We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1. Crescimento de Plantas <ol><li> Superfície esterilizar as sementes. <ol><li> Esterilizar sementes (até 30 mg) por via húmida ou seca. Como um exemplo, para o método de esterilização a seco, adicionar 1 ml de HCl glacial a 37% em 50 ml de lixívia, num copo de vidro em um exsicador fechado durante pelo menos 4 horas e até durante a noite. Execute esta etapa em uma capa química. </li></ol></li><li> Espalhe as sementes estéreis em placas com agar vegetal 0,8% em 0,5x Murashige e Skoog (MS). Enrole placas com Parafilm ou fita porosa e cobrir com folha de alumínio. </li><li> Armazenar as placas a 4 ° C durante 1 - 4 dias para promover a germinação uniforme. </li><li> Transferir as placas para uma câmara de crescimento adequado para o cultivo de plântulas de Arabidopsis. Colocar as placas verticalmente para manter o crescimento da raiz na parte superior do meio de agar e para evitar a penetração. </li><li> mudas de transferência para fixador 7 dias após a germinação (DAG). </li></ol> 2. Fixação <ol><li> Preparar 50 ml de Richardson Solution através da combinação de volumes iguais de 1% bórax (agente de buffer), 1% de azul de metileno e 1% Azure (corantes histológicos) em água destilada duas vezes. Filtrar através de uma seringa Impulsionada 0,22 PVDF Filtro Unidade antes do uso. </li><li> Prepare 50 ml de fixador: 1,25% de glutaraldeído em 0,05 M de sódio cacodilato (agente tampão). Nota: Estes materiais são tóxicos e devem ser manuseados em uma capa química. </li><li> Adicionar 100 uL de solução de Richardson (ver 2.1) para a solução de fixação (ver 2.2) para se obter a solução final fixação. </li><li> Mark cada poço de uma placa de 6 poços com o nome da amostra correspondente. </li><li> Coloque 2 - 3 ml de solução final de fixação (ver 2.3) nas cavidades, de modo que as mudas, uma vez transferidos, serão totalmente cobertos em líquido. </li><li> transferir cuidadosamente, usando uma pinça, até 10 mudas para cada poço. Selar as placas usando Parafilm. Armazenar a 4 ° C, no escuro, durante pelo menos uma noite, e até uma semana. </li></ol> 3. desidratação <ol> &lt;li&gt; Desidratar mudas. Transferi-los entre poços de novas placas de 6 poços, contendo concentrações crescentes de etanol, como listados a seguir: 10% de etanol durante 15 min; Etanol a 30% durante 15 min; Etanol a 50% durante 15 min; Etanol a 70% durante 15 min; 85% de etanol durante 15 min; Etanol a 95% durante 15 min; 95% de etanol a 4 ° C, durante a noite, no mínimo. Lidar com mudas, segurando-os cuidadosamente por seus cotilédones, de preferência com uma pinça de plástico. </li></ol> 4. Infiltração <ol><li> Prepare meio de infiltração. Misture o conteúdo de um saco do ativador kit historesina com 50 ml kit líquido resina básica em uma pequena garrafa de vidro. Mexa com ímã para 20 min. forma de infiltração pode ser mantida a 4 ° C durante algumas semanas. </li><li> Mark cada poço de uma nova placa de 6 poços com o nome da amostra correspondente e encher com 2 - 3 ml de meio de infiltração. </li><li> Transferir as mudas de solução de etanol a 95% ao meio de infiltração com a pinça. Certifique-se de que as mudas são fully coberto pelo meio. </li><li> Armazenar a 4 ° C durante pelo menos 4 dias, para assegurar o máximo de penetração nos tecidos da planta. </li></ol> 5. Preparação do bloco <ol><li> Coloque etiquetas pequenas, lápis-marcados com nome da amostra, dentro de cada poço de incorporação de moldes. </li><li> Prepare a incorporação meio pela adição de 1 ml de endurecedor para 15 ml de meio de infiltração (ver 4.1). Não tente para preparar um volume menor do que 15 mL, para evitar problemas de polimerização. </li><li> Encha metade de cada cavidade no molde com 200 ul de meio de fixação e cobrir com uma peça de película de sobrecarga cortadas com a forma do molde, mas a um tamanho de um milímetro maior em cada lado. