושג, הוא חייב להיות מאוחסן באופן מאובטח באופן נגיש ברשת כדי להקל על ניתוח תמונה. קבצי התמונה שמראה את טווח סורק פרט תופסים כמות משמעותית של שטח בכונן קשיח. קובץ TIFF יחיד שנאסף ב4,800 dpi הוא כ 220 MB וריצת סורק טיפוסית מייצרת 200 קבצי תמונה. לכן, על 44 GB של שטח כונן קשיח נדרש לריצה. כדי להפחית את עלויות אחסון ושידור ברשת הקשורים לניתוח תמונה רצוי להפחית את כמות השטח הדרושה לנתוני תמונה בחנות ובו בזמן למזער אובדן נתונים. ניתוח במורד הזרם יהיה כרוך בזיהוי של כל שתיל בקבצי תמונה הבאים הקשורים לניסוי ארוך. לכן, פילוח את שתילים בודדים מתמונת הסורק יכול להקל על ניתוח במורד הזרם. מכיוון שפילוח של השתיל משאר התמונת דואר יכולה גם להפחית את האחסון של פיקסלים רקע מיותרים באופן משמעותי, גישה זו מובילה גם להפחתה משמעותית של גודל הנתונים. יתר על כן, אם ניתוח במורד הזרם הוא ברקמת שורש ממוקד זה לא יכול להיות הכרחי כדי לשמור על מידע בצבע מאז פיקסלים השורש צרים יחסית במרחב הצבעים שלהם. פרוטוקול עיבוד תמונה במחשב וקוד כדי להקטין את גודל הנתונים על ידי שני פילוח את שתילים בודדים והמרת תמונות לאפור בקנה מידה פותח. גישת התוצאה היא הפחתת 60% בדרישות אחסון. זרימת העבודה המשמשת כדי להשיג דחיסת הנתונים אלה מתוארת בשלבים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם סדרת זמן של קבצי תמונת סורק בתיקייה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תמונה, להמיר מ RGB לאפור בקנה מידה (איור 8 למעלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצל את התמונה לצדדים ימני ושמאליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ כל שתיל מהתמונה לקובץ משלה (איור 8).הדבר נעשה על ידי החלת סף להמיר פיקסלים לשחורים או לבן ולאחר מכן חישוב עוצמת פיקסל הכוללת של כל שורת תמונה. השורה עם העצמה הגבוהה ביותר מזוהה וכל פיקסל מסווג כ &#39;מפעל&#39; או &#39;nonplant&#39; מבוסס על האינטנסיביות של שכנותיה. המרכז של כל &#39;מפעל&#39; בשורה זו נמצא ומנקודה שתיבת יבול של גודל קבוע מראש מצוירת (איור 8, למטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תיקייה נפרדת לכל צד של התמונה (שמאל וימין) עם תיקיות משנה נפרדות לכל שתיל לאחסון של קבצי תמונת סדרת זמן בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארכיון התיקיות שנוצרו לתוך קובץ ZIP דחוס. </li></ol> קוד שמשיג את הפעולות הבאות פותח באמצעות פייתון שפת תכנות 20. האלגוריתם מאפשר הפחתה של כ -60% בגודל הנתונים ומצליח בזיהוי כל השתילים הבודדים ב90% ממתארים לעצמי הסורקקבצי דואר ניתחו עד כה. הקודים הם זמינים באופן חופשי להורדה תחת גרסת הרישיון הציבורי הכללי של גני 3 (ראו לוח חומרים). <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. הליך הסריקה מתחיל בנטיעת זרעים (עד תשעה זרעי ארבידופסיס לכל צלחת) ומסתיים עם אחסון נתונים ועיבוד תמונה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. Emplate T לבנייה של תמיכת צלחת פטרי. Ple<html> xiglas נחתך כך שיתאים לרוחב משטח אופקי (במקרה זה 227 מ&quot;מ) והאורך היה 128 מ&quot;מ. שני עיגולים בקוטר 88 מ&quot;מ נחתכו מהחתיכה כזו שהם חולקו באופן שווה לאורך הרוחב והאורך של התמיכה שנותרה. התמיכה הוצמדה למשטח האופקי עם רצועות 3M פיקוד. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. תצורת סורק לאחר שתילים כבר gravistimulated ואת מכסה מסמך המיקום. זה הוא התצורה של הסורק בצעד 1.21 של התקנת סורק ואוסף תמונות.&quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4.jpg" width="500px" /> איור 4. צילום מסך של הגדרות שנבחרו לצעד 1.8 של התקנת סורק ואוסף תמונות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5.jpg" width="500px" /> איור 5. צילום מסך של תוכנת VueScan במהלך שלבי 1.9 1.10 של התקנת סורק ואוסף תמונות. התיבה האדומה מדגישה את גודל היבול תוך הקופסה הכחולה מדגישה הגדרות ספציפיות עבור<html> r-X ומשמש על מנת ללכוד שתילים ומידע תווית לקזז y. האזור השטוח לסריקה מוצג כקו מקווקו באזור התצוגה המקדימה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6.jpg" width="400px" /> איור 6. בחירת תיקיית יעד לצעד 1.12 של התקנת סורק ואוסף תמונות. לחיצה על הכפתור @ ליד תיבת תיקיית ברירת מחדל של שיח (חץ אדום) מאפשרת למשתמש לבחור את תיקיית היעד המתאימה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> מחדש 7 &quot;עבור: תוכן width =&quot; 5in &quot;עבור: src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg &quot;width =&quot; &quot;/&gt; 600px איור 7 (AD). התמונות לעיל הן דוגמאות לאלה שנאספו בשיטה המתוארת במאמר זה. פנלי A, B ו C, D הם התמונות הראשונות ואחרונה, בהתאמה, מתקופת סריקה בודדת., B להראות מלא סריקת אזור, ואילו C, D הוא אזור חתוך של האזור שנסרק, מראה צלחת אחת. ניתן לראות כמה סתירות. לוח מראה וריאציה בנביטה ובמסלול של צמיחה. לוח ב &#39;(אותו שתילים כתמונה; 9 שעות מאוחר יותר) מראה שצלחות יכולות להצטבר התעבות. C ו-D פנלים נחשבים לתוצאות טובות בשל o צמיחה האיתנהו שתילים ואיכות תמונה לאורך כל הריצה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8.jpg" width="600px" /> איור 8. אלגוריתם דחיסת התמונה פיתח ממיר תמונת סורק לאפור בקנה מידה (למעלה). התמונה מחולקת לחצאים ימין ושמאל וגבולות תמונה הוסרו (לא מוצג). עמדותיהם של שתילים בודדים על כל מחצית מזוהות על ידי מציאת השורה עם סך עוצמת פיקסל הגדול ביותר. עמדות אלה המשמשים להגדרת אזור חיתוך חדש, יחול על כל השתילים בצלחת (התחתונה). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response at JoVE.com