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas, para permitir que a polimerização. Não exceda 5 horas. </li><li> Preparar um lote adicional de incorporação de forma (ver 5.2) e manter em gelo, para evitar a polimerização durante a pontas de raiz são dispostos no molde. </li><li> Corte cada ponta da raiz sob um escopo de dissecação usando bisturi e posicionar i com muito cuidadot: verticalmente para seções transversais ou horizontalmente para o corte longitudinal, em cerca de 2-3 mm da periferia do molde. Encha o molde completamente com a solução e cobertura de bloqueio com um filme em cima. Note-se que a solução de bloqueamento vai encolher ligeiramente, uma vez que é polimerizada. </li><li> Mantenha a temperatura ambiente durante 2 horas, no mínimo. </li><li> Para secar os blocos, coloque em uma caixa com gel de sílica seca e deixar à temperatura ambiente durante a noite, no mínimo. </li></ol> 6. Seccionamento <ol><li> Prepare facas de vidro de bastões de vidro com uma máquina de faca. Use as facas de vidro para o seccionamento de tecidos. Corte o bastão de vidro em um quadrado e depois cortar o quadrado na diagonal para produzir duas facas, usando uma ferramenta de pontuação diamante. </li><li> O bloqueio em 2 - 3 uM fatias de largura, utilizando uma máquina de corte. Coloque as fatias sobre uma lâmina de vidro, em cima de gotas de água destilada e coloque o slide em um bloco de aquecimento definido para fogo baixo (50 - 60 ° C), até que a água evapora. </li></ol><ol><li> Diluir solução Richardson (ver 2.1) a 0,2% da solução original e utilizar 1 ml de ele para cobrir as fatias. Coloque no bloco de calor durante 5 segundos e depois lave com água destilada. </li><li> Seque o slide em uma placa quente. Observar sob um escopo de dissecação e marcar a parte de trás da lâmina com um marcador, para indicar a posição das fatias de interesse, para facilitar a sua identificação mais tarde sob o microscópio. </li><li> Adicione 100 ml de meio de montagem e cobrir com uma lamela. </li></ol> 8. Aquisição de Imagem <ol><li> Colocar a lâmina coberta contendo as secções de raiz com um microscópio óptico equipado com sistema Polscope adequado para se obter informação retardância e um filtro polarizador / interferência óptica (Figura 1 dC). </li><li> Escolha de ampliação que permite a visualização clara de toda a amostra (por exemplo, 40X neste estudo) e concentrar a microscope em um campo vazio que contém seção do bloco, mas nenhuma raiz seção. Tente encontrar uma região limpa, sem manchas. Utilizar esta região para definir o fundo. </li><li> Defina o sistema de imagem e parâmetros de software: Definir intervalo para 17 nm. Aplicar &quot;Exposição Automática&quot; e obter uma imagem de fundo do campo vazio (ver 8.2). Uma imagem de fundo é usado por experimento. </li></ol> 9. Análise Polscope de Celulose microfibrila Orientação <ol><li> Análise de secções longitudinais. <ol><li> Coloque uma lâmina contendo secções longitudinais sob o microscópio e obter uma imagem de retardamento que. Concentre-se o microscópio em uma seção de raiz de interesse. Fornecer um novo nome de arquivo. </li><li> Capturar uma imagem abriu (imagem com informações retardo) através da janela &quot;Viva abriu&quot;. Certifique-se de capturar uma secção que inclui a parede celular, que pode ser identificado por a celulose corada correndo ao longo da periferia da célula, tal como mostrado na Figura 2C.</li></ol></li><li> análise de imagem. <ol><li> Dê um duplo clique sobre a imagem relevante na pilha de imagens. Selecione &quot;color Orientação Pseudo&quot; na guia &quot;Configurações de vídeo&quot;. </li><li> Para estimar o ângulo de microfibrilas de celulose, combinar com a cor correspondente da parede da célula para que, na roda de cores. NOTA: A roda de cores na Figura 2C reflecte o eixo lento da luz encontra-se ao longo da microfibrilas que indica a direcção ao longo do eixo das microfibrilas. O ângulo de microfibrilas de celulose é o ângulo indicado pela cor e o eixo longitudinal da célula. Por exemplo, a célula de alongamento na inserção mostra a cor ciano, inclinado por cerca de 90 ° em relação ao eixo longitudinal das células. </li><li> Para quantificar o ângulo médio microfibrilas na parede celular, use a ferramenta &quot;retardance e Azimute Stamp&quot; a partir da barra de ferramentas do software. Ao selecionar a ferramenta, aponte e clique sobre a região de interesse na imagem obtida. NOTA: Este will resultado no visor dos ângulos (azimute) em graus (Figura 2C). </li><li> Em um acesso aberto na luz software análise alternativa polarizada, almoço &quot;Pol-Analyzer&quot; plug-in a partir do menu plugin. Na nova janela aberta, selecione a guia &quot;Birefringence&quot; e aberto e, em seguida, salve o arquivo de fundo e o arquivo de imagem. </li><li> Na janela de imagem, selecione &quot;Specs&quot;. e ajustar o &quot;tamanho do pixel ROI &#39;(use 5 pixels para este estudo). No &quot;Specs&quot;. janela, selecione &quot;Mostrar valores na tabela de resultados&quot;. </li><li> Use a ferramenta Polígono para marcar a região de interesse na janela de imagem. Seleccionar &quot;Linhas de orientação&quot; para obter a orientação da microfibrilas de celulose. Nota: Isto irá resultar na exibição dos ângulos (azimute) em graus. NOTA: O ângulo médio calculado por um dos dois métodos deve ser em seguida normalizada para o posicionamento da secção de raiz ao longo da corrediça. Para corrigir desvio dao posicionamento horizontal de toda a secção de raiz ao longo da corrediça, quantificar o ângulo médio de micro fibrilas da parede celular que flanqueia a célula ao longo do seu eixo longitudinal (isto é, perpendicular à secção e ao longo do eixo de crescimento da raiz, a Figura 2C). Este ângulo é de 180 ° quando a seção de raiz é posicionada com precisão ao longo do slide. Para calcular o ângulo de microfibrilas, subtrair o ângulo microfibrila média medida da parede celular de flanco de 180 °. Adicionar a diferença resultou ao ângulo de microfibrilas médio medido da parede da célula que se encontra plana sobre a lâmina. </li></ol></li></ol> 10. Análise de Polscope Celulose cristalina Acumulação <ol><li> Use as seções transversais (transversais). Note que a acumulação de celulose cristalina só pode ser comparada entre as células quando as microfibrilas de celulose, são alinhados em um ângulo semelhante (tal como determinado em 9). </li><li> Dê um duplo clique sobre a imagem relevante na pilha de imagens. Selecione &quot;Pseudo cor &quot;no guia&quot; Configurações de vídeo &quot;. </li><li> Para medir retardance. Zoom-in na imagem. Selecione &quot;Região&quot; e marque todas as regiões de interesse. Mover para a guia &quot;medidas&quot; e &quot;Copiar para área de transferência&quot; todos os valores. <ol><li> Transferir os dados para o Excel e extrair informações necessárias (região de retardance dizer). Normalizar os dados. NOTA: Para explicar as diferenças de espessura entre fatias, expressar os valores relativos a uma borda da parede celular específico no slide. Para normalizar, dividir o retardância à média correspondente à parede da célula de interesse pela retardância média de uma parede celular diferente na mesma imagem. Por exemplo, a parede exterior da célula epidérmica foi normalizada para o interior da parede celular cortical no nosso estudo. </li></ol></li><li> Repita as medições durante pelo menos 3 secções por raiz, com um mínimo de 3 raízes por amostra. </li></ol>

<ol>
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The authors have no conflicts of interest.