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

פרוטוקול זה מתאר תהליך לאיסוף מהיר של תמונות של שתילי ארבידופסיס להגיב לגירוי הכבידה באמצעות סורקים שטוחים, זמינים מסחרי. השיטה מאפשרת לכידה של תמונות ברזולוציה גבוהה נוחות לניתוח אלגוריתמים במורד הזרם זול, בנפח גבוה.

שימוש במשטח סורקים לאיסוף תמונות-פקע זמן ברזולוציה גבוהה של ארבידופסיס רוט Gravitropic התגובה

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

using-flatbed-scanners-to-collect-high-resolution-time-lapsed-images

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K Views.  Doane College.  פרוטוקול זה מתאר תהליך לאיסוף מהיר של תמונות של שתילי ארבידופסיס להגיב לגירוי הכבידה באמצעות סורקים שטוחים, זמינים מסחרי. השיטה מאפשרת לכידה של תמונות ברזולוציה גבוהה נוחות לניתוח אלגוריתמים במורד הזרם זול, בנפח גבוה. 

Video: Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

מערכת עין מתנהל שורש לרוחב ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; ותירס

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה של צומת סין- פרוזדורי העכבר

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הפונקציה מיטוכונדריאלי של תאי הבטא תקין בנוכחות תרכובות טבעיות

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...