Aqui, apresentamos um método para determinação do acúmulo de celulose cristalina em diferentes tecidos que compõem as raízes de Arabidopsis, mantendo informações anatômicas. Como tal, ela fornece uma etapa adicional para a compreensão de processos de crescimento em plantas com uma resolução celular. Este método pode também ser aplicado para o estudo de espécies de plantas adicionais e órgãos. Um número de pontos devem ser considerados quando se aplica o método. Em primeiro lugar, a acumulação de celulose cristalina em uma dada secção da raiz pode ser comparada entre os tecidos, entre secções de diferentes genótipos e entre os tratamentos, se a orientação dos seus microfibrilas de celulose é semelhante. Orientação microfibrilas de celulose é determinada em secção longitudinal, com uma face de parede da célula 18. Assim, a série de secções longitudinais, que abrange os tecidos distintos das raízes, a partir do exterior para o interior a maioria dos mais, permitir analysé a orientação de microfibrilas de celulose em diferentes tecidos, num determinado estádio de desenvolvimento. No exemplo mostrado aqui, as células meristemáticas da epiderme têm uma ampla gama de orientações microfibrilas de celulose com um ângulo médio de microfibrilas de celulose de 140 °, enquanto que as células alongamento da epiderme têm uma estrutura mais organizada, com um ângulo médio de microfibrilas de celulose de 120 °. Estas medidas foram semelhantes entre o tipo selvagem e o mutante de interesse, permitindo assim uma comparação confiante em sua acumulação celulose cristalina relativa, nos tipos de células correspondentes e zona de desenvolvimento. Em segundo lugar, a variabilidade na largura das diferentes secções podem ter impacto nos níveis de retardamento de luz medidos. Isto é contornada aqui por normalizar as medições retardância em bruto do tecido de interesse (células epidérmicas) para a medição retardância de um tecido diferente (células do córtex). Os valores normalizados are, em seguida, em comparação (Ver Figura 2E-G). Finalmente, as secções transversais ao longo da raiz, a captura de diferentes zonas de desenvolvimento. A identificação destas zonas da secção transversal é importante para a interpretação dos dados. Perda da camada de células mais exterior lateral do tampão de raiz na secção compreender um marcador fuso simples. Em geral, as células começam a sua rápida expansão quando a célula mais antiga da tampa de raízes laterais sofre morte celular programada, após o qual, a epiderme desprotegidos torna-se o tecido exterior 19. Actualmente, os métodos que proporcionam uma medida de resolução celular de a razão entre o cristalino contra os domínios celulose amorfa faltam. Na verdade, esta é também uma limitação do método aqui apresentado. No entanto, a sua capacidade de comunicar a acumulação de celulose cristalina, por si só é um avanço significativo, níveis relativos tão elevadas de celulose cristalina torna provável uma maisparede celular robusto com o aumento da resistência à tracção. Desenvolvimento de ferramentas de alta resolução para determinar com precisão a composição da parede celular ao lado de suas propriedades mecânicas permanece um desafio futuro.

A parede de célula de planta é uma estrutura dinâmica. células em crescimento são cercadas por uma parede celular primária, cuja organização permite que as células a se expandir. As células que param de crescer depósito de uma parede secundário mais rígido que reforça o suporte mecânico da planta. Ambas as paredes celulares são compostas de microfibrilas de celulose embebidas numa matriz de polissacáridos de estruturas diferentes (por exemplo, hemicelulose e pectina) que variam entre o estágio de desenvolvimento diferentes e tecidos 1,2. A celulose é sintetizada na forma de cadeias de (1,4) -β-D-glucano que são fortemente alinhados para formar a micro fibrilas de uma estrutura cristalina. celulose amorfa refere-se às regiões onde as cadeias de glucano são menos ordenada. A relação entre o cristalino e os domínios amorfos é um parâmetro pensado para afectar as propriedades mecânicas da parede da célula, fornecendo resistência mecânica e característica viscoelástica, respectivamente 3. Vários métodos têm sidodesenvolvidas para detectar e quantificar as duas formas de arranjo de celulose, entre eles de difracção de raios-X e polarização cruzada / ângulo mágico girando RMN de estado sólido 4. Difracção de raios-X pode ser utilizada para determinar a proporção de cristalino contra domínios celulose amorfa na amostra 5. Um método alternativo usa fraccionamento de parede celular conteúdo em material insolúvel em ácido e solúvel em ácido, para distinguir entre a cristalina e a celulose amorfa, ou outros polímeros, respectivamente. Nesta abordagem, a incorporação de glicose marcada ([14 C] glucose) é utilizada para quantificar a 6,7 de celulose. Estes métodos necessitam de grandes volumes de material de planta para análises de órgãos inteiros, na melhor das hipóteses, e, portanto, são inadequadamente sensível à variação específica do tecido na estrutura da parede celular. A visualização das microfibrilas de celulose com uma resolução celular pode ser obtida em estudos de imagem ao vivo combinados com corantes fluorescentes 8,9, que podem identificar mudanças naa orientação das microfibrilas de celulose. No entanto, estes corantes não são utilizados para quantificação, eles não são específicos de celulose cristalina e pode interferir com a estrutura normal da parede celular 8. Polscope é uma técnica de imagiologia que se baseia na capacidade de celulose cristalina para dividir os feixes de luz e retardar a parte da luz 10. retardo de luz é mais forte para as microfibrilas que se situam perpendicularmente à direcção da propagação da luz. Para microfibrilas com orientação semelhante, quanto maior o grau de cristalinidade, quanto maior for o retardamento de luz 11. Assim, polscope é utilizado para estudar ambos os níveis relativos e orientação das microfibrilas de celulose. Raízes exibem crescimento linear, durante o qual as células originárias no nicho de células-tronco, na ponta da raiz, são submetidos a uma série de divisões celulares, antes de se expandir rapidamente 12. As células compreendendo a raiz expandir numa unidireccional (anisotrópica)forma, como ditado por pequenos hormônios molécula de sinalização que impactam as propriedades da parede celular 13. Respostas diferenciadas aos hormônios, no tempo e no espaço, fornecer um meio de garantir o crescimento de órgãos equilibrada 14. Assim, a análise de alta resolução da estrutura da parede celular podem fornecer informações importantes necessários para melhor compreender a relação entre as respostas específicas do tipo de células para crescimento de órgão inteiro. Aqui, nós relatamos a implementação de polscope para estudar a acumulação específica de tecido de celulose cristalina em raízes de Arabidopsis, como observado em seções anatômicas alta qualidade. Este método recentemente descoberto de acumulação específico do tipo de célula de celulose cristalina, em resposta à perturbação espacial da actividade hormonal 15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>LOBA CHEMIE&#160;</td>
			<td>6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter&#160;</td>
			<td>MILLEX-GV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica kit historesin&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7022 18 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding molds</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>film 100&#181; P.P.C.&#160;</td>
			<td>www.Jolybar.com</td>
			<td></td>
			<td>overhead film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knivemaker</td>
			<td>LKB</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratome III</td>
			<td>LKB</td>
			<td>8800</td>
			<td>Ultratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon immumount&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>9990402</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrio imaging system</td>
			<td>CRI</td>
			<td>Abrio imaging system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrio V2.2 software</td>
			<td>CRI</td>
			<td>Abrio V2.2 software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open access polarized light image analysis software &#160;</td>
			<td>OPS</td>
			<td>OpenPolScope</td>
			<td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td>
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high resolution quantification of crystalline cellulose accumulation in arabidopsis roots to monitor tissue-specific cell wall modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

Nós estudamos os efeitos de respostas específicas do tipo de células para brassinosteróides (BRS), usando a raiz de Arabidopsis como um modelo de órgão 15-17. Quando o receptor de BRI1 BR é orientada, no fundo do mutante BRI1, para um subconjunto de células epidérmicas, chamadas de células não-capilares (Figura 2A, B), que inibe a expansão das células unidireccional de células vizinhas, e todo o crescimento da raiz 15. Polscope análise foi realizada para revelar o mecanismo subjacente a esta inibição. Secções longitudinais da raiz obtido a partir do tipo selvagem e a partir de linhas que expressam BRI1 em células não-cabelo só, mostrou orientação semelhante das microfibrilas de celulose (Figura 2C, D, e tal como explicado em 9.2.3), permitindo uma comparação da acumulação relativa do cristalino celulose em células meristemáticas e alongamento, utilizando-se secções transversais tomadas a partir destas zonas (Figura 2E, F). Esta análise mostrou uma dependiamião entre BRI1 expressão em células não cabelo e a acumulação local de celulose cristalina. Segue-se experiências mostraram que a inibição da sintase de celulose leve por baixas concentrações de isoxabena reduzido o nível de celulose cristalina nestas células, o que, por sua vez, parcialmente restauradas de inibição de crescimento, através da promoção da expansão de células unidireccional e o comprimento da raiz 15. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53707/53707fig1.jpg" /> Figura 1:. Microscopia de Luz Polarizada Sistema O sistema Polscope consiste de um microscópio de luz (A), equipado com uma câmara CCD digital de (B), um analisador e um cristal líquido verde localizado na parte superior da sua fonte de luz (C) (D). software abriu foi usado para a aquisição e análise de imagem. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53707/53707fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui t</a>o visualizar uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53707/53707fig2.jpg" /> Figura 2: Análise Polscope da parede celular Composição. (A) Secção transversal da raiz primária Arabidopsis mostrando organização radial de seus tecidos constituintes. Destes, as células não-cabelo epidérmico (N); células ciliadas (H) e no córtex (C) estão marcadas. Bar, a 10 ^ m. (B) As imagens de microscopia confocal de raízes que expressam GFP BRI1-direcionados para células não cabelo. Branco, coloração de PI que marca a células, verde, expressão BRI1-GFP. Bar, de 20 um. (C) Secções longitudinais de raízes obtidas a partir de tipo selvagem e de plantas que expressam BRI1 em células não cabelo. O ângulo de microfibrilas de celulose (isto é, o ângulo entre o eixo de cor e de comprimento de célula, o que reflecte o eixo longo da raiz) é semelhante entre as duas linhas. A parede celular de flanqueamento da célula ao longo do seu leixo ong é cercada; marca de ângulo representam a parede celular à sombra, que é medido. Bar, a 50 ^ m. (D) Quantificação do ângulo de microfibrilas de celulose na parede celular da epiderme. Note-se a elevada variabilidade dos ângulos presentes em células do meristema apical (isto é, zona de meristemático, MZ) em comparação com células da zona de transição (ZT), tal como reflectido pela caixa de bigodes. O ângulo de microfibrilas de celulose média semelhante entre o tipo selvagem e plantas expressando BRI1 em células não-cabelo permite a comparação de acumulação de celulose cristalina em células de sua zona de desenvolvimento correspondente. O ângulo médio de cada uma das amostras é indicado por uma linha vermelha. Secções (EF) transversal na raiz dos mesmos antecedentes da planta, mostrado no modo de retardamento de luz. escala de cores representa retardance luz dos 0-17 nm. Seções correspondentes ao meristema (E) e alongamento zonas (F) são mostrados. Bar, a 50 uM. A parede celular da epiderme externa e internaparede celular cortical são cercados. (G) A quantificação dos valores retardância, calculada a partir das imagens polscope. Os valores são expressos como a razão de retardamento entre a parede celular da epiderme externa e a parede celular cortical interior. Note-se que a elevada deposição de celulose cristalina em células não-cabelo em linhas que expressam BRI1 apenas nestas células. A média + SE; 40 &lt;n &lt;600; (**) P &lt;0,01; (***) P &lt;0,001 em um teste t de duas caudas. A figura foi adotada e modificada a partir de 15. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53707/53707fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

8.1K visualizações.  Technion-Israel Institute of Technology. Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Vídeo: High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Culturas de células neuronais de Aplysia para imagens de alta resolução de Cones de Crescimento

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Biologia

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Usando scanners de mesa para coletar imagens de alta resolução tempo decorrido da Arabidopsis Root gravitrópico Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Coloração histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celular Secundária parede Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Uma resolução alta Método de Monitoramento de Ativação fosforilação dependente de IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...